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Alexander Ralph Michael Minges
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91730f03ed
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- Weitere Kd-Werte angeben (andere Häm-bindende Proteine) -> Verifikation der eigenen Daten (Plausabilität)
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- Abweichung (5 µM zu 25 µM) u.U. durch heteronege Proben und unterschiedliche Präps
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- Ausblick: denat. Reinigung, Bindungsassay etabliert
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261
bachelorarbeit.kilepr
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261
bachelorarbeit.kilepr
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124
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124
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Institut für Biochemie der Pflanzen\\ Abteilung für biochemische Pflanzenphysiologie
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\Huge
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\Large
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Zur Erlangung des Bachelorgrades\\ (Bachelor of Science - Biochemistry)
|
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vorgelegt von \\ \textbf{Alexander Ralph Michael Minges \\ (1804535)}
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im September 2010
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\vfill \begin{description}
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\item[Erstprüfer:]{Univ. Prof. Dr. G. Groth\\ Institut für Biochemie der Pflanzen \\ Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf}
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\item[Zweitprüfer:]{Univ. Prof. Dr. L. Schmitt\\ Institut für Biochemie \\ Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf}
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106
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\subject{Biochemie der Pflanzen\\Abteilung für biochemische Pflanzenphysiologie}
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\title{Bachelorarbeit}
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\subtitle{Molekulare Charakterisierung von \acs{RTE1} aus \acl{A. thaliana}}
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\author{Alexander Ralph Michael Minges}
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\vspace*{\fill}{Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf\\ Institut für Biochemie der Pflanzen\\ Abteilung für biochemische Pflanzenphysiologie}
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\Huge
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Bachelorarbeit
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\Large
|
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Molekulare Charakterisierung von \acs{RTE1} aus \acs{A. thaliana}
|
||||
\vfill {Zur Erlangung des Bachelorgrades (Bachelor of Science - Biochemistry)}
|
||||
\vfill {vorgelegt von \\ \textbf{Alexander Ralph Michael Minges \\ (1804535)}}
|
||||
\vfill \begin{description}
|
||||
\item[Erstprüfer:]{Univ. Prof. Dr. G. Groth\\ Institut für Biochemie der Pflanzen \\ Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf}
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\item[Zweitprüfer:]{Univ. Prof. Dr. L. Schmitt\\ Institut für Biochemie \\ Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf}
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
||||
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|
||||
<path
|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
||||
<path
|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
||||
</g>
|
||||
<g
|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
||||
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|
||||
<path
|
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|
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|
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|
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|
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|
||||
<g
|
||||
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|
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|
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|
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<g
|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
||||
<path
|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
||||
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|
||||
</g>
|
||||
<path
|
||||
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|
||||
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|
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|
||||
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|
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|
||||
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|
||||
</g>
|
||||
<path
|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
||||
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|
||||
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|
||||
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|
||||
<path
|
||||
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|
||||
d="m 115.15739,351.31631 c 0,16.73676 -8.81908,30.30458 -19.697971,30.30458 -10.878891,0 -19.697975,-13.56782 -19.697975,-30.30458 0,-16.73675 8.819084,-30.30457 19.697975,-30.30457 10.878891,0 19.697971,13.56782 19.697971,30.30457 z"
|
||||
sodipodi:ry="30.304577"
|
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sodipodi:rx="19.697975"
|
||||
sodipodi:cy="351.31631"
|
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sodipodi:cx="95.459419"
|
||||
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|
||||
style="fill:#272727;fill-opacity:1;stroke:#000000;stroke-width:0.671;stroke-linecap:round;stroke-linejoin:round;stroke-miterlimit:4;stroke-opacity:1;stroke-dasharray:none"
|
||||
sodipodi:type="arc" />
|
||||
<path
|
||||
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|
||||
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|
||||
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|
||||
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|
||||
style="fill:none;stroke:#000000;stroke-width:1px;stroke-linecap:butt;stroke-linejoin:miter;stroke-opacity:1" />
|
||||
<g
|
||||
style="fill:#ffffff;fill-opacity:1"
|
||||
transform="matrix(-0.98336125,0.18166083,0.18166083,0.98336125,1033.12,-71.322152)"
|
||||
id="g3890-0">
|
||||
<g
|
||||
style="fill:#ffffff;fill-opacity:1"
|
||||
id="g3886-6">
|
||||
<rect
|
||||
y="182.63881"
|
||||
x="397.36359"
|
||||
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|
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|
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|
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|
||||
<path
|
||||
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|
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|
||||
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sodipodi:cy="351.31631"
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sodipodi:cx="95.459419"
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|
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style="fill:#ffffff;fill-opacity:1;stroke:#000000;stroke-width:0.671;stroke-linecap:round;stroke-linejoin:round;stroke-miterlimit:4;stroke-opacity:1;stroke-dasharray:none"
|
||||
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|
||||
</g>
|
||||
<path
|
||||
style="fill:#ffffff;fill-opacity:1;stroke:#000000;stroke-width:1px;stroke-linecap:butt;stroke-linejoin:miter;stroke-opacity:1"
|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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<text
|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
||||
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|
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|
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|
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|
||||
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|
||||
sodipodi:type="arc" />
|
||||
<text
|
||||
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|
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|
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|
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|
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|
||||
xml:space="preserve"><tspan
|
||||
y="67.777245"
|
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x="160.08452"
|
||||
id="tspan4414"
|
||||
sodipodi:role="line">Ethylen</tspan></text>
|
||||
</g>
|
||||
<text
|
||||
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|
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|
||||
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|
||||
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|
||||
id="text4416"
|
||||
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|
||||
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|
||||
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|
||||
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|
||||
y="227.06755">Nicht-funktionelles </tspan><tspan
|
||||
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|
||||
x="-225.9696"
|
||||
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|
||||
id="tspan4420">ETR1</tspan></text>
|
||||
<path
|
||||
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|
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|
||||
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|
||||
<path
|
||||
style="fill:none;stroke:#000000;stroke-width:1px;stroke-linecap:butt;stroke-linejoin:miter;stroke-opacity:1"
|
||||
d="m 432.85037,77.564976 25.25381,0 0,357.594004 -24.24366,0"
|
||||
id="path4424-0" />
|
||||
<text
|
||||
xml:space="preserve"
|
||||
style="font-size:25.52466393px;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:normal;font-stretch:normal;text-align:start;line-height:125%;writing-mode:lr-tb;text-anchor:start;fill:#000000;fill-opacity:1;stroke:none;font-family:Linux Biolinum O;-inkscape-font-specification:Linux Biolinum O"
|
||||
x="-349.30557"
|
||||
y="150.82693"
|
||||
id="text4489"
|
||||
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|
||||
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|
||||
id="tspan4491"
|
||||
x="-349.30557"
|
||||
y="150.82693">ER-/Golgi-Membran</tspan></text>
|
||||
<text
|
||||
xml:space="preserve"
|
||||
style="font-size:32px;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:normal;font-stretch:normal;text-align:start;line-height:125%;writing-mode:lr-tb;text-anchor:start;fill:#000000;fill-opacity:1;stroke:none;font-family:Linux Biolinum O;-inkscape-font-specification:Linux Biolinum O"
|
||||
x="-342.44171"
|
||||
y="78.575127"
|
||||
id="text4518"
|
||||
sodipodi:linespacing="125%"><tspan
|
||||
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|
||||
id="tspan4520" /></text>
|
||||
<g
|
||||
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|
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|
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<g
|
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|
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|
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|
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<path
|
||||
style="fill:none;stroke:#000000;stroke-width:1px;stroke-linecap:butt;stroke-linejoin:miter;stroke-opacity:1"
|
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|
||||
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|
||||
<path
|
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|
||||
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|
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|
||||
</g>
|
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<rect
|
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|
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|
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|
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|
||||
</g>
|
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<text
|
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|
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|
||||
x="-231.52798"
|
||||
y="-20.195824"
|
||||
id="text2919"
|
||||
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|
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sodipodi:role="line"
|
||||
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|
||||
x="-231.52798"
|
||||
y="-20.195824">I</tspan></text>
|
||||
<text
|
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|
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|
||||
x="101.60044"
|
||||
y="-20.195824"
|
||||
id="text2923"
|
||||
sodipodi:linespacing="125%"><tspan
|
||||
sodipodi:role="line"
|
||||
id="tspan2925"
|
||||
x="101.60044"
|
||||
y="-20.195824">II</tspan></text>
|
||||
<text
|
||||
xml:space="preserve"
|
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|
||||
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|
||||
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|
||||
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|
||||
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|
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|
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|
||||
x="366.72885"
|
||||
y="-20.195824">III</tspan></text>
|
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<text
|
||||
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|
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|
||||
x="635.40625"
|
||||
y="-20.419825"
|
||||
id="text2931"
|
||||
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|
||||
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|
||||
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|
||||
x="635.40625"
|
||||
y="-20.419825">IV</tspan></text>
|
||||
</g>
|
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</svg>
|
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|
@ -0,0 +1,42 @@
|
|||
\chapter*{Abkürzungsverzeichnis}
|
||||
\begin{acronym}[SDS-PAGE]
|
||||
\setlength{\itemsep}{-\parsep}
|
||||
\acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
|
||||
\acro{ACC}{1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure}
|
||||
\acro{AdoMet}{Adenosylmethionin}
|
||||
\acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
|
||||
\acro{A. thaliana}[\textit{A. thaliana}]{\textit{Arabidopsis thaliana}}
|
||||
\acro{BisTris}{Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan}
|
||||
\acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
|
||||
\acro{CD}{Circularer Dichronismus}
|
||||
\acro{cmc}{\textit{critical micelle concentration}, kritische Mizellenkonzentration}
|
||||
\acro{CTR1}{\textit{CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE 1}}
|
||||
\acro{CV}{\textit{column volume}, Säulenvolumen}
|
||||
\acro{dNTP}{desoxyribo-Nukleinsäure-Triphosphat}
|
||||
\acro{DTT}{Dithiothreitol}
|
||||
\acro{EBF1}{\textit{EIN3 BINDING FACTOR 1}}
|
||||
\acro{EBF2}{\textit{EIN3 BINDING FACTOR 2}}
|
||||
\acro{EDTA}{Ethylendiamintetraessigsäure}
|
||||
\acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}}
|
||||
\acro{EIL1}{\textit{ETHYLENE INSENSITIVE3 LIKE 1}}
|
||||
\acro{EIN2}{\textit{ETHYLENE INSENSITIVE 2}}
|
||||
\acro{EIN3}{\textit{ETHYLENE INSENSITIVE 3}}
|
||||
\acro{ER}{Endoplasmatisches Retikulum}
|
||||
\acro{ERF1}{\textit{ETHYLENE RESPONSE FACTOR 1}}
|
||||
\acro{ETR1}{\textit{ETHYLENE RESISTANT 1}}
|
||||
\acro{GR}{\textit{GREEN RIPE}}
|
||||
\acro{HRP}{\textit{horseradish peroxidase}, Meerrettich-Peroxidase}
|
||||
\acro{IDA}{Iminodiessigsäure}
|
||||
\acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
|
||||
\acro{MAP}{\textit{mitogen activated protein}}
|
||||
\acro{MCS}{\textit{multiple cloning site}}
|
||||
\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
|
||||
\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
|
||||
\acro{RAN1}{\textit{RESPONSIVE TO ANTAGONIST 1}}
|
||||
\acro{RTE1}{\textit{REVERSION TO ETHYLENE 1}}
|
||||
\acro{RTH}{\textit{RTE1-HOMOLOG}}
|
||||
\acro{SDS}{\textit{sodium dodecylsulfate}, Natriumdodecylsulfat}
|
||||
\acro{SDS-PAGE}{\textit{sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis}, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese}
|
||||
\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
|
||||
\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
|
||||
\end{acronym}
|
||||
38
inc/abkuerzungen.tex.backup
Normal file
38
inc/abkuerzungen.tex.backup
Normal file
|
|
@ -0,0 +1,38 @@
|
|||
\chapter*{Abkürzungsverzeichnis}
|
||||
\begin{acronym}[SDS-PAGE]
|
||||
\setlength{\itemsep}{-\parsep}
|
||||
\acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
|
||||
\acro{ACC}{1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure}
|
||||
\acro{AdoMet}{Adenosylmethionin}
|
||||
\acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
|
||||
\acro{A. thaliana}[\textit{A. thaliana}]{\textit{Arabidopsis thaliana}}
|
||||
\acro{BisTris}{Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan}
|
||||
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\acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
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\acro{SDS}{\textit{sodium dodecylsulfate}, Natriumdodecylsulfat}
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\acro{SDS-PAGE}{\textit{sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis}, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\acro{BisTris}{Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan}
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\acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
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\acro{CD}{Circularer Dichronismus}
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\acro{cmc}{\textit{critical micelle concentration}, kritische Mizellenkonzentration}
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\acro{CTR1}{\textit{CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE 1}}
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\acro{CV}{\textit{column volume}, Säulenvolumen}
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\acro{dNTP}{desoxyribo-Nukleinsäure-Triphosphat}
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\acro{DTT}{Dithiothreitol}
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\acro{EBF1}{\textit{EIN3 BINDING FACTOR 1}}
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\acro{EBF2}{\textit{EIN3 BINDING FACTOR 2}}
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\acro{EDTA}{Ethylendiamintetraessigsäure}
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\acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}}
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\acro{EIL1}{\textit{ETHYLENE INSENSITIVE3 LIKE 1}}
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\acro{EIN2}{\textit{ETHYLENE INSENSITIVE 2}}
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\acro{EIN3}{\textit{ETHYLENE INSENSITIVE 3}}
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\acro{ER}{Endoplasmatisches Retikulum}
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\acro{ERF1}{\textit{ETHYLENE RESPONSE FACTOR 1}}
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\acro{ETR1}{\textit{ETHYLENE RESISTANT 1}}
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\acro{GR}{\textit{GREEN RIPE}}
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\acro{HRP}{\textit{horseradish peroxidase}, Meerrettich-Peroxidase}
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\acro{IDA}{Iminodiessigsäure}
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\acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
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\acro{MAP}{\textit{mitogen activated protein}}
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\acro{MCS}{\textit{multiple cloning site}}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
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\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
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\acro{RAN1}{\textit{RESPONSIVE TO ANTAGONIST 1}}
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\acro{RTE1}{\textit{REVERSION TO ETHYLENE 1}}
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\acro{SDS}{\textit{sodium dodecylsulfate}, Natriumdodecylsulfat}
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\acro{SDS-PAGE}{\textit{sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis}, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
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\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
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\chapter{Einleitung}
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Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanzen viele Aspekte von Entwicklung, Wachstum und Stressantwort reguliert \citep{kendrick_ethylene_2008}.
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\textit{In vivo} wird Ethylen aus der Aminosäure Methionin synthetisiert, welche über \ac{AdoMet} und \ac{ACC} in Ethylen umgewandelt wird. Dies geschieht unter ATP-Verbrauch im Cytoplasma, wobei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, die Umwandlung von \ac{AdoMet} zu \ac{ACC}, von der \ac{ACC}-Synthase katalysiert wird. Aus dem freiwerdenden 5'-Methylthioadenosin wird im Yang-Zyklus Methionin regeneriert (vgl. Abbildung \ref{fig:yang_zyklus}).
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\begin{figure}[htbp!]
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\caption[Ethylensynthese und Yang-Zyklus]{Ethylensynthese ausgehend von Methionin und Regeneration von Methionin im Yang-Zyklus \citep{taiz_plant_2007}}
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\label{fig:yang_zyklus}
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\end{figure}
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Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Hierdurch wird die nachgeschaltete \acs{MAP}-Kinase-Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).
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||||
In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4) welche mit prokaryotischen Zwei-Komponenten-Histidinkinasen verwandt sind \citep{voet-van-vormizeele_mutants_2008}. Diese Rezeptoren zeigen eine funktionelle Redundanz und sind negative Regulatoren der Ethylenantwort \citep{resnick_involvement_2008}.
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\includegraphics[keepaspectratio=true, scale=0.8]{./img/einleitung/ethylen_signalweg.png}
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\caption[Ethylen-Signalweg]{Schematische Darstellung des Ethylen-Signalweges \citep{kendrick_ethylene_2008}}
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\label{fig:ethylen_signalweg}
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\end{figure}
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Bei \ac{RTE1} handelt es sich um ein Homodimer, welches kolokalisiert mit \ac{ETR1} in der Membran des Golgi-Apparates bzw. des \ac{ER} vorliegt \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Entdeckt wurde es bei der Suche nach zusätzlichen Komponenten des Ethylensignalweges. Die Ethylen-insensitiven Mutante \textit{etr1-2} zeigt bei Anwesenheit von Ethylen und Wachstum im Dunkeln \textit{nicht} den üblichen Phänotyp der Dreifachantwort: Verdickung und Verkürzung des Hypokotyls, Hemmung des Wurzelwachstums und Krümmung des Apikalhakens. Bei \textit{etr1-2} beruht die Insensitivität gegenüber Ethylen im Gegensatz zu \textit{etr1-1} nicht auf dem Unvermögen den für die Ethylenbindung erforderlichen Kofaktor Kupfer zu binden, sondern auf der Blockade der Weiterleitung des Ethylensignals zur Signaldomäne des Rezeptors. Es wird vermutet, dass die auf die Ethylenbindung folgende Konformationsänderung verhindert wird. \citep{resnick_involvement_2008}.
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Durch Mutagenese wurden Individuen aus dieser \textit{etr1-2}-Population erzeugt, welche wieder die Dreifachantwort \textit{zeigten}. Durch Komplementierungsversuche wurden die Mutanten \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} als allelisch identifiziert. Da beide Mutanten eine Ethylenantwort ähnlich der des Wildtyps aufwiesen, konnte darauf geschlossen werden, dass ein funktionelles \ac{RTE1} für die Insensitivität der \textit{etr1-2}-Mutanten notwendig ist. Folglich muss \ac{RTE1} zu einem frühen Zeitpunkt innerhalb des Ethylensignalweges gemeinsam mit \ac{ETR1} wirksam sein. Ein weiteres Allel \textit{rte1-3} wurde nach Analyse der Gensequenz von \ac{RTE1} identifiziert. Alle \ac{RTE1}-Mutanten zeigten einen ähnlichen Phänotyp, woraus geschlossen wurde, dass \textit{rte1-2} und \textit{rte1-2} \textit{loss-of-function}-Allele darstellen. Bei \textit{rte1-3} handelt es sich vermutlich um eine Nullmutation \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}.
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\textit{rte1-2} ist in der Lage, eine Reihe von Mutationen in \ac{ETR1} zu unterdrücken, beispielsweise \textit{etr1-2}, allerdings nur bei Mutationen, welche die eigentliche Ethylenbindung nicht oder zumindest nicht vollständig verhindern \citep{resnick_involvement_2008}.
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Weitere Versuche zeigten, dass eine Überexpression von \ac{RTE1} im Wildtyp zu einer verminderten Ethylensensitivität führt, was die Annahme stützte, dass es sich bei \ac{RTE1} um einen negativen Regulator der Ethylenantwort handelt \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Ebenso konnte durch die Analyse des Phänotyps von Doppel- und Dreifachmutanten mit \textit{etr1-2}, \textit{rte1-2} und \textit{ran1-3} gezeigt werden, dass \ac{RTE1} unabhängig von \ac{RAN1} auf die Ethylensignalkaskade wirkt \citep{resnick_involvement_2008}. So ist die Funktion von \ac{ETR1} im Wildtyp sowohl von \ac{RTE1} als auch von \ac{RAN1} abhängig, \textit{etr1-2} hingegen nur von \ac{RTE1}. Hiervon ausgehend wurde das nachfolgend dargestellte Modell zum Signalzustand von \ac{ETR1} vorgeschlagen \citep{resnick_involvement_2008}.
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\ac{RTE1} reguliert die Ethylenantwort über eine Konformationsänderung der Ethylen-Bindedomäne des Rezeptors ETR1 (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}). ETR1 geht hierbei von einer nicht-funktionellen Konformation mit Hilfe von RTE1 in eine funktionelle Konformation über, in welchem der Rezeptor sich in seinem "`an"'-Zustand befindet und die Ethylenantwort unterdrückt. In diesem Zustand kann nun auch Ethylen gebunden werden, wobei ETR1 in eine semi-stabile Konformation übergeht, welche ebenfalls den "`an"'-Zustand repräsentiert und schließlich durch eine Konformationsänderung in den "`aus"'-Zustand wechselt, wodurch die Ethylensignalkaskade ausgelöst wird. Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand kann wiederum nur mit Hilfe von RTE1 erfolgen \citep{resnick_involvement_2008}.
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Homologe zu \ac{RTE1} wurden in einer Vielzahl weiterer Eukaryoten mit Ausnahme der Pilze gefunden, beispielsweise in \textit{Homo sapiens}, \textit{Drosophila melanogatser}, \textit{Caenorhabditis elegans} und \textit{Plasmodium}. Das menschliche Homolog weist eine Sequenzidentität im Vergleich zu \ac{RTE1} aus \ac{A. thaliana} von \SI{40,5}{\percent} auf \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Nach bisherigem Kenntnisstand verfügen die genannten Spezies über jeweils eine Kopie des Gens, mit Ausnahme von \ac{A. thaliana}, bei welcher sich eine zweite Kopie -- \ac{RTH} -- mit \SI{51}{\percent} Sequenzidentität findet \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}.
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Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies ohne Ethylenrezeptoren \citep{resnick_involvement_2008} lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Durch Sequenz-Alignments konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cystein- und Histidinreste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-1} ist Cys$^\text{161}$ durch ein Tyrosin ersetzt. Darüberhinaus zeigen sequenzbasierte Vorhersagen, dass pflanzliche \ac{RTE1}-Homologe zwei bis vier Transmembrandomänen besitzen, eine nahe des N-Terminus sowie zwei bis drei am C-Terminus. In \textit{rte1-2} sind durch einen von einer \textit{missense}-Mutation hervorgerufenen \textit{frameshift} die letzten 27 Aminosäurereste, welche sich in einer vorhergesagten Transmembrandomäne befinden, durch 15 inkorrekte Reste ersetzt worden, was vermutlich zu einer falschen Ausrichtung des Proteins in der Membran führt. Tierische Homologe zeigen in der Sequenzanalyse die ersten drei Transmembrandomänen \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}.
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\caption[Modell des Signalzustandes von ETR1]{Modell des Signalzustandes von ETR1 \citep[eigene Abbildung nach][]{resnick_involvement_2008}\\\ac{RTE1} bewirkt den Übergang von \ac{ETR1} von einer nicht-funktionellen (I) in eine funktionelle Konformation (II). Diese spiegelt den "`an"'-Zustand des Rezeptors wider. Wird Ethylen gebunden, geht der Rezeptor in eine semi-stabile Konformation (III) über, welche ebenfalls noch dem "`an"'-Zustand entspricht. Aus dieser Konformation wechselt \ac{ETR1} in den "`aus"'-Zustand (IV). Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand erfolgt wiederum mit Hilfe von \ac{RTE1}.}
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\label{fig:etr1_zustaende}
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\end{figure}
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\chapter{Einleitung}
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Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanzen viele Aspekte von Entwicklung, Wachstum und Stressantwort reguliert \citep{kendrick_ethylene_2008}.
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\textit{In vivo} wird Ethylen aus der Aminosäure Methionin synthetisiert, welche über \ac{AdoMet} und \ac{ACC} in Ethylen umgewandelt wird. Dies geschieht unter ATP-Verbrauch im Cytoplasma, wobei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, die Umwandlung von \ac{AdoMet} zu \ac{ACC}, von der \ac{ACC}-Synthase katalysiert wird. Aus dem freiwerdenden 5'-Methylthioadenosin wird im Yang-Zyklus Methionin regeneriert (vgl. Abbildung \ref{fig:yang_zyklus}).
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\begin{figure}[htbp!]
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\caption[Ethylensynthese und Yang-Zyklus]{Ethylensynthese ausgehend von Methionin und Regeneration von Methionin im Yang-Zyklus \citep{taiz_plant_2007}}
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\label{fig:yang_zyklus}
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\end{figure}
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Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Hierdurch wird die nachgeschaltete \acs{MAP}-Kinase-Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).
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In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4) welche mit prokaryotischen Zwei-Komponenten-Histidinkinasen verwandt sind \citep{voet-van-vormizeele_mutants_2008}. Diese Rezeptoren zeigen eine funktionelle Redundanz und sind negative Regulatoren der Ethylenantwort \citep{resnick_involvement_2008}.
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\begin{figure}[htbp!]
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\caption[Ethylen-Signalweg]{Schematische Darstellung des Ethylen-Signalweges \citep{kendrick_ethylene_2008}}
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\label{fig:ethylen_signalweg}
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\end{figure}
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Bei \ac{RTE1} handelt es sich um ein Homodimer, welches kolokalisiert mit \ac{ETR1} in der Membran des Golgi-Apparates bzw. des \ac{ER} vorliegt \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Entdeckt wurde es bei der Suche nach zusätzlichen Komponenten des Ethylensignalweges. Die Ethylen-insensitiven Mutante \textit{etr1-2} zeigt bei Anwesenheit von Ethylen und Wachstum im Dunkeln \textit{nicht} den üblichen Phänotyp der Dreifachantwort: Verdickung und Verkürzung des Hypokotyls, Hemmung des Wurzelwachstums und Krümmung des Apikalhakens. Bei \textit{etr1-2} beruht die Insensitivität gegenüber Ethylen im Gegensatz zu \textit{etr1-1} nicht auf dem Unvermögen den für die Ethylenbindung erforderlichen Kofaktor Kupfer zu binden, sondern auf der Blockade der Weiterleitung des Ethylensignals zur Signaldomäne des Rezeptors. Es wird vermutet, dass die auf die Ethylenbindung folgende Konformationsänderung verhindert wird. \citep{resnick_involvement_2008}.
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Durch Mutagenese wurden Individuen aus dieser \textit{etr1-2}-Population erzeugt, welche wieder die Dreifachantwort \textit{zeigten}. Durch Komplementierungsversuche wurden die Mutanten \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} als allelisch identifiziert. Da beide Mutanten eine Ethylenantwort ähnlich der des Wildtyps aufwiesen, konnte darauf geschlossen werden, dass ein funktionelles \ac{RTE1} für die Insensitivität der \textit{etr1-2}-Mutanten notwendig ist. Folglich muss \ac{RTE1} zu einem frühen Zeitpunkt innerhalb des Ethylensignalweges gemeinsam mit \ac{ETR1} wirksam sein. Ein weiteres Allel \textit{rte1-3} wurde nach Analyse der Gensequenz von \ac{RTE1} identifiziert. Alle \ac{RTE1}-Mutanten zeigten einen ähnlichen Phänotyp, woraus geschlossen wurde, dass \textit{rte1-2} und \textit{rte1-2} \textit{loss-of-function}-Allele darstellen. Bei \textit{rte1-3} handelt es sich vermutlich um eine Nullmutation \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}.
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\textit{rte1-2} ist in der Lage, eine Reihe von Mutationen in \ac{ETR1} zu unterdrücken, beispielsweise \textit{etr1-2}, allerdings nur bei Mutationen, welche die eigentliche Ethylenbindung nicht oder zumindest nicht vollständig verhindern \citep{resnick_involvement_2008}.
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Weitere Versuche zeigten, dass eine Überexpression von \ac{RTE1} im Wildtyp zu einer verminderten Ethylensensitivität führt, was die Annahme stützte, dass es sich bei \ac{RTE1} um einen negativen Regulator der Ethylenantwort handelt \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Ebenso konnte durch die Analyse des Phänotyps von Doppel- und Dreifachmutanten mit \textit{etr1-2}, \textit{rte1-2} und \textit{ran1-3} gezeigt werden, dass \ac{RTE1} unabhängig von \ac{RAN1} auf die Ethylensignalkaskade wirkt \citep{resnick_involvement_2008}. So ist die Funktion von \ac{ETR1} im Wildtyp sowohl von \ac{RTE1} als auch von \ac{RAN1} abhängig, \textit{etr1-2} hingegen nur von \ac{RTE1}. Hiervon ausgehend wurde das nachfolgend dargestellte Modell zum Signalzustand von \ac{ETR1} vorgeschlagen \citep{resnick_involvement_2008}.
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\ac{RTE1} reguliert die Ethylenantwort über eine Konformationsänderung der Ethylen-Bindedomäne des Rezeptors ETR1 (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}). ETR1 geht hierbei von einer nicht-funktionellen Konformation mit Hilfe von RTE1 in eine funktionelle Konformation über, in welchem der Rezeptor sich in seinem "`an"'-Zustand befindet und die Ethylenantwort unterdrückt. In diesem Zustand kann nun auch Ethylen gebunden werden, wobei ETR1 in eine semi-stabile Konformation übergeht, welche ebenfalls den "`an"'-Zustand repräsentiert und schließlich durch eine Konformationsänderung in den "`aus"'-Zustand wechselt, wodurch die Ethylensignalkaskade ausgelöst wird. Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand kann wiederum nur mit Hilfe von RTE1 erfolgen \citep{resnick_involvement_2008}.
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Homologe zu \ac{RTE1} wurden in einer Vielzahl weiterer Eukaryoten mit Ausnahme der Pilze gefunden, beispielsweise in \textit{Homo sapiens}, \textit{Drosophila melanogatser}, \textit{Caenorhabditis elegans} und \textit{Plasmodium}. Das menschliche Homolog weist eine Sequenzidentität im Vergleich zu \ac{RTE1} aus \ac{A. thaliana} von \SI{40,5}{\percent} auf \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Nach bisherigem Kenntnisstand verfügen die genannten Spezies über jeweils eine Kopie des Gens, mit Ausnahme von \ac{A. thaliana}, bei welcher sich eine zweite Kopie -- \ac{RTH} -- mit \SI{51}{\percent} Sequenzidentität findet \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}.
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Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Durch Sequenz-Alignments konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cys- und His-Reste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-2} ist
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\begin{figure}[htbp!]
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\caption[Modell des Signalzustandes von ETR1]{Modell des Signalzustandes von ETR1 \citep[eigene Abbildung nach][]{resnick_involvement_2008}\\\ac{RTE1} bewirkt den Übergang von \ac{ETR1} von einer nicht-funktionellen (I) in eine funktionelle Konformation (II). Diese spiegelt den "`an"'-Zustand des Rezeptors wider. Wird Ethylen gebunden, geht der Rezeptor in eine semi-stabile Konformation (III) über, welche ebenfalls noch dem "`an"'-Zustand entspricht. Aus dieser Konformation wechselt \ac{ETR1} in den "`aus"'-Zustand (IV). Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand erfolgt wiederum mit Hilfe von \ac{RTE1}.}
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\label{fig:etr1_zustaende}
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\end{figure}
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inc/einleitung.tex~
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inc/einleitung.tex~
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\chapter{Einleitung}
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Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanzen viele Aspekte von Entwicklung, Wachstum und Stressantwort reguliert \citep{kendrick_ethylene_2008}.
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\textit{In vivo} wird Ethylen aus der Aminosäure Methionin synthetisiert, welche über \ac{AdoMet} und \ac{ACC} in Ethylen umgewandelt wird. Dies geschieht unter ATP-Verbrauch im Cytoplasma, wobei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, die Umwandlung von \ac{AdoMet} zu \ac{ACC}, von der \ac{ACC}-Synthase katalysiert wird. Aus dem freiwerdenden 5'-Methylthioadenosin wird im Yang-Zyklus Methionin regeneriert (vgl. Abbildung \ref{fig:yang_zyklus}).
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\caption[Ethylensynthese und Yang-Zyklus]{Ethylensynthese ausgehend von Methionin und Regeneration von Methionin im Yang-Zyklus \citep{taiz_plant_2007}}
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\label{fig:yang_zyklus}
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\end{figure}
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Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Hierdurch wird die nachgeschaltete \acs{MAP}-Kinase-Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).
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In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4) welche mit prokaryotischen Zwei-Komponenten-Histidinkinasen verwandt sind \citep{voet-van-vormizeele_mutants_2008}. Diese Rezeptoren zeigen eine funktionelle Redundanz und sind negative Regulatoren der Ethylenantwort \citep{resnick_involvement_2008}.
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\begin{figure}[htbp!]
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\caption[Ethylen-Signalweg]{Schematische Darstellung des Ethylen-Signalweges \citep{kendrick_ethylene_2008}}
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\label{fig:ethylen_signalweg}
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\end{figure}
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Bei \ac{RTE1} handelt es sich um ein Homodimer, welches kolokalisiert mit \ac{ETR1} in der Membran des Golgi-Apparates bzw. des \ac{ER} vorliegt \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Entdeckt wurde es bei der Suche nach zusätzlichen Komponenten des Ethylensignalweges. Die Ethylen-insensitiven Mutante \textit{etr1-2} zeigt bei Anwesenheit von Ethylen und Wachstum im Dunkeln \textit{nicht} den üblichen Phänotyp der Dreifachantwort: Verdickung und Verkürzung des Hypokotyls, Hemmung des Wurzelwachstums und Krümmung des Apikalhakens. Bei \textit{etr1-2} beruht die Insensitivität gegenüber Ethylen im Gegensatz zu \textit{etr1-1} nicht auf dem Unvermögen den für die Ethylenbindung erforderlichen Kofaktor Kupfer zu binden, sondern auf der Blockade der Weiterleitung des Ethylensignals zur Signaldomäne des Rezeptors. Es wird vermutet, dass die auf die Ethylenbindung folgende Konformationsänderung verhindert wird. \citep{resnick_involvement_2008}.
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Durch Mutagenese wurden Individuen aus dieser \textit{etr1-2}-Population erzeugt, welche wieder die Dreifachantwort \textit{zeigten}. Durch Komplementierungsversuche wurden die Mutanten \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} als allelisch identifiziert. Da beide Mutanten eine Ethylenantwort ähnlich der des Wildtyps aufwiesen, konnte darauf geschlossen werden, dass ein funktionelles \ac{RTE1} für die Insensitivität der \textit{etr1-2}-Mutanten notwendig ist. Folglich muss \ac{RTE1} zu einem frühen Zeitpunkt innerhalb des Ethylensignalweges gemeinsam mit \ac{ETR1} wirksam sein. Ein weiteres Allel \textit{rte1-3} wurde nach Analyse der Gensequenz von \ac{RTE1} identifiziert. Alle \ac{RTE1}-Mutanten zeigten einen ähnlichen Phänotyp, woraus geschlossen wurde, dass \textit{rte1-2} und \textit{rte1-2} \textit{loss-of-function}-Allele darstellen. Bei \textit{rte1-3} handelt es sich vermutlich um eine Nullmutation \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}.
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\textit{rte1-2} ist in der Lage, eine Reihe von Mutationen in \ac{ETR1} zu unterdrücken, beispielsweise \textit{etr1-2}, allerdings nur bei Mutationen, welche die eigentliche Ethylenbindung nicht oder zumindest nicht vollständig verhindern \citep{resnick_involvement_2008}.
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Weitere Versuche zeigten, dass eine Überexpression von \ac{RTE1} im Wildtyp zu einer verminderten Ethylensensitivität führt, was die Annahme stützte, dass es sich bei \ac{RTE1} um einen negativen Regulator der Ethylenantwort handelt \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Ebenso konnte durch die Analyse des Phänotyps von Doppel- und Dreifachmutanten mit \textit{etr1-2}, \textit{rte1-2} und \textit{ran1-3} gezeigt werden, dass \ac{RTE1} unabhängig von \ac{RAN1} auf die Ethylensignalkaskade wirkt \citep{resnick_involvement_2008}. So ist die Funktion von \ac{ETR1} im Wildtyp sowohl von \ac{RTE1} als auch von \ac{RAN1} abhängig, \textit{etr1-2} hingegen nur von \ac{RTE1}. Hiervon ausgehend wurde das nachfolgend dargestellte Modell zum Signalzustand von \ac{ETR1} vorgeschlagen \citep{resnick_involvement_2008}.
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\ac{RTE1} reguliert die Ethylenantwort über eine Konformationsänderung der Ethylen-Bindedomäne des Rezeptors ETR1 (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}). ETR1 geht hierbei von einer nicht-funktionellen Konformation mit Hilfe von RTE1 in eine funktionelle Konformation über, in welchem der Rezeptor sich in seinem "`an"'-Zustand befindet und die Ethylenantwort unterdrückt. In diesem Zustand kann nun auch Ethylen gebunden werden, wobei ETR1 in eine semi-stabile Konformation übergeht, welche ebenfalls den "`an"'-Zustand repräsentiert und schließlich durch eine Konformationsänderung in den "`aus"'-Zustand wechselt, wodurch die Ethylensignalkaskade ausgelöst wird. Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand kann wiederum nur mit Hilfe von RTE1 erfolgen \citep{resnick_involvement_2008}.
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Homologe zu \ac{RTE1} wurden in einer Vielzahl weiterer Eukaryoten mit Ausnahme der Pilze gefunden, beispielsweise in \textit{Homo sapiens}, \textit{Drosophila melanogatser}, \textit{Caenorhabditis elegans} und \textit{Plasmodium}. Das menschliche Homolog weist eine Sequenzidentität im Vergleich zu \ac{RTE1} aus \ac{A. thaliana} von \SI{40,5}{\percent} auf \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Nach bisherigem Kenntnisstand verfügen die genannten Spezies über jeweils eine Kopie des Gens, mit Ausnahme von \ac{A. thaliana}, bei welcher sich eine zweite Kopie -- \ac{RTH} -- mit \SI{51}{\percent} Sequenzidentität findet \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}.
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Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies ohne Ethylenrezeptoren \citep{resnick_involvement_2008} lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}. Durch Sequenz-Alignments konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cystein- und Histidinreste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-1} ist Cys$^\text{161}$ durch ein Tyrosin ersetzt. Darüberhinaus zeigen sequenzbasierte Vorhersagen, dass pflanzliche \ac{RTE1}-Homologe zwei bis vier Transmembrandomänen besitzen, eine nahe des N-Terminus sowie zwei bis drei am C-Terminus. In \textit{rte1-2} sind durch einen von einer \textit{missense}-Mutation hervorgerufenen \textit{frameshift} die letzten 27 Aminosäurereste, welche sich in einer vorhergesagten Transmembrandomäne befinden, durch 15 inkorrekte Reste ersetzt worden, was vermutlich zu einer falschen Ausrichtung des Proteins in der Membran führt. Tierische Homologe zeigen in der Sequenzanalyse die ersten drei Transmembrandomänen \citep{resnick_reversion-to-ethylene_2006}.
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\begin{figure}[htbp!]
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\caption[Modell des Signalzustandes von ETR1]{Modell des Signalzustandes von ETR1 \citep[eigene Abbildung nach][]{resnick_involvement_2008}\\\ac{RTE1} bewirkt den Übergang von \ac{ETR1} von einer nicht-funktionellen (I) in eine funktionelle Konformation (II). Diese spiegelt den "`an"'-Zustand des Rezeptors wider. Wird Ethylen gebunden, geht der Rezeptor in eine semi-stabile Konformation (III) über, welche ebenfalls noch dem "`an"'-Zustand entspricht. Aus dieser Konformation wechselt \ac{ETR1} in den "`aus"'-Zustand (IV). Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand erfolgt wiederum mit Hilfe von \ac{RTE1}.}
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\label{fig:etr1_zustaende}
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\acronymused{SDS}
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\citation{dong_plasmapper:web_2004}
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|
||||
\acronymused{E. coli}
|
||||
\acronymused{RTE1}
|
||||
\acronymused{RTE1}
|
||||
\acronymused{IPTG}
|
||||
\acronymused{RTE1}
|
||||
\acronymused{RTE1}
|
||||
\@writefile{lof}{\contentsline {figure}{\numberline {3.1}{\ignorespaces Vektorkarte von pET-15b-RTE1}}{15}{figure.caption.25}}
|
||||
\newlabel{fig:vektor}{{3.1}{15}{Vektorkarte von pET-15b-RTE1\relax }{figure.caption.25}{}}
|
||||
\acronymused{E. coli}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsection}{\numberline {3.2.2}Expression in \acs {E. coli}}{16}{subsection.3.2.2}}
|
||||
\acronymused{IPTG}
|
||||
\newlabel{sec:expression}{{3.2.2}{16}{Expression in \acs {E. coli}\relax }{subsection.3.2.2}{}}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsection}{\numberline {3.2.3}Zellaufschluss}{16}{subsection.3.2.3}}
|
||||
\newlabel{sec:zellaufschluss}{{3.2.3}{16}{Zellaufschluss\relax }{subsection.3.2.3}{}}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsection}{\numberline {3.2.4}Native Reinigung}{16}{subsection.3.2.4}}
|
||||
\newlabel{sec:native_reinigung}{{3.2.4}{16}{Native Reinigung\relax }{subsection.3.2.4}{}}
|
||||
\undonewlabel{acro:IDA}
|
||||
\newlabel{acro:IDA}{{3.2.4}{16}{Native Reinigung\relax }{section*.26}{}}
|
||||
\acronymused{IDA}
|
||||
\acronymused{IDA}
|
||||
\citation{laemmli_cleavage_1970}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsection}{\numberline {3.2.5}Denaturierende Reinigung}{17}{subsection.3.2.5}}
|
||||
\newlabel{sec:denaturierende_reinigung}{{3.2.5}{17}{Denaturierende Reinigung\relax }{subsection.3.2.5}{}}
|
||||
\acronymused{IDA}
|
||||
\acronymused{SDS}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsection}{\numberline {3.2.6}\acs {SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese}{17}{subsection.3.2.6}}
|
||||
\newlabel{sec:sds_page}{{3.2.6}{17}{\acs {SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese\relax }{subsection.3.2.6}{}}
|
||||
\acronymused{SDS}
|
||||
\@writefile{lot}{\contentsline {table}{\numberline {3.2}{\ignorespaces Pipettierschema f\IeC {\"u}r SDS-Gele\relax }}{18}{table.caption.27}}
|
||||
\acronymused{TEMED}
|
||||
\acronymused{APS}
|
||||
\newlabel{tab:sds_rezept}{{3.2}{18}{Pipettierschema für SDS-Gele\relax \relax }{table.caption.27}{}}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsection}{\numberline {3.2.7}Silberf\IeC {\"a}rbung}{18}{subsection.3.2.7}}
|
||||
\newlabel{sec:silberfaerbung}{{3.2.7}{18}{Silberfärbung\relax }{subsection.3.2.7}{}}
|
||||
\@writefile{lot}{\contentsline {table}{\numberline {3.3}{\ignorespaces Silberf\IeC {\"a}rbung von Polyacrylamidgelen\relax }}{18}{table.caption.28}}
|
||||
\newlabel{tab:silberfaerbung}{{3.3}{18}{Silberfärbung von Polyacrylamidgelen\relax \relax }{table.caption.28}{}}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsection}{\numberline {3.2.8}Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen}{18}{subsection.3.2.8}}
|
||||
\newlabel{sec:westernblot}{{3.2.8}{18}{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen\relax }{subsection.3.2.8}{}}
|
||||
\citation{fischer_haemin_1999}
|
||||
\citation{tsutsui_affinity_1982}
|
||||
\undonewlabel{acro:HRP}
|
||||
\newlabel{acro:HRP}{{3.2.8}{19}{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen\relax }{section*.29}{}}
|
||||
\acronymused{HRP}
|
||||
\acronymused{HRP}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsection}{\numberline {3.2.9}Nachweis der H\IeC {\"a}minbindung}{19}{subsection.3.2.9}}
|
||||
\newlabel{sec:nachweis_haemin_bindung}{{3.2.9}{19}{Nachweis der Häminbindung\relax }{subsection.3.2.9}{}}
|
||||
\acronymused{RTE1}
|
||||
\undonewlabel{acro:CD}
|
||||
\newlabel{acro:CD}{{3.2.9}{19}{Nachweis der Häminbindung\relax }{section*.31}{}}
|
||||
\acronymused{CD}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsubsection}{Affinit\IeC {\"a}tschromatographie mit H\IeC {\"a}min-Agarose}{19}{section*.32}}
|
||||
\newlabel{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet}{{3.2.9}{19}{Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose\relax }{section*.32}{}}
|
||||
\citation{duncan_heme-binding_1999}
|
||||
\@writefile{lof}{\contentsline {figure}{\numberline {3.2}{\ignorespaces Struktur des H\IeC {\"a}mins}}{20}{figure.caption.30}}
|
||||
\newlabel{fig:haemin_struktur}{{3.2}{20}{Struktur des Hämins\relax }{figure.caption.30}{}}
|
||||
\acronymused{SDS}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsubsection}{Photometrie}{20}{section*.33}}
|
||||
\newlabel{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie}{{3.2.9}{20}{Photometrie\relax }{section*.33}{}}
|
||||
\acronymused{RTE1}
|
||||
\@writefile{lot}{\contentsline {table}{\numberline {3.4}{\ignorespaces H\IeC {\"a}min-Konzentration f\IeC {\"u}r photometrische Untersuchung\relax }}{21}{table.caption.34}}
|
||||
\newlabel{tab:haemin_konzentration_photometrie}{{3.4}{21}{Hämin-Konzentration für photometrische Untersuchung\relax \relax }{table.caption.34}{}}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsubsection}{Fluoreszenzspektroskopie}{21}{section*.35}}
|
||||
\newlabel{sec:nachweis_haemin_bindung_fluoreszenz}{{3.2.9}{21}{Fluoreszenzspektroskopie\relax }{section*.35}{}}
|
||||
\acronymused{CD}
|
||||
\@writefile{toc}{\contentsline {subsubsection}{\ac {CD}}{21}{section*.36}}
|
||||
\newlabel{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}{{3.2.9}{21}{\ac {CD}\relax }{section*.36}{}}
|
||||
\@setckpt{./inc/material}{
|
||||
\setcounter{page}{22}
|
||||
\setcounter{equation}{1}
|
||||
\setcounter{enumi}{0}
|
||||
\setcounter{enumii}{0}
|
||||
\setcounter{enumiii}{0}
|
||||
\setcounter{enumiv}{0}
|
||||
\setcounter{footnote}{0}
|
||||
\setcounter{mpfootnote}{0}
|
||||
\setcounter{part}{0}
|
||||
\setcounter{chapter}{3}
|
||||
\setcounter{section}{2}
|
||||
\setcounter{subsection}{9}
|
||||
\setcounter{subsubsection}{0}
|
||||
\setcounter{paragraph}{0}
|
||||
\setcounter{subparagraph}{0}
|
||||
\setcounter{figure}{2}
|
||||
\setcounter{table}{4}
|
||||
\setcounter{LT@tables}{1}
|
||||
\setcounter{LT@chunks}{2}
|
||||
\setcounter{KVtest}{2}
|
||||
\setcounter{subfigure}{0}
|
||||
\setcounter{subfigure@save}{0}
|
||||
\setcounter{lofdepth}{1}
|
||||
\setcounter{subtable}{0}
|
||||
\setcounter{subtable@save}{0}
|
||||
\setcounter{lotdepth}{1}
|
||||
\setcounter{parentequation}{0}
|
||||
\setcounter{mhchem@cf@length}{0}
|
||||
\setcounter{NAT@ctr}{0}
|
||||
\setcounter{ContinuedFloat}{0}
|
||||
\setcounter{Item}{0}
|
||||
\setcounter{bookmark@seq@number}{25}
|
||||
\setcounter{section@level}{3}
|
||||
}
|
||||
422
inc/material.tex
Normal file
422
inc/material.tex
Normal file
|
|
@ -0,0 +1,422 @@
|
|||
\chapter{Material und Methoden}
|
||||
\section{Material}
|
||||
\label{sec:material}
|
||||
|
||||
\begin{singlespace}
|
||||
\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
|
||||
\label{sec:geraete_hilfsmittel}
|
||||
|
||||
%\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Analysen-/Präzisionswaagen & Sartorius, Göttingen\\
|
||||
Autoklav & H+P Labortechnik, Oberschleißheim\\
|
||||
Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
|
||||
DNA-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
|
||||
Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
|
||||
Fluoreszenzspektrometer LS 55 & PerkinElmer, Rodgau\\
|
||||
%Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
|
||||
Hochdruckhomogenisator ("`French Press"') & Heinemann, Schwäbisch Gmünd\\
|
||||
Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\
|
||||
Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R & Eppendorf, Hamburg\\
|
||||
LAS-4000 mini (Luminescent Image Analyzer) & Fujifilm, Deutschland\\
|
||||
Magnetrührer MR 3000/3001 & Heidolph, Schwabach\\
|
||||
Mikrozentrifuge Minispin & Eppendorf, Hamburg\\
|
||||
Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage & Millipore, Schwalbach\\
|
||||
Minishaker MS 2 & IKA, Staufen\\
|
||||
Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
Spectrophotometer DU 800 & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwabach\\
|
||||
Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\
|
||||
Ultraschalldesintegrator Branson-Sonifier & Heinemann, Schwäbisch Gmünd\\
|
||||
Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
%\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Verbrauchsmaterialien}
|
||||
\label{sec:verbrauchsmaterialien}
|
||||
|
||||
%\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\
|
||||
Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
|
||||
Größenausschlusschromatographie PD-10 & GE-Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, SK\\
|
||||
Halbmikroküvetten & Hartenstein, Würzburg\\
|
||||
Hämin-Agarose & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Ni-IDA & Macherey-Nagel, Düren\\
|
||||
Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
|
||||
Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
|
||||
Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
|
||||
Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter}) & Merck, Bruchsal\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
%\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Standards für Proteinbestimmung und SDS-PAGE}
|
||||
\label{sec:standards}
|
||||
|
||||
%\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
BSA Standard for Protein Assay \SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter} & Qiagen, Hilden\\
|
||||
Precision Plus Protein Standards Dual Color/Unstained & Bio-Rad, München\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
%\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Chemikalien}
|
||||
\label{sec:chemikalien}
|
||||
|
||||
%\begin{center}
|
||||
% \begin{tabularx}{\textwidth}{XrX}
|
||||
\begin{longtable}{p{0.4\textwidth} r p{0.37\textwidth}}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
|
||||
Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
\acf{BisTris} & 6976-37-0 & Serva, Heidelberg\\
|
||||
Borsäure & 10043-35-3 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
Dinatriumhydrogenphosphat & 10028-24-7 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
Essigsäure & 64-19-7 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 \newline (n-Hexadecylphosphocholin) & 58066-85-6 & Affymetrix, Wooburn Green, UK\\
|
||||
Formaldehyd & 50-00-0 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
||||
Hämin & 16009-13-5 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Hefeextrakt & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
|
||||
Imidazol & 288-32-4 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
\acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
|
||||
Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Natriumacetat (wasserfrei) & 127-09-3 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Natriumcarbonat (wasserfrei) & 497-19-8 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\
|
||||
Natriumdihydrogenphosphat & 10049-21-5 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\
|
||||
Natriumthiosulfat & 10102-17-7 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Nickelsulfat & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
|
||||
Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
||||
Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
||||
Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Silbernitrat & 7761-88-8 & Honeywell Riedel-de-Ha\"{e}n, Seelze\\
|
||||
\acf{Tris} & 77-86-1 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Zitronensäure & 5949-29-1 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
% \end{tabularx}
|
||||
\end{longtable}
|
||||
%\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Antibiotoka-Stammlösungen}
|
||||
\label{sec:antibiotika_stammloesungen}
|
||||
%\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{XlX}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Antibiotikum} & \textbf{Konzentration} & \textbf{Lösungsmittel}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Ampicillin & \SI{100}{\milli\gram\per\milli\liter} & Wasser (demineralisiert, steril)\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
%\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für den Zellaufschluss}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{10}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
||||
\SI{10}{\percent} (v/v) Glycerin\\
|
||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für die native Reinigung}
|
||||
\label{sec:puffer_native_reinigung}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
|
||||
\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
|
||||
\item[Solubilisierungspuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
|
||||
\SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
|
||||
\item[Waschpuffer pH 7,5] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
|
||||
\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für die denaturierende Reinigung}
|
||||
\label{sec:puffer_denaturierende_reinigung}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
|
||||
\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
|
||||
\item[Solubilisierungspuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{8}{\Molar} Harnstoff
|
||||
\item[Waschpuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{8}{\Molar} Harnstoff
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE}
|
||||
\label{sec:puffer_sds_page}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30)] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\percent} Acrylamid\\
|
||||
\SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid
|
||||
\item[Entwickler] \hfill \\
|
||||
\SI{2,5}{\percent} (w/v) Natriumcarbonat (wasserfrei)\\
|
||||
\SI{0,02}{\percent} (v/v) Formaldehyd
|
||||
\item[Färbelösung] \hfill \\
|
||||
\SI{0,1}{\percent} (w/v) Silbernitrat\\
|
||||
\SI{0,02}{\percent} (v/v) Formaldehyd
|
||||
\item[Fixierer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\percent} (v/v) Ethanol\\
|
||||
\SI{10}{\percent} (v/v) Essigsäure
|
||||
\item[Inkubator] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\percent} (v/v) Ethanol\\
|
||||
\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumacetat (wasserfrei)\\
|
||||
\SI{0,2}{\percent} (w/v) Natriumthiosulfat
|
||||
\item[Laufpuffer, 10x] \hfill \\
|
||||
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}\\
|
||||
\SI{1,92}{\Molar} Glycin\\
|
||||
\SI{0,5}{\percent} \acs{SDS}
|
||||
\item[Sammelgelpuffer, 5x, pH 6,7] \hfill \\
|
||||
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
|
||||
\SI{0,5}{\percent} \acs{SDS}
|
||||
\item[Stopplösung] \hfill \\
|
||||
\SI{2,3}{\Molar} Zitronensäure
|
||||
\item[Trenngelpuffer, 2,5x, pH 8,9] \hfill \\
|
||||
\SI{1,875}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
|
||||
\SI{0,25}{\percent} \acs{SDS}
|
||||
\item[Probenpuffer, 4x] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Borsäure\\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} \acs{Tris}\\
|
||||
\SI{0,7}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
|
||||
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
|
||||
\SI{50}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
||||
\SI{6,7}{\percent} (w/v) \acs{SDS}\\
|
||||
\SI{16,7}{\percent} (w/v) Saccharose\\
|
||||
\SI{0,16}{\percent} (w/v) Bromphenolblau
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für den Westernblot}
|
||||
\label{sec:puffer_westernblot}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Transferpuffer] \hfill \\
|
||||
\item[TBS] \hfill \\
|
||||
\item[TBT] \hfill \\
|
||||
\item[Caseinlösung] \hfill \\
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\end{description}
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\subsection{Puffer und Lösungen für den Nachweis der Häminbindung}
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\label{sec:puffer_haeminbindung}
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\begin{description}
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\item[Häminlösung] \hfill \\
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\item[Puffer NP] \hfill \\
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\item[Waschpuffer pH 6,5] \hfill \\
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\item[Waschpuffer pH 8,5] \hfill \\
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\end{description}
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\end{singlespace}
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\section{Methoden}
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\label{sec:methoden}
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\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
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\label{sec:transformation}
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Zur Transformation von \ac{E. coli} wurde ein auf dem Vektor pET-15b der Firma Novagen basierendes Konstrukt eingesetzt. Hierbei wurde die \ac{RTE1}-kodierende Sequenz über die \textit{NdeI}-Schnittstelle hineinkloniert. N-terminal sitzt ein Hexa-His-Tag zur späteren affinitätschromatographischen Reinigung des Proteins. Das \acs{RTE1}-kodierende Gen befindet sich zwischen einem T7-Promotor bzw. -Terminator, so dass zur Transkription eine T7-RNA-Polymerase benötigt wird. Sowohl die Transkription der T7-RNA-Polymerase, als auch der T7-Promotor werden durch den Lac-Repressor (lacl) reprimiert. Durch Zugabe des Lactose-Analogons \ac{IPTG} löst sich der Repressor von den regulatorischen Sequenzen und ermöglicht zunächst die Transkription der T7-RNA-Polymerase, welche ihrerseits dann die für \ac{RTE1}-kodierende Sequenz transkribiert.
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Als Selektionsmarker vermittelt pET-15b eine Ampicillinresistenz. Das Konstrukt aus pET-15b und der \ac{RTE1}-kodierenden Sequenz wird im Folgenden als pET-15b-RTE1 bezeichnet.
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.8\textwidth]{./img/einleitung/vektor.png}
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% vektor.png: 1059x800 pixel, 72dpi, 37.36x28.22 cm, bb=0 0 1059 800
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\caption[Vektorkarte von pET-15b-RTE1]{Vektorkarte von pET-15b-RTE1. RTE1 ist rosa markiert und befindet sich zwischen Position 5377 und 6142. Die Vektorkarte wurde mit PlasMapper \citep{dong_plasmapper:web_2004} erstellt.}
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\label{fig:vektor}
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\end{figure}
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Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation: \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetente Zellen wrden auf Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-Lösung versetzt. Anschließend werden die Zellen für \SI{10}{\minute} auf Eis inkubiert. Es erfolgt ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} für \SI{90}{\second}. Die Zellen für \SI{2}{\minute} auf Eis und nach Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} 2YT-Medium für \SI{1}{\hour} unter leichtem Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
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Der Ansatz wurde dann auf 2YT-Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
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\subsection{Expression in \acs{E. coli}}
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Kompetente Zellen wurden wie in \ref{sec:transformation} beschrieben transformiert. Von den Platten wurden dann Vorkulturen mit einem Volumen von \SI{100}{\milli\liter} 2YT-Medium in \SI{250}{\milli\liter}-Kolben ohne Schikane angeimpft, mit \SI{100}{\micro\liter} Ampicillin-Lösung versetzt und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} inkubiert.
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Die Hauptkulturen mit einem Volumen von \SI{500}{\milli\liter} 2YT-Medium in schikanierten \SI{1}{\liter}-Kolben wurden mit \SI{500}{\micro\liter} Ampicillin-Lösung versetzt und mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert. Die Induktion erfolgte bei einer OD$_{\text{600}}$ von 0,6 bis 0,8 mit \SI{0,3}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
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Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von \SI{35}{\celsius} und nach der Induktion bei \SI{30}{\celsius}. \SI{4}{\hour} nach der Induktion wurden die Zellen bei \SI{7000}{\g} für \SI{10}{\minute} bei \SI{4}{\celsius} abzentrifugiert.
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\label{sec:expression}
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\subsection{Zellaufschluss}
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\label{sec:zellaufschluss}
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\SI{4}{\gram} eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch dreifache Hochdruckdispersion in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten French-Press$^\text{\textregistered}$ bei einem Druck von \SIrange{1200}{1500}{\psi}.
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%\subsection{Differentielle Zentrifugation}
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%\label{sec:differentielle_zentrifugation}
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\subsection{Native Reinigung}
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\label{sec:native_reinigung}
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Mit einem Poly-Histidin-Tag markierte Proteine lassen sich über eine Metallchelat"=Affinitätschromatographie aus einem Proteingemisch isolieren. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Säulenmaterial handelt es sich um \ac{IDA}, welche an Agarose immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \ac{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion der Poly-Histidin-markierten Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen.
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Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 versetzt. Die Solubilisierung erfolgte über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
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Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Scrhitten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
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Das Säulenmaterial wurde gemäß den Herstellerangaben vor der Wiederverwendung regeneriert und in \SI{20}{\percent} (v/v) Ethanol bei \SI{4}{\celsius} gelagert.
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\subsection{Denaturierende Reinigung}
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\label{sec:denaturierende_reinigung}
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Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
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Wasch- und Elutionspuffer enthielten ebenfalls \SI{8}{\Molar} Harnstoff.
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\subsection{\acs{SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\label{sec:sds_page}
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Die Proteinproben wurden auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen und dort nach ihrer Masse aufgetrennt \citep{laemmli_cleavage_1970}.
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Durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat \acs{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einer negativen Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Die Wanderungsgeschwindigkeit im dann angelegten elektrischen Feld durch das Gel ist somit allein von der Proteinmasse abhängig.
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Vor dem Auftrag auf das Gel wurden die Proben mit 4x-Probenpuffer versetzt. Expressionsproben wurden vor dem Auftragen für \SI{10}{\minute} auf \SI{95}{\celsius} erhitzt. Das Auftragsvolumen berechnete sich dann wie folgt:
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\begin{align}
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V[\si{\micro\liter}] = \frac{15}{\text{OD}_\text{600}} \cdot 0,75
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\end{align}
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Für die Elektrophorese wurden \SI{15}{\percent}ige Gele eingesetzt. Tabelle \ref{tab:sds_rezept} enthält ein Pipettierschema für drei kleine Gele der Größe \SI{9}{\centi\meter} x \SI{10}{\centi\meter}.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
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\begin{tabular}{lll}
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\toprule
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& \textbf{Trenngel} & \textbf{Sammelgel}\\
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\midrule
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AA/BAA 30 & \SI{16,5}{\milli\liter} & \SI{2}{\milli\liter}\\
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Trenn-/Sammelgelpuffer & \SI{12,9}{\milli\liter} & \SI{2,6}{\milli\liter}\\
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||||
Milli-Q-Wasser & \SI{3,6}{\milli\liter} & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
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||||
\acs{TEMED} & \SI{16,5}{\micro\liter} & \SI{12,3}{\micro\liter}\\
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\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112}{\micro\liter} & \SI{129}{\micro\liter}\\
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\bottomrule
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||||
\end{tabular}
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||||
\label{tab:sds_rezept}
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\end{table}
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Zur späteren Größenzuordnung wurden die in \ref{sec:standards} genannten Größenstandards eingesetzt. Nach dem Beladen wurde für etwa \SI{45}{\minute} \SI{35}{\milli\ampere} je Gel angelegt.
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\subsection{Silberfärbung}
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\label{sec:silberfaerbung}
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Mit Hilfe der Silberfärbung lassen sich Proteine in Polyacrylamidgelen bis zu einer Nachweisgrenze von etwa \SI{5}{\nano\gram} pro Bande detektieren.
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\ce{Ag+}-Ionen bilden Komplexe mit den Seitenketten der Aminosäuren Glutamat, Aspartat und Cystein aus und können durch formaldehydhaltige Natriumcarbonatlösung zu elementarem Silber reduziert werden. Hierdurch treten die Banden im Gel dunkelbraun bis schwarz hervor. Der Ablauf der Färbung ist Tabelle \ref{tab:silberfaerbung} zu entnehmen.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption{Silberfärbung von Polyacrylamidgelen}
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\begin{tabular}{lcc}
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\toprule
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\textbf{Lösung} & \textbf{Dauer} & \textbf{Wiederholungen}\\
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\midrule
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Fixierer & \SI{10}{\minute} & 1 \\
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Inkubator & \SI{10}{\minute} & 1 \\
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\ce{dH2O} & \SI{10}{\minute} & 3 \\
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||||
Färbelösung & \SI{10}{\minute} & 1 \\
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||||
\ce{dH2O} & kurzes Waschen & 1 \\
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\bottomrule
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||||
\end{tabular}
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||||
\label{tab:silberfaerbung}
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\end{table}
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Anschließend wurde das Gel mit Entwicklerlösung überschichtet und bis zur genügenden Ausprägung der Färbung geschwenkt. Die Färbung wurde durch Zugabe von \SI{2,3}{\Molar} Zitronensäure ($\frac{1}{10}$ des Volumens an Entwicklerlösung) gestoppt.
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%\subsection{Coomassie-Färbung}
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%\label{sec:coomassiefaerbung}
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\subsection{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen}
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\label{sec:westernblot}
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Über einen Westernblot können Proteine aus einem SDS-Gel elektrophoretisch auf einen Membran übertragen und dort fixiert werden. Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteinen auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.
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||||
Bei Gelen, welche für einen Westernblot vorgesehen waren, kam ein gefärbter Proteingrößenstandard zum Einsatz. Das Gel wurde für etwa \SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die benötigten Filterpapiere, sowie die Nitrozellulosemembran wurden ebenfalls kurz in Transferpuffer getränkt.
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Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von \SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.
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Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute} an.
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Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-HRP-Antikörper im Verhältnis 1:10000 enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten wiederum zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper ließ sich über die gekoppelte \ac{HRP} mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. die \ac{HRP} oxidiert in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es einer Lichtemission kommt.
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Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor (LAS 4000 mini, Fuji) eingesetzt.
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\subsection{Nachweis der Häminbindung}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung}
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Bei Häminen handelt es sich um Komplexverbindungen der Häme, wobei das Eisenion in der Oxidationsstufe +III vorliegt. Als axialen Liganden weisen sie ein Chlorid-Ion auf. Das Hämin b des Häm b wird als Hämin bezeichnet \citep{fischer_haemin_1999}.
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\begin{figure}[htbp]
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\centering
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\includegraphics[width=0.4\textwidth]{./img/material/hemin.pdf}
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% hemin.pdf: 211x185 pixel, 72dpi, 7.44x6.53 cm, bb=0 0 211 185
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\caption[Struktur des Hämins]{Struktur des Hämins (eigene Darstellung)}
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\label{fig:haemin_struktur}
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\end{figure}
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Für den Nachweis einer Häminbindung durch \ac{RTE1} kamen vier unterschiedliche Methoden zum Einsatz: Eine Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose, ein Photometrischer Nachweis über die Zugabe von freiem Hämin, der Nachweis über einen Tyrosin-Quench bei Zugabe von freiem Hämin sowie der Nachweis einer Sekundärstrukturänderung bei Häminzugabe über eine \ac{CD}-Spektroskopie.
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\subsubsection{Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet}
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Beim affinitätschromatographischen Nachweis wurde ein Säulenmaterial eingesetzt, bei welchem Hämin kovalent an Agarose als Trägermatrix gebunden ist. Hämin-bindende Proteine können dann an das immobilisierte Hämin binden. Die Elution kann entweder über die Zugabe von freiem Hämin, welches mit dem immobilisierten Hämin um die Bindung mit den Proteinen konkurriert, oder denaturierend über die Zugabe von \acs{SDS} und gleichzeitigem Erhitzen des Säulenmaterials erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam ein Batch-Verfahren zum Einsatz, welches den Nachweis einer Bindung mit vergleichsweise wenig Säulenmaterial ermöglicht \citep{tsutsui_affinity_1982}.
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\SI{50}{\micro\liter} Hämin-Agarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert.
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Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11,1}{\milli\Molar} Hämin-Lösung.
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\subsubsection{Photometrie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie}
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Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei häufig eine Rotverschiebung des Soret-Peaks zu beobachten \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bestimmt werden.
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Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}.
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||||
Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Hämin-Zugabe. Aus den Pufferspektren wurden dann über den Exktionktionskoeffizienten (Datenblatt des Herstellers) die tatsächliche Hämin-Konzentration in der Küvette bestimmt.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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||||
\caption{Hämin-Konzentration für photometrische Untersuchung}
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\begin{tabular}{rr}
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||||
\toprule
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||||
\textbf{Hämin-Konzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen [\si{\micro\liter}]}\\
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\midrule
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||||
0 & 0\\
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||||
2 & 0,9\\
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||||
4 & 0,9\\
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||||
6 & 0,9\\
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||||
8 & 0,9\\
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||||
10 & 0,9\\
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||||
15 & 2,3\\
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||||
20 & 2,3\\
|
||||
30 & 4,6\\
|
||||
40 & 4,6\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabular}
|
||||
\label{tab:haemin_konzentration_photometrie}
|
||||
\end{table}
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||||
\subsubsection{Fluoreszenzspektroskopie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_fluoreszenz}
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||||
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||||
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||||
\subsubsection{\ac{CD}}
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||||
\label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
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||||
404
inc/material.tex.backup
Normal file
404
inc/material.tex.backup
Normal file
|
|
@ -0,0 +1,404 @@
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|||
\chapter{Material und Methoden}
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||||
\section{Material}
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||||
\label{sec:material}
|
||||
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||||
\begin{singlespace}
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||||
\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
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||||
\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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||||
|
||||
\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Analysen-/Präzisionswaagen & Sartorius, Göttingen\\
|
||||
Autoklav & H+P Labortechnik, Oberschleißheim\\
|
||||
Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
|
||||
DNA-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
|
||||
Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
|
||||
Fluoreszenzspektrometer LS 55 & PerkinElmer, Rodgau\\
|
||||
%Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
|
||||
Hochdruckhomogenisator ("`French Press"') & Heinemann, Schwäbisch Gmünd\\
|
||||
Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\
|
||||
Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R & Eppendorf, Hamburg\\
|
||||
LAS-4000 mini (Luminescent Image Analyzer) & Fujifilm, Deutschland\\
|
||||
Magnetrührer MR 3000/3001 & Heidolph, Schwabach\\
|
||||
Mikrozentrifuge Minispin & Eppendorf, Hamburg\\
|
||||
Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage & Millipore, Schwalbach\\
|
||||
Minishaker MS 2 & IKA, Staufen\\
|
||||
Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
Spectrophotometer DU 800 & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwabach\\
|
||||
Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\
|
||||
Ultraschalldesintegrator Branson-Sonifier & Heinemann, Schwäbisch Gmünd\\
|
||||
Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Verbrauchsmaterialien}
|
||||
\label{sec:verbrauchsmaterialien}
|
||||
|
||||
\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\
|
||||
Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
|
||||
Größenausschlusschromatographie PD-10 & GE-Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, SK\\
|
||||
Halbmikroküvetten & Hartenstein, Würzburg\\
|
||||
Hämin-Agarose & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Ni-IDA & Macherey-Nagel, Düren\\
|
||||
Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
|
||||
Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
|
||||
Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
|
||||
Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter}) & Merck, Bruchsal\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Standards für Proteinbestimmung und SDS-PAGE}
|
||||
\label{sec:standards}
|
||||
|
||||
\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
BSA Standard for Protein Assay \SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter} & Qiagen, Hilden\\
|
||||
Precision Plus Protein Standards Dual Color/Unstained & Bio-Rad, München\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Chemikalien}
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||||
\label{sec:chemikalien}
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||||
|
||||
\begin{center}
|
||||
% \begin{tabularx}{\textwidth}{XrX}
|
||||
\begin{longtable}{p{0.4\textwidth} p{0.17\textwidth} p{0.35\textwidth}}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
|
||||
Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
\acf{BisTris} & 6976-37-0 & Serva, Heidelberg\\
|
||||
Borsäure & 10043-35-3 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
Dinatriumhydrogenphosphat & 10028-24-7 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
Essigsäure & 64-19-7 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 \newline (n-Hexadecylphosphocholin) & 58066-85-6 & Affymetrix, Wooburn Green, UK\\
|
||||
Formaldehyd & 50-00-0 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
||||
Hämin & 16009-13-5 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Hefeextrakt & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
|
||||
Imidazol & 288-32-4 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
\acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
|
||||
Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Natriumacetat (wasserfrei) & 127-09-3 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Natriumcarbonat (wasserfrei) & 497-19-8 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\
|
||||
Natriumdihydrogenphosphat & 10049-21-5 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\
|
||||
Natriumthiosulfat & 10102-17-7 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Nickelsulfat & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
|
||||
Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
||||
Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
||||
Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Silbernitrat & 7761-88-8 & Honeywell Riedel-de-Ha\"{e}n, Seelze\\
|
||||
\acf{Tris} & 77-86-1 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Zitronensäure & 5949-29-1 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
% \end{tabularx}
|
||||
\end{longtable}
|
||||
\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Antibiotoka-Stammlösungen}
|
||||
\label{sec:antibiotika_stammloesungen}
|
||||
\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{XlX}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Antibiotikum} & \textbf{Konzentration} & \textbf{Lösungsmittel}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Ampicillin & \SI{100}{\milli\gram\per\milli\liter} & Wasser (demineralisiert, steril)\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für den Zellaufschluss}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{10}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
||||
\SI{10}{\percent} (v/v) Glycerin\\
|
||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für die native Reinigung}
|
||||
\label{sec:puffer_native_reinigung}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
|
||||
\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
|
||||
\item[Solubilisierungspuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
|
||||
\SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
|
||||
\item[Waschpuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
|
||||
\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für die denaturierende Reinigung}
|
||||
\label{sec:puffer_denaturierende_reinigung}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
|
||||
\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
|
||||
\item[Solubilisierungspuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{8}{\Molar} Harnstoff
|
||||
\item[Waschpuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{8}{\Molar} Harnstoff
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für SDS-PAGE}
|
||||
\label{sec:puffer_sds_page}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30)] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\percent} Acrylamid\\
|
||||
\SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid
|
||||
\item[Entwickler] \hfill \\
|
||||
\SI{2,5}{\percent} (w/v) Natriumcarbonat (wasserfrei)\\
|
||||
\SI{0,02}{\percent} (v/v) Formaldehyd
|
||||
\item[Färbelösung] \hfill \\
|
||||
\SI{0,1}{\percent} (w/v) Silbernitrat\\
|
||||
\SI{0,02}{\percent} (v/v) Formaldehyd
|
||||
\item[Fixierer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\percent} (v/v) Ethanol\\
|
||||
\SI{10}{\percent} (v/v) Essigsäure
|
||||
\item[Inkubator] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\percent} (v/v) Ethanol\\
|
||||
\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumacetat (wasserfrei)\\
|
||||
\SI{0,2}{\percent} (w/v) Natriumthiosulfat
|
||||
\item[Laufpuffer, 10x] \hfill \\
|
||||
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}\\
|
||||
\SI{1,92}{\Molar} Glycin\\
|
||||
\SI{0,5}{\percent} \acs{SDS}
|
||||
\item[Sammelgelpuffer, 5x, pH 6,7] \hfill \\
|
||||
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
|
||||
\SI{0,5}{\percent} \acs{SDS}
|
||||
\item[Stopplösung] \hfill \\
|
||||
\SI{2,3}{\Molar} Zitronensäure
|
||||
\item[Trenngelpuffer, 2,5x, pH 8,9] \hfill \\
|
||||
\SI{1,875}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
|
||||
\SI{0,25}{\percent} \acs{SDS}
|
||||
\item[Probenpuffer, 4x] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Borsäure\\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} \acs{Tris}\\
|
||||
\SI{0,7}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
|
||||
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
|
||||
\SI{50}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
||||
\SI{6,7}{\percent} (w/v) \acs{SDS}\\
|
||||
\SI{16,7}{\percent} (w/v) Saccharose\\
|
||||
\SI{0,16}{\percent} (w/v) Bromphenolblau
|
||||
\end{description}
|
||||
\end{singlespace}
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||||
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||||
\section{Methoden}
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||||
\label{sec:methoden}
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||||
\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
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\label{sec:transformation}
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||||
Zur Transformation von \ac{E. coli} wurde ein auf dem Vektor pET-15b der Firma Novagen basierendes Konstrukt eingesetzt. Hierbei wurde die \ac{RTE1}-kodierende Sequenz über die \textit{NdeI}-Schnittstelle hineinkloniert. N-terminal sitzt ein Hexa-His-Tag zur späteren affinitätschromatographischen Reinigung des Proteins. Das \acs{RTE1}-kodierende Gen befindet sich zwischen einem T7-Promotor bzw. -Terminator, so dass zur Transkription eine T7-RNA-Polymerase benötigt wird. Sowohl die Transkription der T7-RNA-Polymerase, als auch der T7-Promotor werden durch den Lac-Repressor (lacl) reprimiert. Durch Zugabe des Lactose-Analogons \ac{IPTG} löst sich der Repressor von den regulatorischen Sequenzen und ermöglicht zunächst die Transkription der T7-RNA-Polymerase, welche ihrerseits dann die für \ac{RTE1}-kodierende Sequenz transkribiert.
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||||
Als Selektionsmarker vermittelt pET-15b eine Ampicillinresistenz. Das Konstrukt aus pET-15b und der \ac{RTE1}-kodierenden Sequenz wird im Folgenden als pET-15b-RTE1 bezeichnet.
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.8\textwidth]{./img/einleitung/vektor.png}
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% vektor.png: 1059x800 pixel, 72dpi, 37.36x28.22 cm, bb=0 0 1059 800
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||||
\caption[Vektorkarte von pET-15b-RTE1]{Vektorkarte von pET-15b-RTE1. RTE1 ist rosa markiert und befindet sich zwischen Position 5377 und 6142. Die Vektorkarte wurde mit PlasMapper \citep{dong_plasmapper:web_2004} erstellt.}
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\label{fig:vektor}
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||||
\end{figure}
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||||
Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation: \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetente Zellen wrden auf Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-Lösung versetzt. Anschließend werden die Zellen für \SI{10}{\minute} auf Eis inkubiert. Es erfolgt ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} für \SI{90}{\second}. Die Zellen für \SI{2}{\minute} auf Eis und nach Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} 2YT-Medium für \SI{1}{\hour} unter leichtem Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
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||||
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||||
Der Ansatz wurde dann auf 2YT-Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
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||||
\subsection{Expression in \acs{E. coli}}
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||||
Kompetente Zellen wurden wie in \ref{sec:transformation} beschrieben transformiert. Von den Platten wurden dann Vorkulturen mit einem Volumen von \SI{100}{\milli\liter} 2YT-Medium in \SI{250}{\milli\liter}-Kolben ohne Schikane angeimpft, mit \SI{100}{\micro\liter} Ampicillin-Lösung versetzt und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} inkubiert.
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||||
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||||
Die Hauptkulturen mit einem Volumen von \SI{500}{\milli\liter} 2YT-Medium in schikanierten \SI{1}{\liter}-Kolben wurden mit \SI{500}{\micro\liter} Ampicillin-Lösung versetzt und mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert. Die Induktion erfolgte bei einer OD$_{\text{600}}$ von 0,6 bis 0,8 mit \SI{0,3}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
|
||||
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||||
Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von \SI{35}{\celsius} und nach der Induktion bei \SI{30}{\celsius}. \SI{4}{\hour} nach der Induktion wurden die Zellen bei \SI{7000}{\g} für \SI{10}{\minute} bei \SI{4}{\celsius} abzentrifugiert.
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||||
\label{sec:expression}
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||||
\subsection{Zellaufschluss}
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||||
\label{sec:zellaufschluss}
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||||
\SI{4}{\gram} eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch dreifache Hochdruckdispersion in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten French-Press$^\text{\textregistered}$ bei einem Druck von \SIrange{1200}{1500}{\psi}.
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||||
%\subsection{Differentielle Zentrifugation}
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||||
%\label{sec:differentielle_zentrifugation}
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||||
\subsection{Native Reinigung}
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||||
\label{sec:native_reinigung}
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||||
Mit einem Poly-Histidin-Tag markierte Proteine lassen sich über eine Metallchelat"=Affinitätschromatographie aus einem Proteingemisch isolieren. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Säulenmaterial handelt es sich um \ac{IDA}, welche an Agarose immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \ac{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion der Poly-Histidin-markierten Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen.
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||||
Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 versetzt. Die Solubilisierung erfolgte über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
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||||
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||||
Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Scrhitten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
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||||
Das Säulenmaterial wurde gemäß den Herstellerangaben vor der Wiederverwendung regeneriert und in \SI{20}{\percent} (v/v) Ethanol bei \SI{4}{\celsius} gelagert.
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||||
\subsection{Denaturierende Reinigung}
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||||
\label{sec:denaturierende_reinigung}
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||||
Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
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||||
Wasch- und Elutionspuffer enthielten ebenfalls \SI{8}{\Molar} Harnstoff.
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||||
\subsection{\acs{SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\label{sec:sds_page}
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Die Proteinproben wurden auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen und dort nach ihrer Masse aufgetrennt \citep{laemmli_cleavage_1970}.
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||||
Durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat \acs{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einer negativen Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Die Wanderungsgeschwindigkeit im dann angelegten elektrischen Feld durch das Gel ist somit allein von der Proteinmasse abhängig.
|
||||
Vor dem Auftrag auf das Gel wurden die Proben mit 4x-Probenpuffer versetzt. Expressionsproben wurden vor dem Auftragen für \SI{10}{\minute} auf \SI{95}{\celsius} erhitzt. Das Auftragsvolumen berechnete sich dann wie folgt:
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||||
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||||
\begin{align}
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||||
V[\si{\micro\liter}] = \frac{15}{\text{OD}_\text{600}} \cdot 0,75
|
||||
\end{align}
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||||
|
||||
Für die Elektrophorese wurden \SI{15}{\percent}ige Gele eingesetzt. Tabelle \ref{tab:sds_rezept} enthält ein Pipettierschema für drei kleine Gele der Größe \SI{9}{\centi\meter} x \SI{10}{\centi\meter}.
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||||
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||||
\begin{table}[htb]
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||||
\centering
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||||
\caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
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||||
\begin{tabular}{lll}
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||||
\toprule
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||||
& \textbf{Trenngel} & \textbf{Sammelgel}\\
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||||
\midrule
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||||
AA/BAA 30 & \SI{16,5}{\milli\liter} & \SI{2}{\milli\liter}\\
|
||||
Trenn-/Sammelgelpuffer & \SI{12,9}{\milli\liter} & \SI{2,6}{\milli\liter}\\
|
||||
Milli-Q-Wasser & \SI{3,6}{\milli\liter} & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
|
||||
\acs{TEMED} & \SI{16,5}{\micro\liter} & \SI{12,3}{\micro\liter}\\
|
||||
\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112}{\micro\liter} & \SI{129}{\micro\liter}\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabular}
|
||||
\label{tab:sds_rezept}
|
||||
\end{table}
|
||||
|
||||
Zur späteren Größenzuordnung wurden die in \ref{sec:standards} genannten Größenstandards eingesetzt. Nach dem Beladen wurde für etwa \SI{45}{\minute} \SI{35}{\milli\ampere} je Gel angelegt.
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||||
|
||||
\subsection{Silberfärbung}
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||||
\label{sec:silberfaerbung}
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||||
Mit Hilfe der Silberfärbung lassen sich Proteine in Polyacrylamidgelen bis zu einer Nachweisgrenze von etwa \SI{5}{\nano\gram} pro Bande detektieren.
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||||
\ce{Ag+}-Ionen bilden Komplexe mit den Seitenketten der Aminosäuren Glutamat, Aspartat und Cystein aus und können durch formaldehydhaltige Natriumcarbonatlösung zu elementarem Silber reduziert werden. Hierdurch treten die Banden im Gel dunkelbraun bis schwarz hervor. Der Ablauf der Färbung ist Tabelle \ref{tab:silberfaerbung} zu entnehmen.
|
||||
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||||
\begin{table}[htb]
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||||
\centering
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||||
\caption{Silberfärbung von Polyacrylamidgelen}
|
||||
\begin{tabular}{lcc}
|
||||
\toprule
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||||
\textbf{Lösung} & \textbf{Dauer} & \textbf{Wiederholungen}\\
|
||||
\midrule
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||||
Fixierer & \SI{10}{\minute} & 1 \\
|
||||
Inkubator & \SI{10}{\minute} & 1 \\
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||||
\ce{dH2O} & \SI{10}{\minute} & 3 \\
|
||||
Färbelösung & \SI{10}{\minute} & 1 \\
|
||||
\ce{dH2O} & kurzes Waschen & 1 \\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabular}
|
||||
\label{tab:silberfaerbung}
|
||||
\end{table}
|
||||
|
||||
Anschließend wurde das Gel mit Entwicklerlösung überschichtet und bis zur genügenden Ausprägung der Färbung geschwenkt. Die Färbung wurde durch Zugabe von \SI{2,3}{\Molar} Zitronensäure ($\frac{1}{10}$ des Volumens an Entwicklerlösung) gestoppt.
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||||
|
||||
%\subsection{Coomassie-Färbung}
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||||
%\label{sec:coomassiefaerbung}
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||||
\subsection{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen}
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||||
\label{sec:westernblot}
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||||
Über einen Westernblot können Proteine aus einem SDS-Gel elektrophoretisch auf einen Membran übertragen und dort fixiert werden. Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteinen auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.
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||||
Bei Gelen, welche für einen Westernblot vorgesehen waren, kam ein gefärbter Proteingrößenstandard zum Einsatz. Das Gel wurde für etwa \SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die benötigten Filterpapiere, sowie die Nitrozellulosemembran wurden ebenfalls kurz in Transferpuffer getränkt.
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||||
Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von \SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.
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||||
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||||
Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute} an.
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||||
Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-HRP-Antikörper im Verhältnis 1:10000 enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten wiederum zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper ließ sich über die gekoppelte \ac{HRP} mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. die \ac{HRP} oxidiert in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es einer Lichtemission kommt.
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||||
Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor (LAS 4000 mini, Fuji) eingesetzt.
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\subsection{Nachweis der Häminbindung}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung}
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||||
Bei Häminen handelt es sich um Komplexverbindungen der Häme, wobei das Eisenion in der Oxidationsstufe +III vorliegt. Als axialen Liganden weisen sie ein Chlorid-Ion auf. Das Hämin b des Häm b wird als Hämin bezeichnet \citep{fischer_haemin_1999}.
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\begin{figure}[htbp]
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\centering
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\includegraphics[width=0.4\textwidth]{./img/material/hemin.pdf}
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% hemin.pdf: 211x185 pixel, 72dpi, 7.44x6.53 cm, bb=0 0 211 185
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\caption[Struktur des Hämins]{Struktur des Hämins (eigene Darstellung)}
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\label{fig:haemin_struktur}
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\end{figure}
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||||
Für den Nachweis einer Häminbindung durch \ac{RTE1} kamen vier unterschiedliche Methoden zum Einsatz: Eine Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose, ein Photometrischer Nachweis über die Zugabe von freiem Hämin, der Nachweis über einen Tyrosin-Quench bei Zugabe von freiem Hämin sowie der Nachweis einer Sekundärstrukturänderung bei Häminzugabe über eine \ac{CD}-Spektroskopie.
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||||
\subsubsection{Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose}
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||||
\label{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet}
|
||||
Beim affinitätschromatographischen Nachweis wurde ein Säulenmaterial eingesetzt, bei welchem Hämin kovalent an Agarose als Trägermatrix gebunden ist. Hämin-bindende Proteine können dann an das immobilisierte Hämin binden. Die Elution kann entweder über die Zugabe von freiem Hämin, welches mit dem immobilisierten Hämin um die Bindung mit den Proteinen konkurriert, oder denaturierend über die Zugabe von \acs{SDS} und gleichzeitigem Erhitzen des Säulenmaterials erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam ein Batch-Verfahren zum Einsatz, welches den Nachweis einer Bindung mit vergleichsweise wenig Säulenmaterial ermöglicht \citep{tsutsui_affinity_1982}.
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||||
\SI{50}{\micro\liter} Hämin-Agarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert.
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||||
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||||
Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11,1}{\milli\Molar} Hämin-Lösung.
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||||
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||||
\subsubsection{Photometrie}
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||||
\label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie}
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||||
Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei häufig eine Rotverschiebung des Soret-Peaks zu beobachten \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bestimmt werden.
|
||||
|
||||
Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}.
|
||||
Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Hämin-Zugabe. Aus den Pufferspektren wurden dann über den Exktionktionskoeffizienten (Datenblatt des Herstellers) die tatsächliche Hämin-Konzentration in der Küvette bestimmt.
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||||
|
||||
\begin{table}[htb]
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||||
\centering
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||||
\caption{Hämin-Konzentration für photometrische Untersuchung}
|
||||
\begin{tabular}{rr}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Hämin-Konzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen [\si{\micro\liter}]}\\
|
||||
\midrule
|
||||
0 & 0\\
|
||||
2 & 0,9\\
|
||||
4 & 0,9\\
|
||||
6 & 0,9\\
|
||||
8 & 0,9\\
|
||||
10 & 0,9\\
|
||||
15 & 2,3\\
|
||||
20 & 2,3\\
|
||||
30 & 4,6\\
|
||||
40 & 4,6\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabular}
|
||||
\label{tab:haemin_konzentration_photometrie}
|
||||
\end{table}
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||||
|
||||
\subsubsection{Fluoreszenzspektroskopie}
|
||||
\label{sec:nachweis_haemin_bindung_fluoreszenz}
|
||||
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||||
|
||||
\subsubsection{\ac{CD}}
|
||||
\label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
|
||||
421
inc/material.tex~
Normal file
421
inc/material.tex~
Normal file
|
|
@ -0,0 +1,421 @@
|
|||
\chapter{Material und Methoden}
|
||||
\section{Material}
|
||||
\label{sec:material}
|
||||
|
||||
\begin{singlespace}
|
||||
\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
|
||||
\label{sec:geraete_hilfsmittel}
|
||||
|
||||
%\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Analysen-/Präzisionswaagen & Sartorius, Göttingen\\
|
||||
Autoklav & H+P Labortechnik, Oberschleißheim\\
|
||||
Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
|
||||
DNA-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
|
||||
Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
|
||||
Fluoreszenzspektrometer LS 55 & PerkinElmer, Rodgau\\
|
||||
%Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
|
||||
Hochdruckhomogenisator ("`French Press"') & Heinemann, Schwäbisch Gmünd\\
|
||||
Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\
|
||||
Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R & Eppendorf, Hamburg\\
|
||||
LAS-4000 mini (Luminescent Image Analyzer) & Fujifilm, Deutschland\\
|
||||
Magnetrührer MR 3000/3001 & Heidolph, Schwabach\\
|
||||
Mikrozentrifuge Minispin & Eppendorf, Hamburg\\
|
||||
Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage & Millipore, Schwalbach\\
|
||||
Minishaker MS 2 & IKA, Staufen\\
|
||||
Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
Spectrophotometer DU 800 & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwabach\\
|
||||
Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\
|
||||
Ultraschalldesintegrator Branson-Sonifier & Heinemann, Schwäbisch Gmünd\\
|
||||
Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
%\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Verbrauchsmaterialien}
|
||||
\label{sec:verbrauchsmaterialien}
|
||||
|
||||
%\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\
|
||||
Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
|
||||
Größenausschlusschromatographie PD-10 & GE-Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, SK\\
|
||||
Halbmikroküvetten & Hartenstein, Würzburg\\
|
||||
Hämin-Agarose & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Ni-IDA & Macherey-Nagel, Düren\\
|
||||
Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
|
||||
Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
|
||||
Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
|
||||
Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter}) & Merck, Bruchsal\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
%\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Standards für Proteinbestimmung und SDS-PAGE}
|
||||
\label{sec:standards}
|
||||
|
||||
%\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
BSA Standard for Protein Assay \SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter} & Qiagen, Hilden\\
|
||||
Precision Plus Protein Standards Dual Color/Unstained & Bio-Rad, München\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
%\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Chemikalien}
|
||||
\label{sec:chemikalien}
|
||||
|
||||
%\begin{center}
|
||||
% \begin{tabularx}{\textwidth}{XrX}
|
||||
\begin{longtable}{p{0.4\textwidth} r p{0.37\textwidth}}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
|
||||
Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
\acf{BisTris} & 6976-37-0 & Serva, Heidelberg\\
|
||||
Borsäure & 10043-35-3 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
Dinatriumhydrogenphosphat & 10028-24-7 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
Essigsäure & 64-19-7 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 \newline (n-Hexadecylphosphocholin) & 58066-85-6 & Affymetrix, Wooburn Green, UK\\
|
||||
Formaldehyd & 50-00-0 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
||||
Hämin & 16009-13-5 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Hefeextrakt & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
|
||||
Imidazol & 288-32-4 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
\acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
|
||||
Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Natriumacetat (wasserfrei) & 127-09-3 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Natriumcarbonat (wasserfrei) & 497-19-8 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\
|
||||
Natriumdihydrogenphosphat & 10049-21-5 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\
|
||||
Natriumthiosulfat & 10102-17-7 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Nickelsulfat & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
|
||||
Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
|
||||
Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
|
||||
Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
|
||||
Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
||||
Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
||||
Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Silbernitrat & 7761-88-8 & Honeywell Riedel-de-Ha\"{e}n, Seelze\\
|
||||
\acf{Tris} & 77-86-1 & VWR, Darmstadt\\
|
||||
Zitronensäure & 5949-29-1 & Grüssing, Filsum\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
% \end{tabularx}
|
||||
\end{longtable}
|
||||
%\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Antibiotoka-Stammlösungen}
|
||||
\label{sec:antibiotika_stammloesungen}
|
||||
%\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{XlX}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Antibiotikum} & \textbf{Konzentration} & \textbf{Lösungsmittel}\\
|
||||
\midrule
|
||||
Ampicillin & \SI{100}{\milli\gram\per\milli\liter} & Wasser (demineralisiert, steril)\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabularx}
|
||||
%\end{center}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für den Zellaufschluss}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{10}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
||||
\SI{10}{\percent} (v/v) Glycerin\\
|
||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für die native Reinigung}
|
||||
\label{sec:puffer_native_reinigung}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
|
||||
\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
|
||||
\item[Solubilisierungspuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
|
||||
\SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
|
||||
\item[Waschpuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
|
||||
\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für die denaturierende Reinigung}
|
||||
\label{sec:puffer_denaturierende_reinigung}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
|
||||
\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
|
||||
\item[Solubilisierungspuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{8}{\Molar} Harnstoff
|
||||
\item[Waschpuffer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
|
||||
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{8}{\Molar} Harnstoff
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE}
|
||||
\label{sec:puffer_sds_page}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30)] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\percent} Acrylamid\\
|
||||
\SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid
|
||||
\item[Entwickler] \hfill \\
|
||||
\SI{2,5}{\percent} (w/v) Natriumcarbonat (wasserfrei)\\
|
||||
\SI{0,02}{\percent} (v/v) Formaldehyd
|
||||
\item[Färbelösung] \hfill \\
|
||||
\SI{0,1}{\percent} (w/v) Silbernitrat\\
|
||||
\SI{0,02}{\percent} (v/v) Formaldehyd
|
||||
\item[Fixierer] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\percent} (v/v) Ethanol\\
|
||||
\SI{10}{\percent} (v/v) Essigsäure
|
||||
\item[Inkubator] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\percent} (v/v) Ethanol\\
|
||||
\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumacetat (wasserfrei)\\
|
||||
\SI{0,2}{\percent} (w/v) Natriumthiosulfat
|
||||
\item[Laufpuffer, 10x] \hfill \\
|
||||
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}\\
|
||||
\SI{1,92}{\Molar} Glycin\\
|
||||
\SI{0,5}{\percent} \acs{SDS}
|
||||
\item[Sammelgelpuffer, 5x, pH 6,7] \hfill \\
|
||||
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
|
||||
\SI{0,5}{\percent} \acs{SDS}
|
||||
\item[Stopplösung] \hfill \\
|
||||
\SI{2,3}{\Molar} Zitronensäure
|
||||
\item[Trenngelpuffer, 2,5x, pH 8,9] \hfill \\
|
||||
\SI{1,875}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
|
||||
\SI{0,25}{\percent} \acs{SDS}
|
||||
\item[Probenpuffer, 4x] \hfill \\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} Borsäure\\
|
||||
\SI{30}{\milli\Molar} \acs{Tris}\\
|
||||
\SI{0,7}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
|
||||
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
|
||||
\SI{50}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
||||
\SI{6,7}{\percent} (w/v) \acs{SDS}\\
|
||||
\SI{16,7}{\percent} (w/v) Saccharose\\
|
||||
\SI{0,16}{\percent} (w/v) Bromphenolblau
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für den Westernblot}
|
||||
\label{sec:puffer_westernblot}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Transferpuffer] \hfill \\
|
||||
\item[TBS] \hfill \\
|
||||
\item[TBT] \hfill \\
|
||||
\item[Caseinlösung] \hfill \\
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
\subsection{Puffer und Lösungen für den Nachweis der Häminbindung}
|
||||
\label{sec:puffer_haeminbindung}
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[Häminlösung] \hfill \\
|
||||
\item[Puffer NP] \hfill \\
|
||||
\item[Waschpuffer pH 6,5] \hfill \\
|
||||
\end{description}
|
||||
\end{singlespace}
|
||||
|
||||
\section{Methoden}
|
||||
\label{sec:methoden}
|
||||
|
||||
\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
|
||||
\label{sec:transformation}
|
||||
Zur Transformation von \ac{E. coli} wurde ein auf dem Vektor pET-15b der Firma Novagen basierendes Konstrukt eingesetzt. Hierbei wurde die \ac{RTE1}-kodierende Sequenz über die \textit{NdeI}-Schnittstelle hineinkloniert. N-terminal sitzt ein Hexa-His-Tag zur späteren affinitätschromatographischen Reinigung des Proteins. Das \acs{RTE1}-kodierende Gen befindet sich zwischen einem T7-Promotor bzw. -Terminator, so dass zur Transkription eine T7-RNA-Polymerase benötigt wird. Sowohl die Transkription der T7-RNA-Polymerase, als auch der T7-Promotor werden durch den Lac-Repressor (lacl) reprimiert. Durch Zugabe des Lactose-Analogons \ac{IPTG} löst sich der Repressor von den regulatorischen Sequenzen und ermöglicht zunächst die Transkription der T7-RNA-Polymerase, welche ihrerseits dann die für \ac{RTE1}-kodierende Sequenz transkribiert.
|
||||
|
||||
Als Selektionsmarker vermittelt pET-15b eine Ampicillinresistenz. Das Konstrukt aus pET-15b und der \ac{RTE1}-kodierenden Sequenz wird im Folgenden als pET-15b-RTE1 bezeichnet.
|
||||
|
||||
\begin{figure}[htbp!]
|
||||
\centering
|
||||
\includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.8\textwidth]{./img/einleitung/vektor.png}
|
||||
% vektor.png: 1059x800 pixel, 72dpi, 37.36x28.22 cm, bb=0 0 1059 800
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\caption[Vektorkarte von pET-15b-RTE1]{Vektorkarte von pET-15b-RTE1. RTE1 ist rosa markiert und befindet sich zwischen Position 5377 und 6142. Die Vektorkarte wurde mit PlasMapper \citep{dong_plasmapper:web_2004} erstellt.}
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\label{fig:vektor}
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\end{figure}
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Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation: \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetente Zellen wrden auf Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-Lösung versetzt. Anschließend werden die Zellen für \SI{10}{\minute} auf Eis inkubiert. Es erfolgt ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} für \SI{90}{\second}. Die Zellen für \SI{2}{\minute} auf Eis und nach Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} 2YT-Medium für \SI{1}{\hour} unter leichtem Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
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Der Ansatz wurde dann auf 2YT-Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
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\subsection{Expression in \acs{E. coli}}
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Kompetente Zellen wurden wie in \ref{sec:transformation} beschrieben transformiert. Von den Platten wurden dann Vorkulturen mit einem Volumen von \SI{100}{\milli\liter} 2YT-Medium in \SI{250}{\milli\liter}-Kolben ohne Schikane angeimpft, mit \SI{100}{\micro\liter} Ampicillin-Lösung versetzt und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} inkubiert.
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Die Hauptkulturen mit einem Volumen von \SI{500}{\milli\liter} 2YT-Medium in schikanierten \SI{1}{\liter}-Kolben wurden mit \SI{500}{\micro\liter} Ampicillin-Lösung versetzt und mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert. Die Induktion erfolgte bei einer OD$_{\text{600}}$ von 0,6 bis 0,8 mit \SI{0,3}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
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Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von \SI{35}{\celsius} und nach der Induktion bei \SI{30}{\celsius}. \SI{4}{\hour} nach der Induktion wurden die Zellen bei \SI{7000}{\g} für \SI{10}{\minute} bei \SI{4}{\celsius} abzentrifugiert.
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\label{sec:expression}
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\subsection{Zellaufschluss}
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\label{sec:zellaufschluss}
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\SI{4}{\gram} eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch dreifache Hochdruckdispersion in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten French-Press$^\text{\textregistered}$ bei einem Druck von \SIrange{1200}{1500}{\psi}.
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%\subsection{Differentielle Zentrifugation}
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%\label{sec:differentielle_zentrifugation}
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\subsection{Native Reinigung}
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\label{sec:native_reinigung}
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Mit einem Poly-Histidin-Tag markierte Proteine lassen sich über eine Metallchelat"=Affinitätschromatographie aus einem Proteingemisch isolieren. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Säulenmaterial handelt es sich um \ac{IDA}, welche an Agarose immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \ac{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion der Poly-Histidin-markierten Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen.
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Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 versetzt. Die Solubilisierung erfolgte über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
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Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Scrhitten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
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Das Säulenmaterial wurde gemäß den Herstellerangaben vor der Wiederverwendung regeneriert und in \SI{20}{\percent} (v/v) Ethanol bei \SI{4}{\celsius} gelagert.
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\subsection{Denaturierende Reinigung}
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\label{sec:denaturierende_reinigung}
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Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
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Wasch- und Elutionspuffer enthielten ebenfalls \SI{8}{\Molar} Harnstoff.
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\subsection{\acs{SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\label{sec:sds_page}
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Die Proteinproben wurden auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen und dort nach ihrer Masse aufgetrennt \citep{laemmli_cleavage_1970}.
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Durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat \acs{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einer negativen Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Die Wanderungsgeschwindigkeit im dann angelegten elektrischen Feld durch das Gel ist somit allein von der Proteinmasse abhängig.
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Vor dem Auftrag auf das Gel wurden die Proben mit 4x-Probenpuffer versetzt. Expressionsproben wurden vor dem Auftragen für \SI{10}{\minute} auf \SI{95}{\celsius} erhitzt. Das Auftragsvolumen berechnete sich dann wie folgt:
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\begin{align}
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V[\si{\micro\liter}] = \frac{15}{\text{OD}_\text{600}} \cdot 0,75
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\end{align}
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Für die Elektrophorese wurden \SI{15}{\percent}ige Gele eingesetzt. Tabelle \ref{tab:sds_rezept} enthält ein Pipettierschema für drei kleine Gele der Größe \SI{9}{\centi\meter} x \SI{10}{\centi\meter}.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
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\begin{tabular}{lll}
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\toprule
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& \textbf{Trenngel} & \textbf{Sammelgel}\\
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\midrule
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AA/BAA 30 & \SI{16,5}{\milli\liter} & \SI{2}{\milli\liter}\\
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Trenn-/Sammelgelpuffer & \SI{12,9}{\milli\liter} & \SI{2,6}{\milli\liter}\\
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Milli-Q-Wasser & \SI{3,6}{\milli\liter} & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
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\acs{TEMED} & \SI{16,5}{\micro\liter} & \SI{12,3}{\micro\liter}\\
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\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112}{\micro\liter} & \SI{129}{\micro\liter}\\
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\bottomrule
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\end{tabular}
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\label{tab:sds_rezept}
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\end{table}
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Zur späteren Größenzuordnung wurden die in \ref{sec:standards} genannten Größenstandards eingesetzt. Nach dem Beladen wurde für etwa \SI{45}{\minute} \SI{35}{\milli\ampere} je Gel angelegt.
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\subsection{Silberfärbung}
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\label{sec:silberfaerbung}
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Mit Hilfe der Silberfärbung lassen sich Proteine in Polyacrylamidgelen bis zu einer Nachweisgrenze von etwa \SI{5}{\nano\gram} pro Bande detektieren.
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\ce{Ag+}-Ionen bilden Komplexe mit den Seitenketten der Aminosäuren Glutamat, Aspartat und Cystein aus und können durch formaldehydhaltige Natriumcarbonatlösung zu elementarem Silber reduziert werden. Hierdurch treten die Banden im Gel dunkelbraun bis schwarz hervor. Der Ablauf der Färbung ist Tabelle \ref{tab:silberfaerbung} zu entnehmen.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption{Silberfärbung von Polyacrylamidgelen}
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\begin{tabular}{lcc}
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\toprule
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\textbf{Lösung} & \textbf{Dauer} & \textbf{Wiederholungen}\\
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\midrule
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Fixierer & \SI{10}{\minute} & 1 \\
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Inkubator & \SI{10}{\minute} & 1 \\
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\ce{dH2O} & \SI{10}{\minute} & 3 \\
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Färbelösung & \SI{10}{\minute} & 1 \\
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\ce{dH2O} & kurzes Waschen & 1 \\
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\bottomrule
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\end{tabular}
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\label{tab:silberfaerbung}
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\end{table}
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Anschließend wurde das Gel mit Entwicklerlösung überschichtet und bis zur genügenden Ausprägung der Färbung geschwenkt. Die Färbung wurde durch Zugabe von \SI{2,3}{\Molar} Zitronensäure ($\frac{1}{10}$ des Volumens an Entwicklerlösung) gestoppt.
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%\subsection{Coomassie-Färbung}
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%\label{sec:coomassiefaerbung}
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\subsection{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen}
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\label{sec:westernblot}
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Über einen Westernblot können Proteine aus einem SDS-Gel elektrophoretisch auf einen Membran übertragen und dort fixiert werden. Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteinen auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.
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Bei Gelen, welche für einen Westernblot vorgesehen waren, kam ein gefärbter Proteingrößenstandard zum Einsatz. Das Gel wurde für etwa \SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die benötigten Filterpapiere, sowie die Nitrozellulosemembran wurden ebenfalls kurz in Transferpuffer getränkt.
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Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von \SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.
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Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute} an.
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Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-HRP-Antikörper im Verhältnis 1:10000 enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten wiederum zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper ließ sich über die gekoppelte \ac{HRP} mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. die \ac{HRP} oxidiert in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es einer Lichtemission kommt.
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Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor (LAS 4000 mini, Fuji) eingesetzt.
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\subsection{Nachweis der Häminbindung}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung}
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Bei Häminen handelt es sich um Komplexverbindungen der Häme, wobei das Eisenion in der Oxidationsstufe +III vorliegt. Als axialen Liganden weisen sie ein Chlorid-Ion auf. Das Hämin b des Häm b wird als Hämin bezeichnet \citep{fischer_haemin_1999}.
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\begin{figure}[htbp]
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\centering
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\includegraphics[width=0.4\textwidth]{./img/material/hemin.pdf}
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% hemin.pdf: 211x185 pixel, 72dpi, 7.44x6.53 cm, bb=0 0 211 185
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\caption[Struktur des Hämins]{Struktur des Hämins (eigene Darstellung)}
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\label{fig:haemin_struktur}
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\end{figure}
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Für den Nachweis einer Häminbindung durch \ac{RTE1} kamen vier unterschiedliche Methoden zum Einsatz: Eine Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose, ein Photometrischer Nachweis über die Zugabe von freiem Hämin, der Nachweis über einen Tyrosin-Quench bei Zugabe von freiem Hämin sowie der Nachweis einer Sekundärstrukturänderung bei Häminzugabe über eine \ac{CD}-Spektroskopie.
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\subsubsection{Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet}
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Beim affinitätschromatographischen Nachweis wurde ein Säulenmaterial eingesetzt, bei welchem Hämin kovalent an Agarose als Trägermatrix gebunden ist. Hämin-bindende Proteine können dann an das immobilisierte Hämin binden. Die Elution kann entweder über die Zugabe von freiem Hämin, welches mit dem immobilisierten Hämin um die Bindung mit den Proteinen konkurriert, oder denaturierend über die Zugabe von \acs{SDS} und gleichzeitigem Erhitzen des Säulenmaterials erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam ein Batch-Verfahren zum Einsatz, welches den Nachweis einer Bindung mit vergleichsweise wenig Säulenmaterial ermöglicht \citep{tsutsui_affinity_1982}.
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\SI{50}{\micro\liter} Hämin-Agarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert.
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Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11,1}{\milli\Molar} Hämin-Lösung.
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\subsubsection{Photometrie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie}
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Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei häufig eine Rotverschiebung des Soret-Peaks zu beobachten \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bestimmt werden.
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Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}.
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Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Hämin-Zugabe. Aus den Pufferspektren wurden dann über den Exktionktionskoeffizienten (Datenblatt des Herstellers) die tatsächliche Hämin-Konzentration in der Küvette bestimmt.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption{Hämin-Konzentration für photometrische Untersuchung}
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\begin{tabular}{rr}
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\toprule
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\textbf{Hämin-Konzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen [\si{\micro\liter}]}\\
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\midrule
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0 & 0\\
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2 & 0,9\\
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4 & 0,9\\
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6 & 0,9\\
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8 & 0,9\\
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10 & 0,9\\
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15 & 2,3\\
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20 & 2,3\\
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30 & 4,6\\
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40 & 4,6\\
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\bottomrule
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||||
\end{tabular}
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\label{tab:haemin_konzentration_photometrie}
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\end{table}
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\subsubsection{Fluoreszenzspektroskopie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_fluoreszenz}
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\subsubsection{\ac{CD}}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
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39
inc/zusammenfassung.aux
Normal file
39
inc/zusammenfassung.aux
Normal file
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@ -0,0 +1,39 @@
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\relax
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||||
\@writefile{toc}{\contentsline {chapter}{\numberline {1}Zusammenfassung}{4}{chapter.1}}
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||||
\@writefile{lof}{\addvspace {10\p@ }}
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\@writefile{lot}{\addvspace {10\p@ }}
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\@setckpt{./inc/zusammenfassung}{
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