Ergebnisse: Native Reinigung von RTE1

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+@article{li_slic_2007,
+	title = {{SLIC} Sub-cloning using T4 {DNA} polymerase treated inserts without {RecA}},
+	issn = {17502799},
+	url = {http://www.natureprotocols.com/2007/02/15/slic_subcloning_using_t4_dna_p.php},
+	doi = {10.1038/nprot.2007.90},
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+@article{duncan_heme-binding_1999,
+	title = {Heme-binding by Drosophila retinoid-and fatty acid-binding glycoprotein {(RFABG),} a member of the proapolipophorin gene family},
+	volume = {40},
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+@book{wedler_lehrbuch_2004,
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+	edition = {5., vollst. überarb. und aktualisierte Aufl.},
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+	author = {Gerd Wedler},
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+@article{fischer_haemin_1999,
+	title = {On haemin and the relationships between haemin and chlorophyll},
+	journal = {Nobel lectures in chemistry, 1922-1941},
+	author = {H. Fischer},
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+	title = {Progress in structure prediction of α-helical membrane proteins},
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+	url = {http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0959440X06001072},
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+	title = {Mutants, molecules and mechanisms - Decipering the ethylene signalling network},
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+@book{alberts_molekularbiologie_2003,
+	address = {Weinheim [etc.]},
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+@book{malach_expression_2009,
+	title = {Expression und Reinigung von {RTE1} aus Arabidopsis thaliana {[Diplomarbeit,} unveröffentlicht]},
+	publisher = {{Heinrich-Heine-Universität} Düsseldorf},
+	author = {Anuschka Malach},
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+@book{purves_biologie_2006,
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+@book{berg_biochemie_2007,
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+@article{miroux_over-production_1996,
+	title = {Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels},
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+@inproceedings{resnick_reversion--ethylene_2006,
+	title = {{REVERSION-TO-ETHYLENE} {SENSITIVITY1,} a conserved gene that regulates ethylene receptor function in Arabidopsis},
+	author = {J. S Resnick and C. K Wen and J. A Shockey and C. Chang},
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+@book{vollhardt_organische_2007,
+	address = {Weinheim},
+	edition = {4. Aufl., 1 korr. Nachdr.},
+	title = {Organische Chemie},
+	isbn = {9783527313808},
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+	author = {K Vollhardt and Neil E Schore and K Peter},
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+@book{brueckner_reaktionsmechanismen_2007,
+	address = {Berlin [u.a.]},
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+	title = {Reaktionsmechanismen : organische Reaktionen, Stereochemie, moderne Synthesemethoden},
+	isbn = {9783827415790},
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+	author = {Reinhard Brückner},
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+@book{jander_lehrbuch_2006,
+	address = {Stuttgart},
+	edition = {16., überarb. Aufl.},
+	title = {Lehrbuch der analytischen und präparativen anorganischen Chemie mit 67 Tabellen},
+	isbn = {9783777613888},
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+	author = {Gerhart Jander and Eberhard Schweda},
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+@article{laemmli_cleavage_1970,
+	title = {Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4},
+	volume = {227},
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+	keywords = {Paper, protocol},
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+@article{schaegger_tricinesds-page_2006,
+	title = {{Tricine–SDS-PAGE}},
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+@article{kendrick_ethylene_2008,
+	title = {Ethylene signaling: new levels of complexity and regulation},
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+@book{taiz_plant_2007,
+	address = {München; Heidelberg},
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+	title = {Plant physiology das Original mit Übersetzungshilfen},
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+@article{lawrence_staining_2009,
+	title = {Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid},
+	issn = {{1940-087X}},
+	url = {http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1350},
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+@article{dong_plasmapper:_2004,
+	title = {{PlasMapper:} a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps},
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+	issn = {0305-1048},
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+	doi = {10.1093/nar/gkh410},
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+@book{atkins_physikalische_2006,
+	address = {Weinheim},
+	edition = {4., vollst. überarb. Aufl.},
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+	author = {Peter W Atkins and Julio de Paula},
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+@article{resnick_involvement_2008,
+	title = {Involvement of {RTE1} in conformational changes promoting {ETR1} ethylene receptor signaling in Arabidopsis},
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+	journal = {The Plant journal: for cell and molecular biology},
+	author = {J. S Resnick and M. Rivarola and C. Chang},
+	year = {2008},
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+@article{vincent_protein_1985,
+	title = {A Protein of the Z Class of Liver Cytosolic Proteins in the Rat That Preferentially Binds Heme},
+	volume = {260},
+	url = {http://www.jbc.org/content/260/27/14521.full.pdf+html?sid=e76840b8-53e3-41f7-b398-8005fb22d700},
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+@article{smith_measurement_1985,
+	title = {Measurement of protein using bicinchoninic acid},
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+	author = {P Smith and R Krohn and G Hermanson and A Mallia and F Gartner and M Provenzano and E Fujimoto and N Goeke and B Olson and D Klenk},
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+@book{madigan_brock_2009,
+	address = {München [u.a.]},
+	edition = {11., aktual. Aufl., {[Nachdr.]}},
+	title = {Brock - Mikrobiologie},
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+@article{riener_quick_2002,
+	title = {Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4'-dithiodipyridine},
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+@article{tsutsui_affinity_1982,
+	title = {Affinity chromatography of heme-binding proteins: an improved method for the synthesis of hemin-agarose},
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+@article{riener_quick_2002-1,
+	title = {Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4\&\#x02032;-dithiodipyridine},
+	volume = {373},
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+@book{lottspeich_bioanalytik_2006,
+	address = {München {;;Heidelberg}},
+	edition = {2. Aufl.},
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+@book{mortimer_chemie_2007,
+	address = {Stuttgart},
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+	title = {Chemie das Basiswissen der Chemie},
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+	author = {Charles Mortimer},
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+@book{riedel_anorganische_2007,
+	address = {Berlin; New York},
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+@article{wiechelman_investigation_1988,
+	title = {Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: Identification of the groups responsible for color formation},
+	volume = {175},
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+	number = {1},
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+	author = {K Wiechelman},
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+@article{bleecker_ethylene:_2000,
+	title = {{ETHYLENE:} A Gaseous Signal Molecule in Plants},
+	volume = {16},
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+	number = {1},
+	journal = {Annual Review of Cell and Developmental Biology},
+	author = {A. B Bleecker and H. Kende},
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+	pages = {1–18}
+}
+
+@misc{chang_2009,
+        title = {[mündlich, unveröffentlicht]},
+        year  = {2009},
+        author = {C. Chang}}

TODO.txt

@@ -2,3 +2,4 @@
 - Abweichung (5 µM zu 25 µM) u.U. durch heteronege Proben und unterschiedliche Präps
 - Ausblick: denat. Reinigung, Bindungsassay etabliert
 - Verwendete Bakterienstämme
+- Weitere Untersuchung mit DTT: Reduktion mit DTT, Modifizierung mit NEM, Entfernung von DTT -> Photometrie und FS

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@@ -52,3 +52,6 @@ Homologe zu \ac{RTE1} wurden in einer Vielzahl weiterer Eukaryoten mit Ausnahme
 
 Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies ohne Ethylenrezeptoren \citep{resnick_involvement_2008} lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Durch Sequenz-Alignments konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cystein- und Histidinreste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-1} ist Cys$^\text{161}$ durch ein Tyrosin ersetzt. Darüberhinaus zeigen sequenzbasierte Vorhersagen, dass pflanzliche \ac{RTE1}-Homologe zwei bis vier Transmembrandomänen besitzen, eine nahe des N-Terminus sowie zwei bis drei am C-Terminus. In \textit{rte1-2} sind durch einen von einer \textit{missense}-Mutation hervorgerufenen \textit{frameshift} die letzten 27 Aminosäurereste, welche sich in einer vorhergesagten Transmembrandomäne befinden, durch 15 inkorrekte Reste ersetzt worden, was vermutlich zu einer falschen Ausrichtung des Proteins in der Membran führt. Tierische Homologe zeigen in der Sequenzanalyse die ersten drei Transmembrandomänen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
 
+\section{Zielsetzung}
+In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Eigenschaften von \ac{RTE1} näher charakterisiert werden. Da für das humane Homolog von \ac{RTE1} eine Hämin-Bindung bereits nachgewiesen werden konnte \citep{chang_2009}, sollte der Fokus dieser Arbeit auf dem Nachweis und wenn möglich auch Quantifizierung einer Hämin-Bindung liegen.
+

inc/ergebnisse.tex

@@ -1 +1,21 @@
 \chapter{Ergebnisse}
+\section{Native Reinigung von \ac{RTE1}}
+Die native Reinigung nach dem angepassten Protokoll (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) zeigte vergleichbare Ergebnisse zum ursprünglichen Reinigungsprotokoll \citep{malach_expression_2009}, so dass auf Grund der einfacheren Verfahrensweise dieses auch im weiteren Verlauf der Arbeit angewandt wurde.
+
+\begin{figure}[htbp!]
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+ \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/expression_reinigung/reinigung_26_07_10_beschriftet.pdf}
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+ \caption[SDS-PAGE der native Reinigung von RTE1]{SDS-PAGE der native Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Solubilisat (S), Überstand aus Ultrazentrifugation (ÜS), Pellet aus Ultrazentrifugation (P), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Zahlen unterhalb von E250 geben die Säulenvolumen an. Rot umrandet wurden die Banden des \ac{RTE1}-Monomers (\SI{28}{\kilo\dalton}), blau umrandet die eines mutmaßlichen \ac{RTE1}-Dimers (\SI{56}{\kilo\dalton}). Deutlich sind bei P große Mengen nicht solubilisierten Proteins (\SI{28}{\kilo\dalton}) zu erkennen.}
+ \label{fig:reinigung_neu}
+\end{figure}
+
+\begin{figure}[htbp!]
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/expression_reinigung/blot_17_08_10_beschriftet.pdf}
+ % blot_17_08_10_beschriftet.pdf: 980x407 pixel, 72dpi, 34.57x14.36 cm, bb=0 0 980 407
+ \caption[Westernblot der nativen Reinigung von \ac{RTE1}]{Westernblot der nativen Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Solubilisat (S), Überstand aus Ultrazentrifugation (ÜS), Pellet aus Ultrazentrifugation (P), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Zahlen unterhalb von E250 geben die Säulenvolumen an. Chemilumineszenzsignale sind rot hervorgehoben, Markerbanden grün. Gut zu erkennen sind die Signale in den Elutionsfraktionen, sowie dem Solubilisat und Pellet nach Ultrazentrifugation. In letzterem zeigt sich, dass große Mengen \ac{RTE1} nicht solubilisiert wurden. In S und P zeigen sich \ac{RTE1}-Multimere bzw. Aggregate.}
+ \label{fig:blot_reinigung}
+\end{figure}
+
+

inc/material.tex

@@ -161,6 +161,18 @@
  \end{tabularx}
 %\end{center}
 
+\subsection{Bakterienstämme}
+\label{sec:bakterienstämme}
+%\begin{center}
+ \begin{tabularx}{\textwidth}{l p{0.3\textwidth} X}
+  \toprule
+  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\
+  \midrule
+  BL21-Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & E. coli B F- dcm+ Hte ompT hsdS(rB- mB-) gal l (DE3) endA Tetr\\
+  \bottomrule
+ \end{tabularx}
+%\end{center}
+
 \subsection{Kulturmedien}
 \begin{description}
  \item[2YT] \hfill \\
@@ -339,10 +351,13 @@ Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von
 \label{sec:native_reinigung}
 Mit einem Poly-Histidin-Tag markierte Proteine lassen sich über eine Metallchelat"=Affinitätschromatographie aus einem Proteingemisch isolieren. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Säulenmaterial handelt es sich um \ac{IDA}, welche an Agarose immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \ac{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion der Poly-Histidin-markierten Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen.
 
-Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 versetzt. Die Solubilisierung erfolgte über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
+Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 versetzt.
+Das ursprüngliche Reinigungsprotokoll \citep[vgl.][]{malach_expression_2009} sah eine Solubilisierung über einen Zeitraum von \SI{10}{\minute} bei Raumtemperatur im Ultraschallbad vor. Hierfür musste das Lysat auf mehrere \SI{1,5}{\milli\liter}-Reaktionsgefäße aufgeteilt werden. Um die Anzahl der Arbeitsschritte zu verringern und die Kühlkette nicht bei der Solubilisierung abbrechen zu lassen, erfolgte die Solubilisierung im Rahmen dieser Arbeit über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
 
 Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Scrhitten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
 
+Auch für die eigentliche Reinigung wurde das ursprüngliche Protokoll vereinfacht. Es sah unter anderem die Verwendung von sechs Tropfsäulchen mit jeweils \SI{0,2}{\milli\liter} Säulenmaterial, sowie zwei weitere Waschschritte mit \SI{20}{\milli\Molar} bzw. \SI{50}{\milli\Molar} Imidazol \citep{malach_expression_2009} vor.
+
 Das Säulenmaterial wurde gemäß den Herstellerangaben vor der Wiederverwendung regeneriert und in \SI{20}{\percent} (v/v) Ethanol bei \SI{4}{\celsius} gelagert.
 
 \subsection{Denaturierende Reinigung}