Material/Methoden: Proteinbestimmung mit BCA

bachelorarbeit.kilepr

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bachelorarbeit.tex

@@ -1,6 +1,6 @@
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 \begin{document}
 
-%\linespread{1.05}
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-
 \begin{titlepage}
  \begin{center}
   \large

inc/abkuerzungen.tex

@@ -7,6 +7,7 @@
  \acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
  \acro{A. thaliana}[\textit{A. thaliana}]{\textit{Arabidopsis thaliana}}
  \acro{BisTris}{Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan}
+ \acro{BCA}{Bicinchoninsäure}
  \acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
  \acro{CD}{Circulardichronismus}
  \acro{cmc}{\textit{critical micelle concentration}, kritische Mizellenkonzentration}

inc/material.tex

@@ -79,7 +79,7 @@
 
 %\begin{center}
 % \begin{tabularx}{\textwidth}{XrX}
-  \begin{longtable}{p{0.4\textwidth} r p{0.37\textwidth}}
+  \begin{longtable}{p{0.36\textwidth} r p{0.39\textwidth}}
   \toprule
   \textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
   \midrule
@@ -137,6 +137,30 @@
  \end{tabularx}
 %\end{center}
 
+\subsection{Antikörper}
+\label{sec:antikoerper}
+%\begin{center}
+ \begin{tabularx}{\textwidth}{XX}
+  \toprule
+  \textbf{Antikörper} & \textbf{Hersteller}\\
+  \midrule
+  Anti-His-HRP & Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach\\
+  \bottomrule
+ \end{tabularx}
+%\end{center}
+
+\subsection{Kommerzielle Kits}
+\label{sec:kommerzielle_kits}
+%\begin{center}
+ \begin{tabularx}{\textwidth}{XX}
+  \toprule
+  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
+  \midrule
+  BCA Protein Assay Kit & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
+  \bottomrule
+ \end{tabularx}
+%\end{center}
+
 \subsection{Kulturmedien}
 \begin{description}
  \item[2YT] \hfill \\
@@ -145,7 +169,7 @@
   \SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid
 \end{description}
 
-\subsection{Puffer und Lösungen für den Zellaufschluss}
+\subsubsection{Puffer für den Zellaufschluss}
 \begin{description}
  \item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
   \SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
@@ -268,9 +292,6 @@
   \SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
   \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
   \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
- \item[CD-Puffer] \hfill \\
-  \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat pH 7,4\\
-  \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
 \end{description}
 \end{singlespace}
 
@@ -279,7 +300,7 @@
 
 \subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
 \label{sec:transformation}
-Zur Transformation von \ac{E. coli} wurde ein auf dem Vektor pET-15b der Firma Novagen basierendes Konstrukt eingesetzt. Hierbei wurde die \ac{RTE1}-kodierende Sequenz über die \textit{NdeI}-Schnittstelle hineinkloniert. N-terminal sitzt ein Hexa-His-Tag zur späteren affinitätschromatographischen Reinigung des Proteins. Das \acs{RTE1}-kodierende Gen befindet sich zwischen einem T7-Promotor bzw. -Terminator, so dass zur Transkription eine T7-RNA-Polymerase benötigt wird. Sowohl die Transkription der T7-RNA-Polymerase, als auch der T7-Promotor werden durch den Lac-Repressor (lacl) reprimiert. Durch Zugabe des Lactose-Analogons \ac{IPTG} löst sich der Repressor von den regulatorischen Sequenzen und ermöglicht zunächst die Transkription der T7-RNA-Polymerase, welche ihrerseits dann die für \ac{RTE1}-kodierende Sequenz transkribiert.
+Zur Transformation von \ac{E. coli} wurde ein auf dem Vektor pET-15b der Firma Novagen basierendes Konstrukt eingesetzt. Hierbei wurde die \ac{RTE1}-kodierende Sequenz über die \textit{NdeI}-Schnittstelle hineinkloniert. N-terminal sitzt ein Hexa-His-Tag zur späteren affinitätschromatographischen Reinigung des Proteins. Das \acs{RTE1}-kodierende Gen befindet sich zwischen einem T7-Promotor bzw. -Terminator, so dass zur Transkription eine T7-RNA-Polymerase benötigt wird. Sowohl die Transkription der T7-RNA-Polymerase, als auch der T7-Promotor werden durch den Lac-Repressor (lacl) reprimiert. Durch Zugabe des Lactose"=Analogons \ac{IPTG} löst sich der Repressor von den regulatorischen Sequenzen und ermöglicht zunächst die Transkription der T7-RNA-Polymerase, welche ihrerseits dann die für \ac{RTE1}-kodierende Sequenz transkribiert.
 
 Als Selektionsmarker vermittelt pET-15b eine Ampicillinresistenz. Das Konstrukt aus pET-15b und der \ac{RTE1}-kodierenden Sequenz wird im Folgenden als pET-15b-RTE1 bezeichnet.
 
@@ -398,6 +419,42 @@ Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in
 
 Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor (LAS 4000 mini, Fuji) eingesetzt.
 
+\subsection{Proteinbestimmung über einen \acl{BCA}-Assay}
+\label{sec:proteinbestimmung}
+Die Proteinkonzentration in einer Lösung kann über einen \acl{BCA}-Assay  ermittelt werden \citep{smith_measurement_1985}. Cystein, Cystin, Tyrosin, Tryptophan und die Peptidbindung selbst sind in der Lage \ce{Cu^{2+}} zu \ce{Cu^+} zu reduzieren, mit welchen \ac{BCA} spezifisch einen farbigen Komplex mit einem Absorptionsmaximum bei \SI{562}{\nano\meter} bildet \citep{wiechelman_investigation_1988}. Die Absorption kann dann photometrisch gemessen und für die Berechnung der Proteinkonzentration verwendet werden.
+
+Im Rahmen dieser Arbeit wurden Proteinbestimmungen mit dem "`BCA Protein Assay Kit"' durchgeführt. Das \ac{BCA}-Reagenz wurde gemäß den Herstellerangaben angesetzt. Anschließend wurden die in den Tabellen \ref{tab:bca_ansaetze_kalibrierung} und \ref{tab:bca_ansaetze_proben} aufgeführten Ansätze in Halbmikroküvetten pipettiert und gevortext.
+
+Es folgte eine Inkubation bei \SI{37}{\celsius} für \SI{30}{\minute} im Brutschrank, woran die Absorptionsmessung anschloss. Bei der Berechnung der Proteinkonzentration in den Proben ist zu berücksichtigen, dass die Proben für die Kalibriergeraden im Vergleich zu den Proben um den Faktor 10 verdünnt wurden. 
+
+\begin{table}[htb]
+\centering
+\caption{Pipettierschema für \ac{BCA}-Kalibiergerade}
+\begin{tabular}{rrrrrrr}
+\toprule
+\textbf{Proteinmenge [\si{\micro\gram}]}      & 0   & 2   & 4   & 6   & 8   & 10  \\
+\midrule
+\textbf{BSA-Standard [\si{\micro\liter}]}     & 0   & 1   & 2   & 3   & 4   & 5   \\
+\textbf{Puffer [\si{\micro\liter}]}           & 10  & 10  & 10  & 10  & 10  & 10  \\
+\textbf{\ac{BCA}-Reagenz [\si{\micro\liter}]} & 990 & 989 & 988 & 987 & 986 & 985 \\
+\bottomrule
+\end{tabular}
+\label{tab:bca_ansaetze_kalibrierung}
+\end{table}
+
+\begin{table}[htb]
+\centering
+\caption{Pipettierschema für \ac{BCA}-Proben}
+\begin{tabular}{rrrrrrr}
+\toprule
+\textbf{Probe [\si{\micro\liter}]}           & 10  & 10  & 10  & 10  & 10  & 10  \\
+\textbf{\ac{BCA}-Reagenz [\si{\micro\liter}]} & 990 & 989 & 988 & 987 & 986 & 985 \\
+\bottomrule
+\end{tabular}
+\label{tab:bca_ansaetze_proben}
+\end{table}
+
+
 \subsection{Nachweis der Häminbindung}
 \label{sec:nachweis_haemin_bindung}
 Bei Häminen handelt es sich um Komplexverbindungen der Häme, wobei das Eisenion in der Oxidationsstufe +III vorliegt. Als axialen Liganden weisen sie ein Chlorid-Ion auf. Das Hämin b des Häm b wird als Hämin bezeichnet \citep{fischer_haemin_1999}.
@@ -485,13 +542,11 @@ Wie beim photometrischen Bindungsnachweis erfolgte die Bestimmung der tatsächli
 
 \subsubsection{\acs{CD}-Spektroskopie}
 \label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
-Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$, wobei letztlich ihre Differenz $\Delta\varepsilon$ gemessen und als Elliptizität $\theta$ engegeben. $d$ sei die Schichtdicke  und $c$ die Konzentration $c$ angegeben \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}:
+Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$, wobei letztlich ihre Differenz $\Delta\varepsilon$ gemessen und als Elliptizität $\theta$ angegeben. $d$ sei die Schichtdicke  und $c$ die Konzentration $c$ angegeben \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}:
 
  \begin{equation}
   \theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
  \end{equation}
 
-Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von \SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die $n \rightarrow \pi^*$ bzw. $\pi \rightarrow \pi^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}.
+Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von \SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die $n \rightarrow \pi^*$ bzw. $\pi \rightarrow \pi^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration von \SI{0,5}{\milli\gram\per\milli\liter}.
-
-Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration von \SI{0,5}{\milli\gram\per\milli\liter}.