diff --git a/bachelorarbeit.kilepr b/bachelorarbeit.kilepr index 78b8e23..1e05ef4 100644 --- a/bachelorarbeit.kilepr +++ b/bachelorarbeit.kilepr @@ -4,7 +4,7 @@ img_extIsRegExp=false img_extensions=.eps .jpg .jpeg .png .pdf .ps .fig .gif kileprversion=2 kileversion=2.0.85 -lastDocument=bachelorarbeit.tex +lastDocument=inc/ergebnisse.tex masterDocument= name=Bachelorarbeit pkg_extIsRegExp=false @@ -94,10 +94,10 @@ order=-1 [item:bachelorarbeit.tex] archive=true -column=0 +column=30 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=106 +line=30 mode=LaTeX open=true order=0 @@ -152,6 +152,16 @@ mode= open=false order=-1 +[item:img/ergebnisse/expression_reinigung/reinigung_12_07_10_beschriftet.pdf] +archive=true +column=0 +encoding= +highlight= +line=0 +mode= +open=false +order=-1 + [item:img/ergebnisse/expression_reinigung/reinigung_26_07_10_beschriftet.pdf] archive=true column=673194046 @@ -162,6 +172,16 @@ mode= open=false order=-1 +[item:img/ergebnisse/haeminagarose_assay/haemin_agarose_batch_11_08_10_beschriftet.pdf] +archive=true +column=1 +encoding= +highlight= +line=0 +mode= +open=false +order=-1 + [item:img/hhulogo.png] archive=true column=0 @@ -224,20 +244,20 @@ order=4 [item:inc/ergebnisse.tex] archive=true -column=682 +column=23 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=16 +line=42 mode=LaTeX open=true order=3 [item:inc/material.tex] archive=true -column=24 +column=653 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=360 +line=496 mode=LaTeX open=true order=2 @@ -257,8 +277,8 @@ CursorColumn=58 CursorLine=4 [view-settings,view=0,item:bachelorarbeit.tex] -CursorColumn=0 -CursorLine=106 +CursorColumn=30 +CursorLine=30 [view-settings,view=0,item:inc/abkuerzungen.tex] CursorColumn=41 @@ -269,12 +289,12 @@ CursorColumn=221 CursorLine=55 [view-settings,view=0,item:inc/ergebnisse.tex] -CursorColumn=682 -CursorLine=16 +CursorColumn=23 +CursorLine=42 [view-settings,view=0,item:inc/material.tex] -CursorColumn=24 -CursorLine=360 +CursorColumn=653 +CursorLine=496 [view-settings,view=0,item:inc/zusammenfassung.tex] CursorColumn=25 diff --git a/bachelorarbeit.pdf b/bachelorarbeit.pdf index 0cda0ce..78ee53b 100644 Binary files a/bachelorarbeit.pdf and b/bachelorarbeit.pdf differ diff --git a/img/ergebnisse/expression_reinigung/reinigung_12_07_10_beschriftet.pdf b/img/ergebnisse/expression_reinigung/reinigung_12_07_10_beschriftet.pdf new file mode 100644 index 0000000..026f74f Binary files /dev/null and b/img/ergebnisse/expression_reinigung/reinigung_12_07_10_beschriftet.pdf differ diff --git a/img/ergebnisse/haeminagarose_assay/haemin_agarose_batch_11_08_10_beschriftet.pdf b/img/ergebnisse/haeminagarose_assay/haemin_agarose_batch_11_08_10_beschriftet.pdf new file mode 100644 index 0000000..df2d7cd Binary files /dev/null and b/img/ergebnisse/haeminagarose_assay/haemin_agarose_batch_11_08_10_beschriftet.pdf differ diff --git a/inc/ergebnisse.tex b/inc/ergebnisse.tex index 9b517b1..bbb2c37 100644 --- a/inc/ergebnisse.tex +++ b/inc/ergebnisse.tex @@ -1,21 +1,48 @@ \chapter{Ergebnisse} \section{Native Reinigung von \ac{RTE1}} +\label{sec:ergebnis_native_reinigung} Die native Reinigung nach dem angepassten Protokoll (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) zeigte vergleichbare Ergebnisse zum ursprünglichen Reinigungsprotokoll \citep{malach_expression_2009}, so dass auf Grund der einfacheren Verfahrensweise dieses auch im weiteren Verlauf der Arbeit angewandt wurde. +Sowohl Westernblot (Abbildung \ref{fig:blot_reinigung}), als auch SDS-PAGE (Abbildung \ref{fig:sds-page_reinigung}) zeigen einen großen Anteil nicht solubilisierten Proteins im Größenbereich um \SI{28}{\kilo\dalton}. Darüberhinaus zeigen sich Multimere unterschiedlicher Molekularität. In der Regel ließen sich aus \SI{4}{\gram} Zellen etwa \SI{0,75}{\milli\gram} Protein reinigen. + \begin{figure}[htbp!] \centering \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/expression_reinigung/reinigung_26_07_10_beschriftet.pdf} % reinigung_26_07_10_beschriftet.pdf: 943x775 pixel, 72dpi, 33.27x27.34 cm, bb=0 0 943 775 \caption[SDS-PAGE der native Reinigung von RTE1]{SDS-PAGE der native Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Solubilisat (S), Überstand aus Ultrazentrifugation (ÜS), Pellet aus Ultrazentrifugation (P), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Zahlen unterhalb von E250 geben die Säulenvolumen an. Rot umrandet wurden die Banden des \ac{RTE1}-Monomers (\SI{28}{\kilo\dalton}), blau umrandet die eines mutmaßlichen \ac{RTE1}-Dimers (\SI{56}{\kilo\dalton}). Deutlich sind bei P große Mengen nicht solubilisierten Proteins (\SI{28}{\kilo\dalton}) zu erkennen.} - \label{fig:reinigung_neu} + \label{fig:sds-page_reinigung} \end{figure} \begin{figure}[htbp!] \centering \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/expression_reinigung/blot_17_08_10_beschriftet.pdf} % blot_17_08_10_beschriftet.pdf: 980x407 pixel, 72dpi, 34.57x14.36 cm, bb=0 0 980 407 - \caption[Westernblot der nativen Reinigung von \ac{RTE1}]{Westernblot der nativen Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Solubilisat (S), Überstand aus Ultrazentrifugation (ÜS), Pellet aus Ultrazentrifugation (P), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Zahlen unterhalb von E250 geben die Säulenvolumen an. Chemilumineszenzsignale sind rot hervorgehoben, Markerbanden grün. Gut zu erkennen sind die Signale in den Elutionsfraktionen, sowie dem Solubilisat und Pellet nach Ultrazentrifugation. In letzterem zeigt sich, dass große Mengen \ac{RTE1} nicht solubilisiert wurden. In S und P zeigen sich \ac{RTE1}-Multimere bzw. Aggregate.} + \caption[Westernblot der nativen Reinigung von \ac{RTE1}]{Westernblot der nativen Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Solubilisat (S), Überstand aus Ultrazentrifugation (ÜS), Pellet aus Ultrazentrifugation (P), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Zahlen unterhalb von E250 geben die Säulenvolumen an. Chemilumineszenzsignale sind rot hervorgehoben, Markerbanden grün. Gut zu erkennen sind die Signale in der ersten Elutionsfraktion, sowie dem Solubilisat und Pellet nach Ultrazentrifugation. In letzterem zeigt sich, dass große Mengen \ac{RTE1} nicht solubilisiert wurden. In S und P zeigen sich \ac{RTE1}-Multimere bzw. Aggregate.} \label{fig:blot_reinigung} \end{figure} +\clearpage +\section{Denaturierende Reinigung} +In der Regel konnte unter nativen Bedingungen \ac{RTE1} in ausreichender Menge für die nachfolgenden Versuche präpariert werden. In einigen Fällen schlug die Solubilisierung von \ac{RTE1} allerdings fehl, so dass die Möglichkeit einer denaturierenden Reinigung in Hinblick auf zukünftige Experimente untersucht wurde. +Unter denaturierenden Bedingungen konnten weitaus größere Mengen \ac{RTE1} gereinigt werden, als mit der nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:ergebnis_native_reinigung}). Das SDS-Gel zeigt entsprechend kräftigere Banden in den Elutionsfraktionen (Abbildung \ref{fig:sds-page_denaturierende_reinigung}). + +\begin{figure}[htbp!] + \centering + \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/expression_reinigung/reinigung_12_07_10_beschriftet.pdf} + % reinigung_12_07_10_beschriftet.pdf: 937x694 pixel, 72dpi, 33.06x24.48 cm, bb=0 0 937 694 + \caption[SDS-PAGE der denaturierenden Reinigung von \ac{RTE1}]{SDS-PAGE der denaturierenden Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Zelllysat (L), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Rot umrandet wurden die \ac{RTE1}-Bande.} + \label{fig:sds-page_denaturierende_reinigung} +\end{figure} + +\section{Häminagarose-Assay} +\label{sec:ergebnis_haeminagarose} +Die SDS-PAGE der Proben aus dem Häminagarose-Assay zeigt eine Bande bei \SI{28}{\kilo\dalton}. + +\begin{figure}[htbp!] + \centering + \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/haeminagarose_assay/haemin_agarose_batch_11_08_10_beschriftet.pdf} + % haemin_agarose_batch_11_08_10_beschriftet.pdf: 683x621 pixel, 72dpi, 24.09x21.91 cm, bb=0 0 683 621 + \caption{SDS-PAGE eines Häminagarose-Assays} + \label{fig:haeminagarose} +\end{figure} diff --git a/inc/material.tex b/inc/material.tex index aff5953..88181f2 100644 --- a/inc/material.tex +++ b/inc/material.tex @@ -494,13 +494,13 @@ Beim affinitätschromatographischen Nachweis wurde ein Säulenmaterial eingesetz \SI{50}{\micro\liter} Hämin-Agarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert. -Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11,1}{\milli\Molar} Hämin-Lösung. +Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11,1}{\milli\Molar} Hämin-Lösung. %Als Negativkontrolle kam eine \ac{BSA}-Lösung in gleicher Konzentration wie die \ac{RTE1}-Probe zum Einsatz. \subsubsection{Photometrie} \label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie} Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei in vielen Fällen eine Rotverschiebung des Soret-Peaks zu beobachten, da das Protein bzw. der Protein-Häm-Komplex unterschiedliche Absorptionsmaxima aufweisen \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bzw. ihrer relativen Verschiebung zueinander bestimmt werden. -Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}. +Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}, je Messreihe wurden sechs Spektren aufgenommen. Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Hämin-Zugabe. Aus den Pufferspektren wurden dann über den Exktionktionskoeffizienten (Datenblatt des Herstellers) die tatsächliche Hämin-Konzentration in der Küvette bestimmt. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren. \begin{table}[ht] @@ -527,7 +527,7 @@ Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Hämin-Z \label{sec:nachweis_haemin_bindung_fluoreszenz} Bei der Anregung eines Fluorophors mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, kommt es zu einer Stokes-verschobenen Lichtemission bei einer für das Fluorophor spezifischen Wellenlänge. Bei Zugabe eines Quenchers tritt eine Fluoreszenzauslöschung (Quench) auf. Hierfür können unterschiedliche Effekte verantwortlich sein, allen gemein ist aber, dass sie entweder den Übergang des Fluorophors von seinem Grund- in den angeregten Zustand verhindern, oder den angeregten Zustand strahlungslos zurück in den Grundzustand überführen. Beispielsweise kann dies über eine Stoßdeaktivierung -- eine Kollision zwischen Fluorophor und Quencher -- oder einen Resonanzenergietransfer vom Fluorophor auf den Quencher erfolgen \citep{atkins_physikalische_2006}. In der Proteinanalytik wird häufig Tryptophan angeregt, dessen Absorptionsmaximum bei \SI{280}{\nano\meter} liegt und ein Emissionsmaximum im Bereich zwischen \SIrange{300}{350}{\nano\meter} aufweist \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}. -Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Tryptophane in \ac{RTE1} bei \SI{280}{\nano\meter} angeregt und das Emissionsspektrum zwischen \SIrange{300}{400}{\nano\meter} aufgenommen. Hierfür wurde zunächst \ac{RTE1} nach der Reinigung in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol über eine PD10-Säule umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden \SI{500}{\micro\liter} mit einer Proteinkonzentration von \SI{2,5}{\micro\Molar} in die Messung eingesetzt. Im Verlauf der Messung wurde Hämin bis zu einer Endkonzentration von \SI{60}{\micro\Molar} hinzutitriert. Zusätzlich wurde ein Pufferspektrum mit entsprechender Häminkonzentration aufgenommen. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren. +Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Tryptophane in \ac{RTE1} bei \SI{280}{\nano\meter} angeregt und das Emissionsspektrum zwischen \SIrange{300}{400}{\nano\meter} aufgenommen. Hierfür wurde zunächst \ac{RTE1} nach der Reinigung in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol über eine PD10-Säule umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden \SI{500}{\micro\liter} mit einer Proteinkonzentration von \SI{2,5}{\micro\Molar} in die Messung eingesetzt. Im Verlauf der Messung wurde Hämin bis zu einer Endkonzentration von \SI{60}{\micro\Molar} hinzutitriert. Es wurden drei Messreihen durchgeführt, wobei jedes aufgenommene Spektrum zehnfach akkumuliert wurde. Zusätzlich wurde ein Pufferspektrum mit entsprechender Häminkonzentration aufgenommen. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren. Wie beim photometrischen Bindungsnachweis erfolgte die Bestimmung der tatsächlich vorliegenden Häminkonzentration über die Aufnahme von Absorptionsspektren und den vom Hersteller angegebenen Extinktionskoeffizienten.