Rollback auf pdflatex; Korrekturen
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Alexander Ralph Michael Minges
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e69a7a7aca
commit
ab0323be03
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@ -1,19 +1,14 @@
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\documentclass[a4paper,fontsize=13pt,titlepage=true,toc=bibliography,captions=tableheading,DIV=12,BCOR=1cm]{scrreprt} %Dokumentenklasse
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\documentclass[a4paper,fontsize=13pt,utf8,titlepage=true,toc=bibliography,captions=tableheading,DIV=12,BCOR=1cm]{scrreprt} %Dokumentenklasse
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\usepackage{xunicode}
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\usepackage[utf8]{inputenc} % Eingabekodierung UTF-8
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\usepackage{xltxtra}
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\usepackage[T1]{fontenc} % Schriftkodierung
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%\usepackage[utf8x]{inputenc} % Eingabekodierung UTF-8
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\usepackage{libertine} % Schriftarten 'Linux Libertine' und 'Linux Biolinum'
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%\usepackage[T1]{fontenc} % Schriftkodierung
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\usepackage[ngerman]{babel} % Neue Deutsche Rechtschreibung/Silbentrennung mit griechischen Buchstaben
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%\usepackage{tipa} % Phonetische Symbole (z.B. %textbeta)
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\usepackage{etoolbox}
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\usepackage{polyglossia}
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\setdefaultlanguage[spelling=new,babelshorthands=true]{german}
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\usepackage[]{libertine} % Schriftarten 'Linux Libertine' und 'Linux Biolinum'
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%\usepackage[ngerman]{babel} % Neue Deutsche Rechtschreibung/Silbentrennung mit griechischen Buchstaben
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\usepackage{setspace} % Paket für das Setzen des Zeilenabstandes
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\usepackage{setspace} % Paket für das Setzen des Zeilenabstandes
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\onehalfspacing
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\onehalfspacing % 1,5facher Zeilenabstand
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\usepackage[draft,kerning,spacing,protrusion=true,expansion,babel=true]{microtype} %Mikrotypographie (erweitertes Kerning, etc.)
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\usepackage{acronym} % Abkürzungen und Abkürzungsverzeichnis
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\usepackage{acronym} % Abkürzungen und Abkürzungsverzeichnis
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\usepackage[alsoload=synchem,locale=DE,loctolang={DE:german},obeyall=true,decimalsymbol={{{,}}},tophrase={{ bis }}]{siunitx} % SI-Einheiten
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\usepackage[alsoload=synchem,locale=DE,loctolang={DE:ngerman},obeyall=true,decimalsymbol={{{,}}},tophrase={{ bis }}]{siunitx} % SI-Einheiten
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\newunit{\bp}{bp} % Definition eigener Einheiten: Basenpaare
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\newunit{\bp}{bp} % Definition eigener Einheiten: Basenpaare
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\newunit{\kb}{kb} % Definition eigener Einheiten: Kilo-Basenpaare
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\newunit{\kb}{kb} % Definition eigener Einheiten: Kilo-Basenpaare
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\newunit{\Unit}{U} % Definition eigener Einheiten: Unit
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\newunit{\Unit}{U} % Definition eigener Einheiten: Unit
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@ -22,13 +17,9 @@
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\newunit{\psi}{psi} % Definition eigener Einheiten: Pounds per inch
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\newunit{\psi}{psi} % Definition eigener Einheiten: Pounds per inch
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\newunit{\CV}{CV}
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\newunit{\CV}{CV}
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\sisetup{
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}
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\usepackage{tabularx} % Tabellen mit fester Breite
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\usepackage{tabularx} % Tabellen mit fester Breite
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\usepackage{longtable}
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\usepackage{longtable} % Seitenüberspannende Tabellen
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\usepackage{booktabs} % 'Hübsche' Tabellen ohne vertikale Linien
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\usepackage{booktabs} % 'Hübsche' Tabellen ohne vertikale Linien
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\usepackage{multirow} % Mehrzeilige Tabellen
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\usepackage{multirow} % Mehrzeilige Tabellen
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\usepackage{graphicx} % Grafikerweiterung
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\usepackage{graphicx} % Grafikerweiterung
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@ -37,8 +28,8 @@
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\usepackage{natbib} % Naturwissenschaftliche Zitierungsstile
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\usepackage{natbib} % Naturwissenschaftliche Zitierungsstile
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%\usepackage[format=hang]{caption}[2008/08/24] % Formatierung von Bildunter-/Tabellenüberschriften
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%\usepackage[format=hang]{caption}[2008/08/24] % Formatierung von Bildunter-/Tabellenüberschriften
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\usepackage[format=plain,small]{caption}[2008/08/24]
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\usepackage[format=plain,small]{caption}[2008/08/24]
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%\usepackage[fixlanguage]{babelbib} % Sprachanpassung für Literaturverzeichnis
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\usepackage[fixlanguage]{babelbib} % Sprachanpassung für Literaturverzeichnis
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%\selectbiblanguage{german} % s.o.
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\selectbiblanguage{ngerman} % s.o.
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\usepackage{hyperref} % PDF-Eigenschaften (s.u.)
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\usepackage{hyperref} % PDF-Eigenschaften (s.u.)
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\hypersetup{
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\hypersetup{
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unicode=true, % non-Latin characters in Acrobat’s bookmarks
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unicode=true, % non-Latin characters in Acrobat’s bookmarks
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@ -59,6 +50,16 @@
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urlcolor=black % color of external links
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urlcolor=black % color of external links
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}
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}
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%Griechische Buchstaben/Symbole in Hauptschriftart für den Textmodus
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%opening
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%opening
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\titlehead{\centering \includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.4\textwidth]{./img/hhulogo.png}}
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\titlehead{\centering \includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.4\textwidth]{./img/hhulogo.png}}
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\subject{Biochemie der Pflanzen\\Abteilung für biochemische Pflanzenphysiologie}
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\subject{Biochemie der Pflanzen\\Abteilung für biochemische Pflanzenphysiologie}
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@ -28,7 +28,7 @@
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% \acro{GR}{\textit{GREEN RIPE}}
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% \acro{GR}{\textit{GREEN RIPE}}
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\acro{HRP}{\textit{horseradish peroxidase}, Meerrettich-Peroxidase}
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\acro{HRP}{\textit{horseradish peroxidase}, Meerrettich-Peroxidase}
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\acro{IDA}{Im\-in\-o\-di\-es\-sig\-säu\-re}
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\acro{IDA}{Im\-in\-o\-di\-es\-sig\-säu\-re}
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\acro{IPTG}{Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid}
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\acro{IPTG}{Isopropyl-$beta$-D-thiogalactopyranosid}
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\acro{MAP}{\textit{mitogen activated protein}}
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\acro{MAP}{\textit{mitogen activated protein}}
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\acro{MCS}{\textit{multiple cloning site}}
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\acro{MCS}{\textit{multiple cloning site}}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
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@ -1,38 +0,0 @@
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\relax
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\@setckpt{./inc/anhang}{
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@ -1,41 +0,0 @@
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\setcounter{section@level}{1}
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}
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@ -3,7 +3,7 @@
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\section{Das Phytohormon Ethylen}
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\section{Das Phytohormon Ethylen}
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Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanzen viele Aspekte von Entwicklung, Wachstum und Stressantwort reguliert \citep{kendrick_ethylene_2008}.
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Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanzen viele Aspekte von Entwicklung, Wachstum und Stressantwort reguliert \citep{kendrick_ethylene_2008}.
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\textit{In vivo} wird Ethylen aus der Aminosäure Methionin synthetisiert, welche über \ac{AdoMet} und \ac{ACC} in Ethylen umgewandelt wird. Dies geschieht unter ATP-Verbrauch im Cytoplasma, wobei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, die Umwandlung von \ac{AdoMet} zu \ac{ACC}, von der \ac{ACC}-Synthase katalysiert wird. Aus dem freiwerdenden 5'"=Methylthioadenosin wird im Yang-Zyklus Methionin regeneriert (vgl. Abbildung \ref{fig:yang_zyklus}).
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\textit{In vivo} wird Ethylen aus der Aminosäure Methionin synthetisiert, welche über \ac{AdoMet} und \ac{ACC} in Ethylen umgewandelt wird. Dies geschieht unter ATP-Verbrauch im Cytoplasma, wobei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, die Umwandlung von \ac{AdoMet} zu \ac{ACC}, von der \ac{ACC}-Synthase katalysiert wird. Aus dem freiwerdenden 5'-Methylthioadenosin wird im Yang-Zyklus Methionin regeneriert (vgl. Abbildung \ref{fig:yang_zyklus}).
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\begin{figure}[htbp!]
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\centering
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@ -15,7 +15,7 @@ Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanz
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\section{Ethylensignalweg}
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\section{Ethylensignalweg}
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Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Hierdurch wird die nachgeschaltete \acs{MAP}"=Kinase"=Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).
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Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Hierdurch wird die nachgeschaltete \acs{MAP}-Kinase-Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).
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In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4) welche mit prokaryotischen Zwei-Komponenten-Histidinkinasen verwandt sind \citep{voet-van-vormizeele_mutants_2008}. Diese Rezeptoren zeigen eine funktionelle Redundanz und sind negative Regulatoren der Ethylenantwort \citep{resnick_involvement_2008}.
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In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4) welche mit prokaryotischen Zwei-Komponenten-Histidinkinasen verwandt sind \citep{voet-van-vormizeele_mutants_2008}. Diese Rezeptoren zeigen eine funktionelle Redundanz und sind negative Regulatoren der Ethylenantwort \citep{resnick_involvement_2008}.
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@ -75,7 +75,7 @@ Zur Bestimmung des K$_\text{d}$-Werts der Bindung wurde die Verschiebung der Abs
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\Delta A = \frac{a \cdot c}{K_d + c}
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\Delta A = \frac{a \cdot c}{K_d + c}
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\end{equation}
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\end{equation}
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$a$ sei hierbei die Kapazität. Die entsprechenden Auftragungen und Sättingungsfunktionen sind in Abbildung \ref{fig:fit_uv_vis} dargestellt.
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a sei hierbei die Kapazität. Die entsprechenden Auftragungen und Sättingungsfunktionen sind in Abbildung \ref{fig:fit_uv_vis} dargestellt.
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\begin{figure}[htbp!]
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\begin{figure}[htbp!]
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%\centering
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%\centering
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@ -117,11 +117,11 @@ Die Daten der \ac{CD}-Spektren von \ac{RTE1} mit und ohne Hämin stammen aus unt
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\centering
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\centering
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\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd_spektroskopie/spektrum.pdf}
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\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd_spektroskopie/spektrum.pdf}
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\caption[\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}]{\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}; Die Daten stammen von unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1}. \ac{RTE1} wurde in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16${^\text{®}}$ gelöst. Die Proteinkonzentration betrug \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von \SI{0,5}{\nano\meter} (\ac{RTE1} + Hämin) bzw. \SI{1}{\nano\meter} (\ac{RTE1}) und \SI{20}{\nano\meter\per\minute} aufgenommen. Es wurden jeweils 15 Spektren akkumuliert. Deutlich ist in beiden Fällen ein negativer Cotton-Effekt bei etwa \SI{207}{\nano\meter} zu erkennen, welcher charakteristisch für α-helikale Strukturanteile ist. Der α-helikale Anteil ist bei Häminzugabe deutlich erhöht. }
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\caption[\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}]{\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}; Die Daten stammen von unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1}. \ac{RTE1} wurde in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16${^\text{\textregistered}}$ gelöst. Die Proteinkonzentration betrug \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von \SI{0,5}{\nano\meter} (\ac{RTE1} + Hämin) bzw. \SI{1}{\nano\meter} (\ac{RTE1}) und \SI{20}{\nano\meter\per\minute} aufgenommen. Es wurden jeweils 15 Spektren akkumuliert. Deutlich ist in beiden Fällen ein negativer Cotton-Effekt bei etwa \SI{207}{\nano\meter} zu erkennen, welcher charakteristisch für \textalpha-helikale Strukturanteile ist. Der \textalpha-helikale Anteil ist bei Häminzugabe deutlich erhöht. }
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\label{fig:cd_spektrum}
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\label{fig:cd_spektrum}
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\end{figure}
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\end{figure}
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Anhand der \ac{CD}-Spektren wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit \textit{CONTINLL} \citep{provencher_estimation_1981} durchgeführt. Sie ergab für \ac{RTE1} ohne Häminzugabe einen Sekundärstrukturanteil von \SI{18}{\percent} α-Helix, \SI{30}{\percent} β-Faltblatt, \SI{22}{\percent} β-Schleife und \SI{30}{\percent} \textit{Random Coil}. Bei Zugabe von Hämin ergibt die Strukturvorhersage Anteile von \SI{44}{\percent} α-Helix, \SI{6}{\percent} β-Faltblatt, \SI{25}{\percent} β-Schleife und \SI{25}{\percent} \textit{Random Coil}. Es zeigt sich also ein höherer Anteil von α-Helices und ein geringerer Anteil β-Faltblättern.
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Anhand der \ac{CD}-Spektren wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit \textit{CONTINLL} \citep{provencher_estimation_1981} durchgeführt. Sie ergab für \ac{RTE1} ohne Häminzugabe einen Sekundärstrukturanteil von \SI{18}{\percent} \textalpha-Helix, \SI{30}{\percent} \textbeta-Faltblatt, \SI{22}{\percent} \textbeta-Schleife und \SI{30}{\percent} \textit{Random Coil}. Bei Zugabe von Hämin ergibt die Strukturvorhersage Anteile von \SI{44}{\percent} \textalpha-Helix, \SI{6}{\percent} \textbeta-Faltblatt, \SI{25}{\percent} \textbeta-Schleife und \SI{25}{\percent} \textit{Random Coil}. Es zeigt sich also ein höherer Anteil von \textalpha-Helices und ein geringerer Anteil \textbeta-Faltblättern.
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@ -7,7 +7,7 @@
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\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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%\begin{center}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{Xl}
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\toprule
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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@ -42,7 +42,7 @@
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\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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%\begin{center}
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%\begin{center}
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\toprule
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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@ -50,7 +50,7 @@
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Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
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Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
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Größenausschlusschromatographie PD-10 & GE-Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, SK\\
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Größenausschlusschromatographie PD-10 & GE-Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, SK\\
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Halbmikroküvetten & Hartenstein, Würzburg\\
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Halbmikroküvetten & Hartenstein, Würzburg\\
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Hämin-Agarose & Sigma-Aldrich, München\\
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Häminagarose & Sigma-Aldrich, München\\
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Ni-IDA & Macherey-Nagel, Düren\\
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Ni-IDA & Macherey-Nagel, Düren\\
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Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
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Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
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Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
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Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
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@ -94,7 +94,7 @@
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\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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Essigsäure & 64-19-7 & VWR, Darmstadt\\
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Essigsäure & 64-19-7 & VWR, Darmstadt\\
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Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
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Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
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Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 \newline (n-Hexadecylphosphocholin) & 58066-85-6 & Affymetrix, Wooburn Green, UK\\
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Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 \newline (n-Hexadecylphosphocholin) & 58066-85-6 & Affymetrix, Wooburn Green, UK\\
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Formaldehyd & 50-00-0 & AppliChem, Darmstadt\\
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Formaldehyd & 50-00-0 & AppliChem, Darmstadt\\
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Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Hämin & 16009-13-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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Hämin & 16009-13-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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@ -113,8 +113,8 @@
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Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
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Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
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\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
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\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
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Polysorbat 20 (Tween$^{\text{®}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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Rotiphorese$^\text{®}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
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Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
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Silbernitrat & 7761-88-8 & Honeywell Riedel-de-Ha\"{e}n, Seelze\\
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Silbernitrat & 7761-88-8 & Honeywell Riedel-de-Ha\"{e}n, Seelze\\
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@ -162,7 +162,7 @@
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%\end{center}
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%\end{center}
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\subsection{Bakterienstämme}
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\subsection{Bakterienstämme}
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\label{sec:bakterienstämme}
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\label{sec:bakterienstaemme}
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%\begin{center}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{l p{0.3\textwidth} X}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{l p{0.3\textwidth} X}
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\toprule
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\toprule
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@ -200,12 +200,12 @@
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\SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\
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\SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\
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\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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\SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16
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\SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\item[Waschpuffer pH 7,5] \hfill \\
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\item[Waschpuffer pH 7,5] \hfill \\
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\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
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\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
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\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\end{description}
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\end{description}
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\subsection{Puffer und Lösungen für die denaturierende Reinigung}
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\subsection{Puffer und Lösungen für die denaturierende Reinigung}
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@ -226,7 +226,7 @@
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\subsection{Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE}
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\subsection{Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE}
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\label{sec:puffer_sds_page}
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\label{sec:puffer_sds_page}
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\begin{description}
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\begin{description}
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\item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{®}$ Gel 30)] \hfill \\
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\item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30)] \hfill \\
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\SI{30}{\percent} Acrylamid\\
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\SI{30}{\percent} Acrylamid\\
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\SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid
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\SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid
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\item[Entwickler] \hfill \\
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\item[Entwickler] \hfill \\
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@ -302,15 +302,15 @@
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\SI{30}{\milli\Molar} BisTris/\ce{HCl} pH 6,5\\
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\SI{30}{\milli\Molar} BisTris/\ce{HCl} pH 6,5\\
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\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\item[Waschpuffer pH 8,5] \hfill \\
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\item[Waschpuffer pH 8,5] \hfill \\
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\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 8,5\\
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\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 8,5\\
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\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\item[CD-Puffer] \hfill \\
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\item[CD-Puffer] \hfill \\
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\SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat pH 7,4\\
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\SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat pH 7,4\\
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\end{description}
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\end{description}
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\end{singlespace}
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\end{singlespace}
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@ -346,7 +346,7 @@ Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von
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\subsection{Zellaufschluss}
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\subsection{Zellaufschluss}
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\label{sec:zellaufschluss}
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\label{sec:zellaufschluss}
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\SI{4}{\gram} eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch dreifache Hochdruckdispersion in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten French-Press$^\text{®}$ bei einem Druck von \SIrange{1200}{1500}{\psi}.
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\SI{4}{\gram} eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch dreifache Hochdruckdispersion in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten French-Press$^\text{\textregistered}$ bei einem Druck von \SIrange{1200}{1500}{\psi}.
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%\subsection{Differentielle Zentrifugation}
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%\subsection{Differentielle Zentrifugation}
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%\label{sec:differentielle_zentrifugation}
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%\label{sec:differentielle_zentrifugation}
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@ -355,7 +355,7 @@ Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von
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\label{sec:native_reinigung}
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\label{sec:native_reinigung}
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Mit einem Poly-Histidin-Tag markierte Proteine lassen sich über eine Metallchelat"=Affinitätschromatographie aus einem Proteingemisch isolieren. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Säulenmaterial handelt es sich um \ac{IDA}, welche an Agarose immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \ac{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion der Poly-Histidin-markierten Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen.
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Mit einem Poly-Histidin-Tag markierte Proteine lassen sich über eine Metallchelat"=Affinitätschromatographie aus einem Proteingemisch isolieren. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Säulenmaterial handelt es sich um \ac{IDA}, welche an Agarose immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \ac{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion der Poly-Histidin-markierten Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen.
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Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 versetzt.
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Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 versetzt.
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Das ursprüngliche Reinigungsprotokoll \citep[vgl.][]{malach_expression_2009} sah eine Solubilisierung über einen Zeitraum von \SI{10}{\minute} bei Raumtemperatur im Ultraschallbad vor. Hierfür musste das Lysat auf mehrere \SI{1,5}{\milli\liter}-Reaktionsgefäße aufgeteilt werden. Um die Anzahl der Arbeitsschritte zu verringern und die Kühlkette nicht bei der Solubilisierung abbrechen zu lassen, erfolgte die Solubilisierung im Rahmen dieser Arbeit über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
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Das ursprüngliche Reinigungsprotokoll \citep[vgl.][]{malach_expression_2009} sah eine Solubilisierung über einen Zeitraum von \SI{10}{\minute} bei Raumtemperatur im Ultraschallbad vor. Hierfür musste das Lysat auf mehrere \SI{1,5}{\milli\liter}-Reaktionsgefäße aufgeteilt werden. Um die Anzahl der Arbeitsschritte zu verringern und die Kühlkette nicht bei der Solubilisierung abbrechen zu lassen, erfolgte die Solubilisierung im Rahmen dieser Arbeit über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
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Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Scrhitten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
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Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Scrhitten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
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@ -366,7 +366,7 @@ Das Säulenmaterial wurde gemäß den Herstellerangaben vor der Wiederverwendung
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\subsection{Denaturierende Reinigung}
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\subsection{Denaturierende Reinigung}
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\label{sec:denaturierende_reinigung}
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\label{sec:denaturierende_reinigung}
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Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
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Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
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Wasch- und Elutionspuffer enthielten ebenfalls \SI{8}{\Molar} Harnstoff.
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Wasch- und Elutionspuffer enthielten ebenfalls \SI{8}{\Molar} Harnstoff.
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\subsection{\acs{SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\subsection{\acs{SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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@ -490,29 +490,29 @@ Bei Häminen handelt es sich um Komplexverbindungen der Häme, wobei das Eisenio
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\label{fig:haemin_struktur}
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\label{fig:haemin_struktur}
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\end{figure}
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\end{figure}
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Für den Nachweis einer Häminbindung durch \ac{RTE1} kamen vier unterschiedliche Methoden zum Einsatz: Eine Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose, ein Photometrischer Nachweis über die Zugabe von freiem Hämin, der Nachweis über einen Tyrosin-Quench bei Zugabe von freiem Hämin sowie der Nachweis einer Sekundärstrukturänderung bei Häminzugabe über eine \ac{CD}-Spektroskopie. Für jede Methode kam jeweils frisch präpariertes \ac{RTE1} zum Einsatz.
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Für den Nachweis einer Häminbindung durch \ac{RTE1} kamen vier unterschiedliche Methoden zum Einsatz: Eine Affinitätschromatographie mit Häminagarose, ein Photometrischer Nachweis über die Zugabe von freiem Hämin, der Nachweis über einen Tyrosin-Quench bei Zugabe von freiem Hämin sowie der Nachweis einer Sekundärstrukturänderung bei Häminzugabe über eine \ac{CD}-Spektroskopie. Für jede Methode kam jeweils frisch präpariertes \ac{RTE1} zum Einsatz.
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\subsubsection{Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose}
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\subsubsection{Affinitätschromatographie mit Häminagarose}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet}
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Beim affinitätschromatographischen Nachweis wurde ein Säulenmaterial eingesetzt, bei welchem Hämin kovalent an Agarose als Trägermatrix gebunden ist. Hämin-bindende Proteine können dann an das immobilisierte Hämin binden. Die Elution kann entweder über die Zugabe von freiem Hämin, welches mit dem immobilisierten Hämin um die Bindung mit den Proteinen konkurriert, oder denaturierend über die Zugabe von \acs{SDS} und gleichzeitigem Erhitzen des Säulenmaterials erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam ein Batch-Verfahren zum Einsatz, welches den Nachweis einer Bindung mit vergleichsweise wenig Säulenmaterial ermöglicht \citep{tsutsui_affinity_1982}.
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Beim affinitätschromatographischen Nachweis wurde ein Säulenmaterial eingesetzt, bei welchem Hämin kovalent an Agarose als Trägermatrix gebunden ist. Häm-bindende Proteine können dann an das immobilisierte Hämin binden. Die Elution kann entweder über die Zugabe von freiem Hämin, welches mit dem immobilisierten Hämin um die Bindung mit den Proteinen konkurriert, oder denaturierend über die Zugabe von \acs{SDS} und gleichzeitigem Erhitzen des Säulenmaterials erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam ein Batch-Verfahren zum Einsatz, welches den Nachweis einer Bindung mit vergleichsweise wenig Säulenmaterial ermöglicht \citep{tsutsui_affinity_1982}.
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\SI{50}{\micro\liter} Hämin-Agarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert.
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\SI{50}{\micro\liter} Häminagarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert.
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Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11}{\milli\Molar} Hämin-Lösung. %Als Negativkontrolle kam eine \ac{BSA}-Lösung in gleicher Konzentration wie die \ac{RTE1}-Probe zum Einsatz.
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Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11}{\milli\Molar} Häminlösung. %Als Negativkontrolle kam eine \ac{BSA}-Lösung in gleicher Konzentration wie die \ac{RTE1}-Probe zum Einsatz.
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\subsubsection{Photometrie}
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\subsubsection{Photometrie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie}
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Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei in vielen Fällen eine Blauverschiebung des Soret-Peaks zu beobachten, da das Protein bzw. der Protein-Häm-Komplex unterschiedliche Absorptionsmaxima aufweisen \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bzw. ihrer relativen Verschiebung zueinander bestimmt werden.
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Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei in vielen Fällen eine Blauverschiebung des Soret-Peaks zu beobachten, da das Protein bzw. der Protein-Häm-Komplex unterschiedliche Absorptionsmaxima aufweisen \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bzw. ihrer relativen Verschiebung zueinander bestimmt werden.
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Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}, je Messreihe wurden sechs Spektren aufgenommen.
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Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}, je Messreihe wurden sechs Spektren aufgenommen.
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Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Hämin-Zugabe. Zur Ermittlung der tatsächlich in der Küvette vorliegenden Häminkonzentration wurde die Küvette mit \SI{500}{\micro\liter} \SI{1}{\Molar} \ce{NaOH} befüllt, Häminstammlösung hinzutitriert und Absorptionsspektren aufgenommen. Aus diesen konnte mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten von Hämin (Datenblatt des Herstellers) die Konzentration in der Küvette bestimmt werden. %Aus den Pufferspektren wurden dann über den Exktionktionskoeffizienten (Datenblatt des Herstellers) die tatsächliche Hämin-Konzentration in der Küvette bestimmt. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren.
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Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Häminzugabe. Zur Ermittlung der tatsächlich in der Küvette vorliegenden Häminkonzentration wurde die Küvette mit \SI{500}{\micro\liter} \SI{1}{\Molar} \ce{NaOH} befüllt, Häminstammlösung hinzutitriert und Absorptionsspektren aufgenommen. Aus diesen konnte mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten von Hämin (Datenblatt des Herstellers) die Konzentration in der Küvette bestimmt werden. %Aus den Pufferspektren wurden dann über den Exktionktionskoeffizienten (Datenblatt des Herstellers) die tatsächliche Hämin-Konzentration in der Küvette bestimmt. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren.
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\caption{Hämin-Konzentration für die UV-Vis-Spektroskopie}
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\caption{Häminkonzentration für die UV-Vis-Spektroskopie}
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\textbf{Hämin-Konzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen [\si{\micro\liter}]}\\
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\textbf{Häminkonzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen [\si{\micro\liter}]}\\
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2 & 0,9\\
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@ -537,10 +537,10 @@ Wie beim photometrischen Bindungsnachweis erfolgte die Bestimmung der tatsächli
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\caption{Hämin-Konzentration für die Fluoreszenzspektroskopie}
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\caption{Häminkonzentration für die Fluoreszenzspektroskopie}
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\textbf{Hämin-Konzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen Stammlösung [\si{\micro\liter}]} & \textbf{Konzentration Stammlösung [\si{\milli\Molar}]}\\
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\textbf{Häminkonzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen Stammlösung [\si{\micro\liter}]} & \textbf{Konzentration Stammlösung [\si{\milli\Molar}]}\\
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0 & 0 &\multirow{8}{*}{\SI{0,275}{\milli\Molar}}\\
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0,5 & 0,9 &\\
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\subsubsection{\acs{CD}-Spektroskopie}
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\subsubsection{\acs{CD}-Spektroskopie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
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Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten ε$_\text{L}$ und ε$_\text{R}$, wobei letztlich ihre Differenz Δε gemessen und als Elliptizität θ angegeben. d sei die Schichtdicke und c die Konzentration \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}:
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Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$, wobei letztlich ihre Differenz \textDelta\textepsilon gemessen und als Elliptizität \texttheta~angegeben -- d sei die Schichtdicke und c die Konzentration \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}:
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\theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
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\theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
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Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von \SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n → π$^\text{*}$ bzw. π → π$^\text{*}$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration von \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (Δε) umgerechnet.
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Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von \SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n~\textrightarrow~\textpi$^*$ bzw. \textpi~\textrightarrow~\textpi$^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration von \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.
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\@writefile{toc}{\contentsline {chapter}{\numberline {1}Zusammenfassung}{4}{chapter.1}}
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