diff --git a/bachelorarbeit.kilepr b/bachelorarbeit.kilepr index 82aed6e..38132cc 100644 --- a/bachelorarbeit.kilepr +++ b/bachelorarbeit.kilepr @@ -74,13 +74,13 @@ ReadWrite=true [item:../../../Bibliothek.bib] archive=true -column=31 +column=33 encoding=UTF-8 highlight=BibTeX -line=181 +line=307 mode=BibTeX open=false -order=5 +order=3 [item:bachelorarbeit.kilepr] archive=true @@ -94,10 +94,10 @@ order=-1 [item:bachelorarbeit.tex] archive=true -column=15 +column=18 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=68 +line=64 mode=LaTeX open=true order=0 @@ -214,10 +214,10 @@ order=6 [item:inc/material.tex] archive=true -column=11 +column=21 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=437 +line=459 mode=LaTeX open=true order=2 @@ -233,12 +233,12 @@ open=false order=3 [view-settings,view=0,item:../../../Bibliothek.bib] -CursorColumn=31 -CursorLine=181 +CursorColumn=33 +CursorLine=307 [view-settings,view=0,item:bachelorarbeit.tex] -CursorColumn=15 -CursorLine=68 +CursorColumn=18 +CursorLine=64 [view-settings,view=0,item:inc/abkuerzungen.tex] CursorColumn=34 @@ -253,8 +253,8 @@ CursorColumn=0 CursorLine=1 [view-settings,view=0,item:inc/material.tex] -CursorColumn=11 -CursorLine=437 +CursorColumn=21 +CursorLine=459 [view-settings,view=0,item:inc/zusammenfassung.tex] CursorColumn=25 diff --git a/bachelorarbeit.pdf b/bachelorarbeit.pdf index 9bad811..28598bd 100644 Binary files a/bachelorarbeit.pdf and b/bachelorarbeit.pdf differ diff --git a/inc/material.tex b/inc/material.tex index ffd7978..8394ae8 100644 --- a/inc/material.tex +++ b/inc/material.tex @@ -421,15 +421,15 @@ Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Bead \subsubsection{Photometrie} \label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie} -Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei häufig eine Rotverschiebung des Soret-Peaks zu beobachten \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bestimmt werden. +Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei in vielen Fällen eine Rotverschiebung des Soret-Peaks zu beobachten, da das Protein bzw. der Protein-Häm-Komplex unterschiedliche Absorptionsmaxima aufweisen \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bzw. ihrer relativen Verschiebung zueinander bestimmt werden. -Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}. -Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Hämin-Zugabe. Aus den Pufferspektren wurden dann über den Exktionktionskoeffizienten (Datenblatt des Herstellers) die tatsächliche Hämin-Konzentration in der Küvette bestimmt. +Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}. +Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Hämin-Zugabe. Aus den Pufferspektren wurden dann über den Exktionktionskoeffizienten (Datenblatt des Herstellers) die tatsächliche Hämin-Konzentration in der Küvette bestimmt. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren. -\begin{table}[htb] +\begin{table}[ht] \centering -\caption{Hämin-Konzentration für photometrische Untersuchung} -\begin{tabular}{rr} +\caption{Hämin-Konzentration für die UV-Vis-Spektroskopie} +\begin{tabularx}{0.6\textwidth}{rr} \toprule \textbf{Hämin-Konzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen [\si{\micro\liter}]}\\ \midrule @@ -442,13 +442,45 @@ Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Hämin-Z 30 & 4,6\\ 40 & 4,6\\ \bottomrule -\end{tabular} +\end{tabularx} \label{tab:haemin_konzentration_photometrie} \end{table} \subsubsection{Fluoreszenzspektroskopie} \label{sec:nachweis_haemin_bindung_fluoreszenz} +Bei der Anregung eines Fluorophors mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, kommt es zu einer Stokes-verschobenen Lichtemission bei einer für das Fluorophor spezifischen Wellenlänge. Bei Zugabe eines Quenchers tritt eine Fluoreszenzauslöschung (Quench) auf. Hierfür können unterschiedliche Effekte verantwortlich sein, allen gemein ist aber, dass sie entweder den Übergang des Fluorophors von seinem Grund- in den angeregten Zustand verhindern, oder den angeregten Zustand strahlungslos zurück in den Grundzustand überführen. Beispielsweise kann dies über eine Stoßdeaktivierung -- eine Kollision zwischen Fluorophor und Quencher -- oder einen Resonanzenergietransfer vom Fluorophor auf den Quencher erfolgen \citep{atkins_physikalische_2006}. In der Proteinanalytik wird häufig Tryptophan angeregt, dessen Absorptionsmaximum bei \SI{280}{\nano\meter} liegt und ein Emissionsmaximum im Bereich zwischen \SIrange{300}{350}{\nano\meter} aufweist \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}. +Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Tryptophane in \ac{RTE1} bei \SI{280}{\nano\meter} angeregt und das Emissionsspektrum zwischen \SIrange{300}{400}{\nano\meter} aufgenommen. Hierfür wurde zunächst \ac{RTE1} nach der Reinigung in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol über eine PD10-Säule umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden \SI{500}{\micro\liter} mit einer Proteinkonzentration von \SI{2,5}{\micro\Molar} in die Messung eingesetzt. Im Verlauf der Messung wurde Hämin bis zu einer Endkonzentration von \SI{60}{\micro\Molar} hinzutitriert. Zusätzlich wurde ein Pufferspektrum mit entsprechender Häminkonzentration aufgenommen. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren. + +Wie beim photometrischen Bindungsnachweis erfolgte die Bestimmung der tatsächlich vorliegenden Häminkonzentration über die Aufnahme von Absorptionsspektren und den vom Hersteller angegebenen Extinktionskoeffizienten. + +\begin{table}[ht] +\centering +\caption{Hämin-Konzentration für die Fluoreszenzspektroskopie} +\begin{tabularx}{0.85\textwidth}{XXX} +\toprule +\textbf{Hämin-Konzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen Stammlösung [\si{\micro\liter}]} & \textbf{Konzentration Stammlösung [\si{\milli\Molar}]}\\ +\midrule +0 & 0 &\multirow{8}{*}{\SI{0,275}{\milli\Molar}}\\ +0,5 & 0,9 &\\ +1 & 0,9 &\\ +1,5 & 0,9 &\\ +2 & 0,9 &\\ +2,5 & 0,9 &\\ +3 & 0,9 &\\ +4 & 1,8 &\\ +\cmidrule(r){3-3} +6 & 0,92 & \multirow{6}{*}{\SI{1,1}{\milli\Molar}}\\ +8 & 0,92 &\\ +10 & 0,92 &\\ +20 & 4,6 &\\ +40 & 9,4 &\\ +60 & 9,5 &\\ +\bottomrule +\end{tabularx} +\label{tab:haemin_konzentration_photometrie} +\end{table} +\clearpage \subsubsection{\ac{CD}} \label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}