Athemis/Bachelorarbeit
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doi = {10.1038/nprot.2006.202},
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@book{mortimer_chemie_2007,
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\subject{Biochemie der Pflanzen\\Abteilung für biochemische Pflanzenphysiologie}
\title{Bachelorarbeit}
\subtitle{Molekulare Charakterisierung von \acs{RTE1} aus \acl{A. thaliana}}
\author{Alexander Ralph Michael Minges}
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Institut für Biochemie der Pflanzen\\ Abteilung für biochemische Pflanzenphysiologie
\vfill
\Huge
\textsf{\textbf{Bachelorarbeit}}
\normalsize
\textsf{\textbf{Molekulare Charakterisierung von \acs{RTE1} aus \acl{A. thaliana}}}
\vfill
Zur Erlangung des Bachelorgrades\\ (Bachelor of Science - Biochemistry)
\vfill
vorgelegt von \\ \textbf{Alexander Ralph Michael Minges \\ (1804535)}
\vfill
im September 2010
\vfill \begin{description}
\item[Erstprüfer:]{Univ. Prof. Dr. G. Groth\\ Institut für Biochemie der Pflanzen \\ Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf}
\item[Zweitprüfer:]{Univ. Prof. Dr. L. Schmitt\\ Institut für Biochemie \\ Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf}
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@ -718,5 +724,15 @@
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4
inc/abkuerzungen.tex
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@ -26,8 +26,8 @@
\acro{ERF1}{\textit{ETHYLENE RESPONSE FACTOR 1}}
\acro{ETR1}{\textit{ETHYLENE RESISTANT 1}}
% \acro{GR}{\textit{GREEN RIPE}}
\acro{HasAp}{\textit{HEME-BINDING PROTEIN A} aus \textit{Pseudomonas aeruginosa}}
\acro{HBP}{\textit{heme-dinding protein}}
\acro{HasAp}{\textit{HEME-BINDING PROTEIN A}}
\acro{HBP}{\textit{HEME-BINDING PROTEIN}}
\acro{HRP}{\textit{horseradish peroxidase}, Meerrettich-Peroxidase}
\acro{IDA}{Im\-in\-o\-di\-es\-sig\-säu\-re}
\acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}

8
inc/diskussion.tex
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@ -18,14 +18,14 @@ Andere Häm-bindende Proteine weisen K$_\text{d}$-Werte im mikromolaren bis ober
\begin{table}[ht]
\centering
\caption[K$_\text{d}$ verschiedener Häm-bindender Proteine im Vergleich zu \ac{RTE1}]{K$_\text{d}$ verschiedener Häm-bindender Proteine im Vergleich zu \ac{RTE1}. Für \ac{RTE1} ist der K$_\text{d}$ aus der Fluoreszenzspektroskopie bzw. in Klammern aus dem photometrischen Bindungsassay angegeben.}
\caption[K$_\text{d}$ verschiedener Häm-bindender Proteine im Vergleich zu \ac{RTE1}]{K$_\text{d}$ verschiedener Häm-bindender Proteine im Vergleich zu \ac{RTE1}. Für \ac{RTE1} ist der K$_\text{d}$ aus der Fluoreszenzspektroskopie bzw. in Klammern aus dem photometrischen Bindungsassay angegeben. Bei denen zum Vergleich herangezogenen Proteinen handelt es sich um \acl{RFABG} (\acs{RFABG}), \acl{HBP} (\acs{HBP}) und \acl{HasAp} (\acs{HasAp})}
\begin{tabularx}{\textwidth}{Xcl}
\toprule
\textbf{Protein} & \textbf{K$_\text{d}$ [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Literatur}\\
\midrule
\ac{RFABG} & 0,38 & \citet{duncan_heme-binding_1999}\\
\ac{HBP} & 0,43 & \citet{vincent_protein_1985}\\
\ac{HasAp} & 35 & \citet{yukl_kinetic_2010}\\
\acs{RFABG} & 0,38 & \citet{duncan_heme-binding_1999}\\
\acs{HBP} & 0,43 & \citet{vincent_protein_1985}\\
\acs{HasAp} & 35 & \citet{yukl_kinetic_2010}\\
\midrule
\ac{RTE1} & \num[seperr]{4,90(23)} (\num[seperr]{7,24(223)}) & \\
\bottomrule

18
inc/einleitung.tex
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@ -7,7 +7,7 @@ Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanz
\begin{figure}[htbp!]
\centering
\includegraphics[keepaspectratio=true, width=0.7\textwidth]{./img/einleitung/yang_zyklus.png}
\includegraphics[keepaspectratio=true, width=\textwidth]{./img/einleitung/yang_zyklus.png}
% yang_zyklus.png: 1999x1682 pixel, 300dpi, 16.92x14.24 cm, bb=0 0 480 404
\caption[Ethylensynthese und Yang-Zyklus]{Ethylensynthese ausgehend von Methionin und Regeneration von Methionin im Yang-Zyklus \citep{taiz_plant_2007}}
\label{fig:yang_zyklus}
@ -15,13 +15,13 @@ Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanz
\clearpage
\section{Ethylensignalweg}
Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Hierdurch wird die nachgeschaltete \acs{MAP}-Kinase-Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).
Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können \citep{resnick_involvement_2008}. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Durch die Bindung von Ethylen wird die nachgeschaltete \acs{MAP}-Kinase-Kinase-Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).
In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4) welche mit prokaryotischen Zwei-Komponenten-Histidinkinasen verwandt sind \citep{voet-van-vormizeele_mutants_2008}. Diese Rezeptoren zeigen eine funktionelle Redundanz und sind negative Regulatoren der Ethylenantwort \citep{resnick_involvement_2008}.
\begin{figure}[htbp!]
\centering
\includegraphics[keepaspectratio=true, scale=0.7]{./img/einleitung/ethylen_signalweg.png}
\includegraphics[keepaspectratio=true, width=\textwidth]{./img/einleitung/ethylen_signalweg.png}
% ethylen_signalweg.png: 661x836 pixel, 129dpi, 13.01x16.46 cm, bb=0 0 369 467
\caption[Ethylen-Signalweg]{Schematische Darstellung des Ethylen-Signalweges \citep{kendrick_ethylene_2008}}
\label{fig:ethylen_signalweg}
@ -30,21 +30,23 @@ In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS
\section{\acs{RTE1} im Ethylensignalweg}
Bei \ac{RTE1} handelt es sich um ein Homodimer -- Molekulargewicht der Monomere: \SI{28}{\kilo\dalton}), welches kolokalisiert mit \ac{ETR1} in der Membran des Golgi-Apparates bzw. des \ac{ER} vorliegt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Entdeckt wurde es bei der Suche nach zusätzlichen Komponenten des Ethylensignalweges. Die Ethylen-insensitiven Mutante \textit{etr1-2} zeigt bei Anwesenheit von Ethylen und Wachstum im Dunkeln \textit{nicht} den üblichen Phänotyp der Dreifachantwort: Verdickung und Verkürzung des Hypokotyls, Hemmung des Wurzelwachstums und Krümmung des Apikalhakens. Bei \textit{etr1-2} beruht die Insensitivität gegenüber Ethylen im Gegensatz zu \textit{etr1-1} nicht auf dem Unvermögen den für die Ethylenbindung erforderlichen Kofaktor Kupfer zu binden, sondern auf der Blockade der Weiterleitung des Ethylensignals zur Signaldomäne des Rezeptors. Es wird vermutet, dass die auf die Ethylenbindung folgende Konformationsänderung verhindert wird \citep{resnick_involvement_2008}.
Bei \ac{RTE1} handelt es sich um ein Homodimer (MW Monomer: \SI{28}{\kilo\dalton}), welches kolokalisiert mit dem Ethylenrezeptor \ac{ETR1} in der Membran des Golgi-Apparates bzw. des \ac{ER} vorliegt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Entdeckt wurde es bei der Suche nach zusätzlichen Komponenten des Ethylensignalweges. Die Ethylen-insensitiven Mutante \textit{etr1-2} zeigt bei Anwesenheit von Ethylen und Wachstum im Dunkeln \textit{nicht} den üblichen Phänotyp der Dreifachantwort: Verdickung und Verkürzung des Hypokotyls, Hemmung des Wurzelwachstums und Krümmung des Apikalhakens. Bei \textit{etr1-2} beruht die Insensitivität gegenüber Ethylen im Gegensatz zu \textit{etr1-1} nicht auf dem Unvermögen den für die Ethylenbindung erforderlichen Kofaktor Kupfer zu binden, sondern auf der Blockade der Weiterleitung des Ethylensignals zur Signaldomäne des Rezeptors. Es wird vermutet, dass die auf die Ethylenbindung folgende Konformationsänderung verhindert wird \citep{resnick_involvement_2008}.
Durch Mutagenese wurden Individuen aus dieser \textit{etr1-2}-Population erzeugt, welche wieder die Dreifachantwort \textit{zeigten}. Durch Komplementierungsversuche wurden die Mutanten \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} als allelisch identifiziert. Da beide Mutanten eine Ethylenantwort ähnlich der des Wildtyps aufwiesen, konnte darauf geschlossen werden, dass ein funktionelles \ac{RTE1} für die Insensitivität der \textit{etr1-2}-Mutanten notwendig ist. Folglich muss \ac{RTE1} zu einem frühen Zeitpunkt innerhalb des Ethylensignalweges gemeinsam mit \ac{ETR1} wirksam sein. Ein weiteres Allel \textit{rte1-3} wurde nach Analyse der Gensequenz von \ac{RTE1} identifiziert. Alle \ac{RTE1}-Mutanten zeigten einen ähnlichen Phänotyp, woraus geschlossen wurde, dass \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} \textit{loss-of-function}-Allele darstellen. Bei \textit{rte1-3} handelt es sich vermutlich um eine Nullmutation \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
Durch Mutagenese wurden Keimlinge aus dieser \textit{etr1-2}-Population erzeugt, welche wieder die Dreifachantwort \textit{zeigten}. Durch Komplementierungsversuche wurden die Mutanten \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} als allelisch identifiziert. Da beide Mutanten eine Ethylenantwort ähnlich der des Wildtyps aufwiesen, konnte darauf geschlossen werden, dass ein funktionelles \ac{RTE1} für die Insensitivität der \textit{etr1-2}-Mutanten notwendig ist. Folglich muss \ac{RTE1} zu einem frühen Zeitpunkt innerhalb des Ethylensignalweges gemeinsam mit \ac{ETR1} wirksam sein. Ein weiteres Allel \textit{rte1-3} wurde nach Analyse der Gensequenz von \ac{RTE1} identifiziert. Alle \ac{RTE1}-Mutanten zeigten einen ähnlichen Phänotyp, woraus geschlossen wurde, dass \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} \textit{loss-of-function}-Allele darstellen. Bei \textit{rte1-3} handelt es sich vermutlich um eine Nullmutation \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
\textit{rte1-2} ist in der Lage, eine Reihe von Mutationen in \ac{ETR1} zu unterdrücken -- beispielsweise \textit{etr1-2} -- allerdings nur bei Mutationen, welche die eigentliche Ethylenbindung nicht oder zumindest nicht vollständig verhindern \citep{resnick_involvement_2008}.
Weitere Versuche zeigten, dass eine Überexpression von \ac{RTE1} im Wildtyp zu einer verminderten Ethylensensitivität führt, was die Annahme stützte, dass es sich bei \ac{RTE1} um einen negativen Regulator der Ethylenantwort handelt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Ebenso konnte durch die Analyse des Phänotyps von Doppel- und Dreifachmutanten mit \textit{etr1-2}, \textit{rte1-2} und \textit{ran1-3} gezeigt werden, dass \ac{RTE1} unabhängig von \ac{RAN1} auf die Ethylensignalkaskade wirkt \citep{resnick_involvement_2008}. So ist die Funktion von \ac{ETR1} im Wildtyp sowohl von \ac{RTE1} als auch von \ac{RAN1} abhängig, in \textit{etr1-2} hingegen nur von \ac{RTE1}. Hiervon ausgehend wurde das nachfolgend dargestellte (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}) Modell zum Signalzustand von \ac{ETR1} vorgeschlagen \citep{resnick_involvement_2008}.
\ac{RTE1} reguliert die Ethylenantwort über eine Konformationsänderung der Ethylen"=Bindedomäne des Rezeptors ETR1 (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}). ETR1 geht hierbei von einer nicht-funktionellen Konformation mit Hilfe von RTE1 in eine funktionelle Konformation über, in welchem der Rezeptor sich in seinem "`an"'-Zustand befindet und die Ethylenantwort unterdrückt. In diesem Zustand kann nun auch Ethylen gebunden werden, wobei ETR1 in eine semi-stabile Konformation übergeht, welche ebenfalls den "`an"'-Zustand repräsentiert und schließlich durch eine Konformationsänderung in den "`aus"'-Zustand wechselt, wodurch die Ethylensignalkaskade ausgelöst wird. Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand kann wiederum nur mit Hilfe von RTE1 erfolgen \citep{resnick_involvement_2008}.
Nach diesem Modell \ac{RTE1} reguliert die Ethylenantwort über eine Konformationsänderung der Ethylen"=Bindedomäne des Rezeptors ETR1 (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}). Hierfür wurden zwei unterschiedliche Möglichkeiten vorgeschlagen. Die erste besagt, dass ETR1 von einer nicht-funktionellen Konformation mit Hilfe von RTE1 in eine funktionelle Konformation übergeht, in welchem der Rezeptor sich in seinem "`an"'-Zustand befindet und die Ethylenantwort unterdrückt. In diesem Zustand kann nun auch Ethylen gebunden werden, wobei ETR1 in eine intermediäre Konformation übergeht, welche ebenfalls den "`an"'-Zustand repräsentiert und schließlich durch eine Konformationsänderung in den "`aus"'-Zustand wechselt. Die zweite Möglichkeit binhaltet, dass \ac{RTE1} am Übergang von \ac{ETR1} aus der inaktiven Form mit gebundenem Ethylen in den intermediären Zustand beteiligt ist. In beiden Möglichkeiten fördert \ac{RTE1} den inaktiven Zustand \citep{resnick_involvement_2008}.
\citet{resnick_involvement_2008} schlagen vor, dass \ac{RTE1} nach der ersten beschriebenen Möglichkeit wirkt und begründen dies mit der phänotypischen Ähnlichkeit von \textit{rte1 loss-of-function}-Mutationen mit der \textit{etr1}-Nullmutante. Der nicht-funktionelle Grundzustand von \ac{ETR1} entspräche dann phänotypisch der \textit{etr1}-Nullmutante.
\begin{figure}[htbp!]
\centering
\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/ETR1-Zustaende.pdf}
% ETR1-Zustaende.pdf: 870x309 pixel, 72dpi, 30.69x10.90 cm, bb=0 0 870 309
\caption[Modell des Signalzustandes von ETR1]{Modell des Signalzustandes von ETR1 \citep[eigene Abbildung nach][]{resnick_involvement_2008}; \ac{RTE1} bewirkt den Übergang von \ac{ETR1} von einer nicht-funktionellen (I) in eine funktionelle Konformation (II). Diese spiegelt den "`an"'-Zustand des Rezeptors wider. Wird Ethylen gebunden, geht der Rezeptor in eine semi-stabile Konformation (III) über, welche ebenfalls noch dem "`an"'-Zustand entspricht. Aus dieser Konformation wechselt \ac{ETR1} in den "`aus"'-Zustand (IV). Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand erfolgt wiederum mit Hilfe von \ac{RTE1}.}
\caption[Modell des Signalzustandes von ETR1]{Modell des Signalzustandes von ETR1 \citep[eigene Abbildung nach][]{resnick_involvement_2008}; Es wurden zwei mögliche Wirkungsweisen von \ac{RTE1} auf \ac{ETR1} vorgeschlagen: Nach der ersten Möglichkeit bewirkt \ac{RTE1} den Übergang von \ac{ETR1} von einer nicht-funktionellen (I) in eine funktionelle Konformation (II). Diese spiegelt den "`an"'-Zustand des Rezeptors wider. Wird Ethylen gebunden, geht der Rezeptor in einen intermediären Zustand (III) über, aus welchem er in den "`aus"'-Zustand (IV) wechselt. Die zweite Möglichkeit beinhaltet, dass \ac{RTE1} am Übergang vom "`aus"'-Zustand (IV) in den intermediären Zustand (III) beteiligt ist, aus welchem \ac{ETR1} dann in zurück in den "`an"'-Zustand (II) wechselt. In beiden Fällen fördert \ac{RTE1} den aktiven Zustand des Rezeptors.}
\label{fig:etr1_zustaende}
\end{figure}
@ -53,5 +55,5 @@ Homologe zu \ac{RTE1} wurden in einer Vielzahl weiterer Eukaryoten mit Ausnahme
Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies ohne Ethylenrezeptoren \citep{resnick_involvement_2008} lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Durch Sequenz-\textit{Alignments} konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cystein- und Histidinreste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-1} ist Cys$^\text{161}$ durch ein Tyrosin ersetzt. Darüberhinaus zeigen sequenzbasierte Vorhersagen, dass pflanzliche \ac{RTE1}-Homologe zwei bis vier Transmembrandomänen besitzen, eine nahe des N-Terminus sowie zwei bis drei am C-Terminus. In \textit{rte1-2} sind durch einen von einer \textit{missense}-Mutation hervorgerufenen \textit{Frameshift} die letzten 27 Aminosäurereste, welche sich in einer vorhergesagten Transmembrandomäne befinden, durch 15 inkorrekte Reste ersetzt worden, was vermutlich zu einer falschen Ausrichtung des Proteins in der Membran führt. Tierische Homologe zeigen in der Sequenzanalyse die ersten drei Transmembrandomänen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
\section{Zielsetzung}
In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Eigenschaften von \ac{RTE1} näher charakterisiert werden. Da für das humane Homolog von \ac{RTE1} eine Häminbindung bereits nachgewiesen werden konnte \citep{chang_2009}, sollte der Fokus dieser Arbeit auf dem Nachweis und wenn möglich auch Quantifizierung einer Häminbindung liegen.
In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Eigenschaften von \ac{RTE1} näher charakterisiert werden. Da für das humane Homolog von \ac{RTE1} eine Häminbindung bereits nachgewiesen werden konnte \citep{chang_2009}, sollte der Fokus dieser Arbeit auf dem Nachweis und wenn möglich auch der Quantifizierung einer Häminbindung von \ac{RTE1} liegen.

20
inc/ergebnisse.tex
View file

@ -3,7 +3,7 @@
\label{sec:ergebnis_native_reinigung}
Die native Reinigung nach dem angepassten Protokoll (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) zeigte vergleichbare Ergebnisse zum ursprünglichen Reinigungsprotokoll \citep{malach_expression_2009}, so dass auf Grund der einfacheren Verfahrensweise dieses auch im weiteren Verlauf der Arbeit angewandt wurde.
Sowohl Westernblot (Abbildung \ref{fig:blot_reinigung}), als auch SDS-PAGE (Abbildung \ref{fig:sds-page_reinigung}) zeigen einen großen Anteil nicht solubilisierten Proteins im Größenbereich um \SI{28}{\kilo\dalton}. Darüberhinaus zeigen sich Multimere unterschiedlicher Molekularität. Durchschnittlich ließen sich aus \SI{4}{\gram} Zellen etwa \SI{0,75}{\milli\gram} Protein reinigen.
Sowohl Westernblot (Abbildung \ref{fig:blot_reinigung}), als auch SDS-PAGE (Abbildung \ref{fig:sds-page_reinigung}) zeigen einen großen Anteil nicht solubilisierten Proteins im Größenbereich um \SI{28}{\kilo\dalton}, wobei es sich vermutlich um \textit{Inclusion-Bodies} handelt. Darüberhinaus zeigen sich Multimere unterschiedlicher Molekularität. Durchschnittlich ließen sich aus \SI{4}{\gram} Zellen etwa \SI{0,75}{\milli\gram} Protein reinigen.
\begin{figure}[htbp!]
\centering
@ -21,11 +21,12 @@ Sowohl Westernblot (Abbildung \ref{fig:blot_reinigung}), als auch SDS-PAGE (Abbi
\label{fig:blot_reinigung}
\end{figure}
\clearpage
\section{Denaturierende Reinigung}
\section{Denaturierende Reinigung von \acs{RTE1}}
\label{sec:ergebnis_denaturierende_reinigung}
In der Regel konnte unter nativen Bedingungen \ac{RTE1} in ausreichender Menge für die nachfolgenden Versuche präpariert werden. In einigen Fällen schlug die Solubilisierung von \ac{RTE1} allerdings fehl, so dass die Möglichkeit einer denaturierenden Reinigung in Hinblick auf zukünftige Experimente untersucht wurde.
Unter denaturierenden Bedingungen konnten weitaus größere Mengen \ac{RTE1} gereinigt werden, als mit der nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:ergebnis_native_reinigung}). Das SDS-Gel zeigt entsprechend kräftigere Banden in den Elutionsfraktionen (Abbildung \ref{fig:sds-page_denaturierende_reinigung}).
Unter denaturierenden Bedingungen lassen sich auch \textit{Inclusion-Bodies} solubilisieren, so dass eine größere Proteinausbeute zu erwarten ist. Das SDS-Gel zeigt entsprechend kräftigere Banden in den Elutionsfraktionen der denaturierenden Reinigung (Abbildung \ref{fig:sds-page_denaturierende_reinigung}) im Vergleich zu denen der nativen Reinigung (Abbildung \ref{fig:sds-page_reinigung}).
%Unter denaturierenden Bedingungen konnten weitaus größere Mengen \ac{RTE1} gereinigt werden, als mit der nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:ergebnis_native_reinigung}). Das SDS-Gel zeigt entsprechend kräftigere Banden in den Elutionsfraktionen (Abbildung \ref{fig:sds-page_denaturierende_reinigung}).
\begin{figure}[htbp!]
\centering
@ -37,7 +38,7 @@ Unter denaturierenden Bedingungen konnten weitaus größere Mengen \ac{RTE1} ger
\section{Häminagarose-Assay}
\label{sec:ergebnis_haeminagarose}
Die SDS-PAGE der Proben aus dem Häminagarose-Assay zeigt in der Elutionsfraktion eine Bande bei \SI{28}{\kilo\dalton}. Eine entsprechende Bande zeigt sich im aufgetragenen Proteinkonzentrat. Im Durchlauf ist nur ein sehr schwaches Signal zu erkennen, die Waschfraktionen weisen keine sichtbaren Banden auf (Abbildung \ref{fig:haeminagarose}).
Das gereinigte \ac{RTE1} wurde wie unter \ref{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet} beschrieben mit Häminagarose inkubiert. Gebundenes \ac{RTE1} wurde mittels Erhitzen in 2x SDS-Probenpuffer oder über die Zugabe von Hämin eluiert. Die \acs{SDS-PAGE} der Proben aus dem Häminagarose-Assay zeigt in der Elutionsfraktion eine Bande bei \SI{28}{\kilo\dalton}. Eine entsprechende Bande zeigt sich im aufgetragenen Proteinkonzentrat. Im Durchlauf ist nur ein sehr schwaches Signal zu erkennen, die Waschfraktionen weisen keine sichtbaren Banden auf (Abbildung \ref{fig:haeminagarose}).
Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elution eine Lösung von freiem Hämin (\SI{11}{\milli\Molar}) eingesetzt. Auch hier zeigte sich eine -- allerdings schwächere -- Bande in der Elutionsfraktion. Danach noch gebundenes Protein wurde wie zuvor mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen eluiert.
@ -60,7 +61,7 @@ Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elut
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\section{Photometrischer Bindungsassay}
\label{sec:ergebnis_photometrie}
Zur Analyse der Bindungseigenschaften von \ac{RTE1} an Hämin wurden drei Messreihen bei unterschiedlichen pH-Werten -- pH 6,5; pH 7,5; pH 8,5 -- durchgeführt. Hierfür wurden Aliquots der gereinigten Proteinlösung mit einem Volumen von jeweils \SI{2,5}{\milli\liter} wie in \ref{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie} beschrieben in die Waschpuffer pH 6,5, pH 7,5 und pH 8,5 umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden die Proteinlösungen dann auf eine Konzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} verdünnt und in die Messung eingesetzt. Die Obergrenze der eingesetzten Häminkonzentration von \SI{40}{\micro\Molar} ergab sich durch die Spezifikationen des verwendeten Photometers. Eine \SI{50}{\micro\Molar} Häminlösung weist bereits eine maximale Absorption von über 3 auf, der Obergrenze laut Herstellerangaben.
Zur Analyse der Bindungseigenschaften von Hämin an \ac{RTE1} wurden drei Messreihen bei unterschiedlichen pH-Werten -- pH 6,5; pH 7,5; pH 8,5 -- durchgeführt. Hierfür wurden Aliquots der gereinigten Proteinlösung mit einem Volumen von jeweils \SI{2,5}{\milli\liter} wie in \ref{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie} beschrieben in die Waschpuffer pH 6,5, pH 7,5 und pH 8,5 umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden die Proteinlösungen dann auf eine Konzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} verdünnt und in die Messung eingesetzt. Die Obergrenze der eingesetzten Häminkonzentration von \SI{40}{\micro\Molar} ergab sich durch die Spezifikationen des verwendeten Photometers. Eine \SI{50}{\micro\Molar} Häminlösung weist bereits eine maximale Absorption von über 3 auf, der Obergrenze laut Herstellerangaben.
\begin{figure}[htbp!]
%\centering
@ -74,6 +75,7 @@ Zur Analyse der Bindungseigenschaften von \ac{RTE1} an Hämin wurden drei Messre
Zur Bestimmung des K$_\text{d}$-Werts der Bindung wurde die Verschiebung der Absorptionsmaxima \textDelta A zueinander gegen die größte gemessene Verschiebung normiert und gegen die tatsächlich vorliegende Häminkonzentration c aufgetragen. Letztere wurde über den Absorptionskoeffizienten von Hämin aus den aufgenommenen Pufferspektren bestimmt. Anschließend wurde eine Sättigungsfunktion über eine nichtlineare Regression angepasst:
\begin{equation}
\label{eq:bindung}
\Delta A = \frac{a \cdot c}{K_d + c}
\end{equation}
@ -89,10 +91,10 @@ a sei hierbei die Kapazität. Die entsprechenden Auftragungen und Sättingungsfu
\end{figure}
\clearpage
\section{Fluoreszenzspektroskopie}
\section{Fluoreszenzspektroskopischer Nachweis der Häminbindung}
\label{sec:ergebnis_fluoreszenzspektroskopie}
Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei einem pH von 7,5 zeigte, wurde diese Bedingung auch für die Fluoreszenzspektroskopie gewählt. Nach Anregung bei einer Wellenlänge von \SI{280}{\nano\meter} und Abzug des Pufferspektrums ergaben sich die in Abbildung \ref{fig:fluoreszenz_spektrum} dargestellten Emissionsspektren. Es zeigte sich ein deutlicher Quench bei zunehmender Häminkonzentration, der seine volle Ausprägung bei einer Häminkonzentration von \SIrange{20}{40}{\micro\Molar} erreichte. Die Analyse der Daten ergibt einen K$_\text{d}$-Wert von \SI{4,9}{\micro\Molar}.
Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei einem pH von 7,5 zeigte, wurde diese Bedingung auch für die Fluoreszenzspektroskopie gewählt. Nach Anregung bei einer Wellenlänge von \SI{280}{\nano\meter} und Abzug des Pufferspektrums ergaben sich die in Abbildung \ref{fig:fluoreszenz_spektrum} dargestellten Emissionsspektren. Es zeigte sich ein deutlicher Quench bei zunehmender Häminkonzentration, der seine volle Ausprägung bei einer Häminkonzentration von \SIrange{20}{40}{\micro\Molar} erreichte. Die Analyse der Daten ergibt einen K$_\text{d}$-Wert von \SI{4,9}{\micro\Molar}. Hierfür wurde die relative Intensität des Fluoreszenzsignals bei \SI{353}{\nano\meter} im Vergleich zum Signal von \ac{RTE1} ohne Häminzugabe gegen die eingesetzte Häminjonzentration aufgetragen. Es wurde eine nichtlineare Regression durchgeführt (vgl. \ref{sec:ergebnis_photometrie}). Der K$_\text{d}$ konnte dann Gleichung \ref{eq:bindung} entnommen werden.
\begin{figure}[htbp!]
\centering
@ -106,7 +108,7 @@ Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei
\centering
\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/fluoreszenz_assay/binding_inset.pdf}
% spektrum.pdf: 428x377 pixel, 72dpi, 15.10x13.30 cm, bb=0 0 428 377
\caption[Häminbindung im Fluoreszenz-Assay]{Häminbindung im Fluoreszenz-Assay; Aufgetragen sind die relative Intensität des Fluoreszenzsignals gegen die Häminkonzentration. Letztere wurde aus einer Absorptionsmessung mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten ermittelt. Das Inset zeigt eine halblogarithmische Auftragung der Daten. In beiden Auftragungen zeigt sich das Erreichen der Sättigung.}
\caption[Häminbindung im Fluoreszenz-Assay]{Häminbindung im Fluoreszenz-Assay; Aufgetragen sind die relative Intensität des Fluoreszenzsignals gegen die Häminkonzentration. Letztere wurde aus einer Absorptionsmessung mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten ermittelt. F$_\text{0}$ ist die Intensität des Fluoreszenzsignals von \ac{RTE1} bei einer Wellenlänge von \SI{353}{\nano\meter} ohne Häminzugabe, F$_\text{0}$ die entsprechende Intensität bei Zugabe von Hämin. Das Inset zeigt eine halblogarithmische Auftragung der Daten. In beiden Auftragungen zeigt sich das Erreichen der Sättigung.}
\label{fig:fluoreszenz_bindung}
\end{figure}
\clearpage
@ -119,7 +121,7 @@ Die Daten der \ac{CD}-Spektren von \ac{RTE1} mit und ohne Hämin stammen aus unt
\centering
\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd_spektroskopie/spektrum.pdf}
% spektrum.pdf: 548x427 pixel, 72dpi, 19.33x15.06 cm, bb=0 0 548 427
\caption[\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}]{\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}; Die Daten stammen von unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1}. \ac{RTE1} wurde in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16${^\text{\textregistered}}$ gelöst. Die Proteinkonzentration betrug \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von \SI{0,5}{\nano\meter} (\ac{RTE1} + Hämin) bzw. \SI{1}{\nano\meter} (\ac{RTE1}) und \SI{20}{\nano\meter\per\minute} aufgenommen. Es wurden jeweils 15 Spektren akkumuliert. Deutlich ist in beiden Fällen ein negativer Cotton-Effekt bei etwa \SI{207}{\nano\meter} zu erkennen, welcher charakteristisch für \textalpha-helikale Strukturanteile ist. Der \textalpha-helikale Anteil ist bei Häminzugabe deutlich erhöht. }
\caption[\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}]{\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}; Die Daten stammen von unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1}. \ac{RTE1} wurde in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16 gelöst. Die Proteinkonzentration betrug \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von \SI{0,5}{\nano\meter} (\ac{RTE1} + Hämin) bzw. \SI{1}{\nano\meter} (\ac{RTE1}) und \SI{20}{\nano\meter\per\minute} aufgenommen. Es wurden jeweils 15 Spektren akkumuliert. Deutlich ist in beiden Fällen ein negativer Cotton-Effekt bei etwa \SI{207}{\nano\meter} zu erkennen, welcher charakteristisch für \textalpha-helikale Strukturanteile ist. Der \textalpha-helikale Anteil ist bei Häminzugabe deutlich erhöht. }
\label{fig:cd_spektrum}
\end{figure}

40
inc/material.tex
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@ -245,15 +245,15 @@
\item[Laufpuffer, 10x] \hfill \\
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}\\
\SI{1,92}{\Molar} Glycin\\
\SI{0,5}{\percent} \acs{SDS}
\SI{0,5}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
\item[Sammelgelpuffer, 5x, pH 6,7] \hfill \\
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
\SI{0,5}{\percent} \acs{SDS}
\SI{0,5}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
\item[Stopplösung] \hfill \\
\SI{2,3}{\Molar} Zitronensäure
\item[Trenngelpuffer, 2,5x, pH 8,9] \hfill \\
\SI{1,875}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
\SI{0,25}{\percent} \acs{SDS}
\SI{0,25}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
\item[Probenpuffer, 4x] \hfill \\
\SI{30}{\milli\Molar} Borsäure\\
\SI{30}{\milli\Molar} \acs{Tris}\\
@ -316,7 +316,7 @@
\section{Methoden}
\label{sec:methoden}
Die Expression und Reinigung von \ac{RTE1} wurde bereits am Institut im Rahmen einer Diplomarbeit \citep{malach_expression_2009} etabliert. In der vorliegenden Arbeit wurden aber am Reinigungsprotokoll (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) Optimierungen vorgenommen.
Die Expression und Reinigung von \ac{RTE1} wurde bereits am Institut im Rahmen einer Diplomarbeit \citep{malach_expression_2009} etabliert. In der vorliegenden Arbeit wurde das Reinigungsprotokoll (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) hinsichtlich des Durchführungsaufwands, insbesondere in Hinblick auf die Anzahl der Arbeitsschritte, optimiert.
\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
\label{sec:transformation}
@ -326,13 +326,13 @@ Als Selektionsmarker vermittelt pET-15b eine Ampicillinresistenz. Das Konstrukt
\begin{figure}[htbp!]
\centering
\includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.8\textwidth]{./img/einleitung/vektor.png}
\includegraphics[keepaspectratio=true,width=\textwidth]{./img/einleitung/vektor.png}
% vektor.png: 1059x800 pixel, 72dpi, 37.36x28.22 cm, bb=0 0 1059 800
\caption[Vektorkarte von pET-15b-RTE1]{Vektorkarte von pET-15b-RTE1. RTE1 ist rosa markiert und befindet sich zwischen Position 5377 und 6142. Die Vektorkarte wurde mit PlasMapper \citep{dong_plasmapper:_2004} erstellt.}
\label{fig:vektor}
\end{figure}
Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation: \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetente Zellen werden auf Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-Lösung versetzt. Anschließend werden die Zellen wurden für \SI{10}{\minute} auf Eis inkubiert. Es erfolgt ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} für \SI{90}{\second}. Die Zellen für \SI{2}{\minute} auf Eis und nach Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} 2YT-Medium für \SI{1}{\hour} unter leichtem Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation: \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetente Zellen werden auf Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-Lösung versetzt. Anschließend wurden die Zellen für \SI{10}{\minute} auf Eis inkubiert. Es erfolgt ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} für \SI{90}{\second}. Die Zellen wurden danach für \SI{2}{\minute} auf Eis und nach Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} 2YT-Medium für \SI{1}{\hour} unter leichtem Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
Der Ansatz wurde dann auf 2YT-Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
@ -341,12 +341,12 @@ Kompetente Zellen wurden wie in \ref{sec:transformation} beschrieben transformie
Die Hauptkulturen mit einem Volumen von \SI{500}{\milli\liter} 2YT-Medium in schikanierten \SI{1}{\liter}-Kolben wurden mit \SI{500}{\micro\liter} Ampicillin-Lösung versetzt und mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert. Die Induktion erfolgte bei einer OD$_{\text{600}}$ von 0,6 bis 0,8 mit \SI{0,3}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von \SI{35}{\celsius} und nach der Induktion bei \SI{30}{\celsius}. \SI{4}{\hour} nach der Induktion wurden die Zellen bei \SI{7000}{\g} für \SI{10}{\minute} bei \SI{4}{\celsius} abzentrifugiert.
Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von \SI{35}{\celsius} und nach der Induktion bei \SI{30}{\celsius}. Vier Stunden nach der Induktion wurden die Zellen bei \SI{7000}{\g} für \SI{10}{\minute} bei \SI{4}{\celsius} abzentrifugiert.
\label{sec:expression}
\subsection{Zellaufschluss}
\label{sec:zellaufschluss}
\SI{4}{\gram} eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch dreifache Hochdruckdispersion in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten French-Press$^\text{\textregistered}$ bei einem Druck von \SIrange{1200}{1500}{\psi}.
Vier Gramm eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch dreifache Hochdruckdispersion in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten French-Press$^\text{\textregistered}$ bei einem Druck von \SIrange{1200}{1500}{\psi}.
%\subsection{Differentielle Zentrifugation}
%\label{sec:differentielle_zentrifugation}
@ -355,8 +355,8 @@ Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von
\label{sec:native_reinigung}
Mit einem Poly-Histidin-Tag markierte Proteine lassen sich über eine Metallchelat"=Affinitätschromatographie aus einem Proteingemisch isolieren. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Säulenmaterial handelt es sich um \ac{IDA}, welche an Agarose immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \ac{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion der Poly-Histidin-markierten Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen.
Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 versetzt.
Das ursprüngliche Reinigungsprotokoll \citep[vgl.][]{malach_expression_2009} sah eine Solubilisierung über einen Zeitraum von \SI{10}{\minute} bei Raumtemperatur im Ultraschallbad vor. Hierfür musste das Lysat auf mehrere \SI{1,5}{\milli\liter}-Reaktionsgefäße aufgeteilt werden. Um die Anzahl der Arbeitsschritte zu verringern und die Kühlkette nicht bei der Solubilisierung abbrechen zu lassen, erfolgte die diese im Rahmen dieser Arbeit über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16 versetzt.
Das ursprüngliche Reinigungsprotokoll \citep[vgl.][]{malach_expression_2009} sah eine Solubilisierung über einen Zeitraum von \SI{10}{\minute} bei Raumtemperatur im Ultraschallbad vor. Hierfür musste das Lysat auf mehrere \SI{1,5}{\milli\liter}-Reaktionsgefäße aufgeteilt werden. Um die Anzahl der Arbeitsschritte zu verringern und die Kühlkette nicht bei der Solubilisierung abbrechen zu lassen, erfolgte diese im Rahmen der vorliegenden Arbeit über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Schritten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
@ -366,7 +366,7 @@ Das Säulenmaterial wurde gemäß den Herstellerangaben vor der Wiederverwendung
\subsection{Denaturierende Reinigung}
\label{sec:denaturierende_reinigung}
Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt {Fos"=Cholin$^\text{\textregistered}$ 16} \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den Membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt {Fos"=Cholin 16} \linebreak \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den Membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
Wasch- und Elutionspuffer enthielten ebenfalls \SI{8}{\Molar} Harnstoff.
\subsection{\acs{SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese}
@ -430,7 +430,7 @@ Anschließend wurde das Gel mit Entwicklerlösung überschichtet und bis zur gen
\subsection{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen}
\label{sec:westernblot}
Über einen Westernblot können Proteine aus einem SDS-Gel elektrophoretisch auf einen Membran übertragen und dort fixiert werden. Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteinen auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.
Über einen Westernblot können Proteine aus einem SDS-Gel elektrophoretisch auf einen Membran übertragen und dort fixiert werden. Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteine auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.
Bei Gelen, welche für einen Westernblot vorgesehen waren, kam ein gefärbter Proteingrößenstandard zum Einsatz. Das Gel wurde für etwa \SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die benötigten Filterpapiere, sowie die Nitrozellulosemembran wurden ebenfalls kurz in Transferpuffer getränkt.
@ -438,11 +438,11 @@ Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolg
Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute} an.
Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-HRP-Antikörper im Verhältnis 1:10000 enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten wiederum zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper ließ sich über die gekoppelte \ac{HRP} mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. die \ac{HRP} oxidiert in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es zu einer Lichtemission kommt.
Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-HRP-Antikörper im Verhältnis 1:10000 enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten wiederum zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper ließ sich über die gekoppelte Meerrettich-Peroxidase (\acs{HRP}) mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. die \ac{HRP} oxidiert in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es zu einer Lichtemission kommt.
Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor (LAS 4000 mini, Fuji) eingesetzt.
\subsection{Proteinbestimmung über einen \acl{BCA}-Assay}
\subsection{Proteinbestimmung über \acl{BCA}-Assay}
\label{sec:proteinbestimmung}
Die Proteinkonzentration in einer Lösung kann über einen \acl{BCA}-Assay ermittelt werden \citep{smith_measurement_1985}. Cystein, Cystin, Tyrosin, Tryptophan und die Peptidbindung selbst sind in der Lage \ce{Cu^{2+}} zu \ce{Cu^+} zu reduzieren, mit welchen \ac{BCA} spezifisch einen farbigen Komplex mit einem Absorptionsmaximum bei \SI{562}{\nano\meter} bildet \citep{wiechelman_investigation_1988}. Die Absorption kann dann photometrisch gemessen und für die Berechnung der Proteinkonzentration verwendet werden.
@ -480,7 +480,7 @@ Es folgte eine Inkubation bei \SI{37}{\celsius} für \SI{30}{\minute} im Brutsch
\subsection{Nachweis der Häminbindung}
\label{sec:nachweis_haemin_bindung}
Bei Häminen handelt es sich um Komplexverbindungen der Häme, wobei das Eisenion in der Oxidationsstufe +III vorliegt. Als axialen Liganden weisen sie ein Chlorid-Ion auf. Das Hämin b des Häm b wird als Hämin bezeichnet \citep{fischer_haemin_1999}.
Bei Häminen handelt es sich um Komplexverbindungen der Häme, wobei das Eisenion in der Oxidationsstufe (+III) vorliegt. Als axialen Liganden weisen sie ein Chlorid-Ion auf. Das Hämin b des Häm b wird als Hämin bezeichnet \citep{fischer_haemin_1999}.
\begin{figure}[htbp]
\centering
@ -496,9 +496,9 @@ Für den Nachweis einer Häminbindung durch \ac{RTE1} kamen vier unterschiedlich
\label{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet}
Beim affinitätschromatographischen Nachweis wurde ein Säulenmaterial eingesetzt, bei welchem Hämin kovalent an Agarose als Trägermatrix gebunden ist. Häm-bindende Proteine können dann an das immobilisierte Hämin binden. Die Elution kann entweder über die Zugabe von freiem Hämin, welches mit dem immobilisierten Hämin um die Bindung mit den Proteinen konkurriert, oder denaturierend über die Zugabe von \acs{SDS} und gleichzeitigem Erhitzen des Säulenmaterials erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam ein Batch-Verfahren zum Einsatz, welches den Nachweis einer Bindung mit vergleichsweise wenig Säulenmaterial ermöglicht \citep{tsutsui_affinity_1982}.
\SI{50}{\micro\liter} Häminagarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert.
\SI{50}{\micro\liter} Häminagarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert.
Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11}{\milli\Molar} Häminlösung. %Als Negativkontrolle kam eine \ac{BSA}-Lösung in gleicher Konzentration wie die \ac{RTE1}-Probe zum Einsatz.
Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11}{\milli\Molar} Häminlösung. %Als Negativkontrolle kam eine \ac{BSA}-Lösung in gleicher Konzentration wie die \ac{RTE1}-Probe zum Einsatz.
\subsubsection{Photometrie}
\label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie}
@ -529,7 +529,7 @@ Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Häminzu
\subsubsection{Fluoreszenzspektroskopie}
\label{sec:nachweis_haemin_bindung_fluoreszenz}
Bei der Anregung eines Fluorophors mit Licht einer bestimmten Wellenlänge kommt es zu einer Stokes-verschobenen Lichtemission bei einer für das Fluorophor spezifischen Wellenlänge. Bei Zugabe eines Quenchers tritt eine Fluoreszenzauslöschung (Quench) auf. Hierfür können unterschiedliche Effekte verantwortlich sein, allen gemein ist aber, dass sie entweder den Übergang des Fluorophors von seinem Grund- in den angeregten Zustand verhindern, oder den angeregten Zustand strahlungslos zurück in den Grundzustand überführen. Beispielsweise kann dies über eine Stoßdeaktivierung -- eine Kollision zwischen Fluorophor und Quencher -- oder einen Resonanzenergietransfer vom Fluorophor auf den Quencher erfolgen \citep{atkins_physikalische_2006}. In der Proteinanalytik wird häufig Tryptophan angeregt, dessen Absorptionsmaximum bei \SI{280}{\nano\meter} liegt und ein Emissionsmaximum im Bereich zwischen \SIrange{300}{350}{\nano\meter} aufweist \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}.
Bei der Anregung eines Fluorophors mit Licht einer bestimmten Wellenlänge kommt es zu einer Stokes-verschobenen Lichtemission bei einer für das Fluorophor spezifischen Wellenlänge. Bei Zugabe eines Quenchers tritt eine Fluoreszenzauslöschung (Quench) auf. Hierfür können unterschiedliche Effekte verantwortlich sein, allen gemein ist aber, dass sie entweder den Übergang des Fluorophors von seinem Grund- in den angeregten Zustand verhindern, oder den angeregten Zustand strahlungslos zurück in den Grundzustand überführen. Beispielsweise kann dies über eine Stoßdeaktivierung -- eine Kollision zwischen Fluorophor und Quencher -- oder einen Resonanzenergietransfer vom Fluorophor auf den Quencher erfolgen\citep{lakowicz_principles_2006}. In der Proteinanalytik wird häufig Tryptophan angeregt, dessen Absorptionsmaximum bei \SI{280}{\nano\meter} liegt und ein Emissionsmaximum im Bereich zwischen \SIrange{300}{350}{\nano\meter} aufweist \citep{lakowicz_principles_2006}.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Tryptophane in \ac{RTE1} bei \SI{280}{\nano\meter} angeregt und das Emissionsspektrum zwischen \SIrange{300}{400}{\nano\meter} aufgenommen. Hierfür wurde zunächst \ac{RTE1} nach der Reinigung in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol über eine PD10-Säule umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden \SI{500}{\micro\liter} mit einer Proteinkonzentration von \SI{2,5}{\micro\Molar} in die Messung eingesetzt. Im Verlauf der Messung wurde Hämin bis zu einer Endkonzentration von \SI{60}{\micro\Molar} hinzutitriert. Es wurden drei Messreihen durchgeführt, wobei jedes aufgenommene Spektrum zehnfach akkumuliert wurde. Zusätzlich wurde ein Pufferspektrum mit entsprechender Häminkonzentration aufgenommen. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren.
@ -565,10 +565,10 @@ Wie beim photometrischen Bindungsnachweis erfolgte die Bestimmung der tatsächli
\subsubsection{\acs{CD}-Spektroskopie}
\label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$ auf, wobei letztlich ihre Differenz \textDelta\textepsilon~gemessen und als Elliptizität \texttheta~angegeben wird -- d sei die Schichtdicke und c die Konzentration \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}:
Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$ auf, wobei letztlich ihre Differenz \textDelta\textepsilon~gemessen und als Elliptizität \texttheta~angegeben wird -- d sei die Schichtdicke und c die Konzentration \citep{greenfield_using_2007}:
\begin{equation}
\theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
\end{equation}
Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von \SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n~\textrightarrow~\textpi$^*$ bzw. \textpi~\textrightarrow~\textpi$^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration von \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.
Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von \SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n~\textrightarrow~\textpi$^*$ bzw. \textpi~\textrightarrow~\textpi$^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{greenfield_using_2007}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration von \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.

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inc/zusammenfassung.tex
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\chapter{Zusammenfassung}
Ziel dieser Arbeit war es, eine Häminbindung von \ac{RTE1}, einem negativen Regulator der Ethylenantwort in \ac{A. thaliana} nachzuweisen und zu quantifizieren. Es konnten verschiedene Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung der Häminbindung etabliert werden.
Hierfür wurde der \ac{RTE1}-kodierende Genabschnitt in einen aus pET-15b abgeleiteten Vektor kloniert, in den \ac{E. coli} Stamm BL21-Gold (DE) transformiert und in diesem expremiert. Das rekombinant hergestellte \ac{RTE1} konnte dann über einen His-Tag affinitätschromatographisch gereinigt werden.
Hierfür wurde der \ac{RTE1}-kodierende Genabschnitt in einen aus pET-15b abgeleiteten Vektor kloniert, in den \ac{E. coli} Stamm BL21-Gold (DE) transformiert und in diesem exprimiert. Das rekombinant hergestellte \ac{RTE1} konnte dann über einen His-Tag affinitätschromatographisch gereinigt werden.
Zum Nachweis einer Häminbindung kam zunächst ein Häminagaroseassay zum Einsatz. Hämin ist hierbei an einer Agarosematrix immobilisiert und kann mit \ac{RTE1} in Lösung interagieren. Die Elution von gebundenem \ac{RTE1} erfolgte denaturierend oder unter Zugabe von freiem Hämin. In beiden Fällen ließ sich eine Bindung nachweisen.
Darüberhinaus wurden Messungen im UV-Vis-Spektrophotometer durchgeführt. \ac{RTE1} mit gebundenem Hämin zeigt hier einen Absorptionsanstieg im Soret-Band bei gleichzeitiger Blauverschiebung, wobei letztere für die Bestimmung eines K$_\text{d}$-Wertes herangezogen wurde. Im Fluoreszenzspektrometer führt die Zugabe von Hämin zu einem Quench der Tryptophanfluoreszenz, welcher ebenfalls zur K$_\text{d}$-Bestimmung ausgewertet wurde. Beide Methoden ergaben für pH 7,5 einen K$_\text{d}$ von \SI[seperr]{7,24(223)}{\micro\Molar} (UV-Vis) bzw. \SI[seperr]{4,90(23)}{\micro\Molar} (Fluoreszenz). Es zeigte sich auch, dass die Bindungsaffinität bei saurem pH deutlich geringer ist, als bei physiologischem oder leicht alkalischen pH.
Schließlich konnte mit einer \ac{CD}-Spektroskopie gezeigt werden, dass die Zugabe von Hämin eine Veränderung der Sekundärstruktur hin zu deutlich höherem \textalpha-helikalem Strukturanteil zur Folge hat.
Schließlich konnte mit Hilfe der \ac{CD}-Spektroskopie gezeigt werden, dass die Zugabe von Hämin eine Veränderung der Sekundärstruktur hin zu deutlich höherem \textalpha-helikalem Strukturanteil zur Folge hat.
Die etablierten Bindungsassays können in zukünftigen Versuchen Hinweise -- beispielsweise zur erfolgreichen Renaturierung von denaturierend gereinigtem \ac{RTE1} -- liefern.