diff --git a/bachelorarbeit.kilepr b/bachelorarbeit.kilepr index 9277e8c..c85bafd 100644 --- a/bachelorarbeit.kilepr +++ b/bachelorarbeit.kilepr @@ -4,7 +4,7 @@ img_extIsRegExp=false img_extensions=.eps .jpg .jpeg .png .pdf .ps .fig .gif kileprversion=2 kileversion=2.0.85 -lastDocument=inc/ergebnisse.tex +lastDocument=inc/material.tex masterDocument= name=Bachelorarbeit pkg_extIsRegExp=false @@ -254,30 +254,30 @@ order=-1 [item:inc/einleitung.tex] archive=true -column=44 +column=199 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=23 +line=38 mode=LaTeX open=true order=4 [item:inc/ergebnisse.tex] archive=true -column=254 +column=12 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=123 +line=108 mode=LaTeX open=true order=3 [item:inc/material.tex] archive=true -column=263 +column=21 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=573 +line=96 mode=LaTeX open=true order=2 @@ -305,16 +305,16 @@ CursorColumn=24 CursorLine=30 [view-settings,view=0,item:inc/einleitung.tex] -CursorColumn=44 -CursorLine=23 +CursorColumn=199 +CursorLine=38 [view-settings,view=0,item:inc/ergebnisse.tex] -CursorColumn=254 -CursorLine=123 +CursorColumn=12 +CursorLine=108 [view-settings,view=0,item:inc/material.tex] -CursorColumn=263 -CursorLine=573 +CursorColumn=21 +CursorLine=96 [view-settings,view=0,item:inc/zusammenfassung.tex] CursorColumn=25 diff --git a/bachelorarbeit.pdf b/bachelorarbeit.pdf index acbbb3c..7ab8e82 100644 Binary files a/bachelorarbeit.pdf and b/bachelorarbeit.pdf differ diff --git a/inc/anhang.aux b/inc/anhang.aux new file mode 100644 index 0000000..3139e72 --- /dev/null +++ b/inc/anhang.aux @@ -0,0 +1,38 @@ +\relax +\@setckpt{./inc/anhang}{ +\setcounter{page}{52} +\setcounter{equation}{0} +\setcounter{enumi}{0} +\setcounter{enumii}{0} +\setcounter{enumiii}{0} +\setcounter{enumiv}{0} +\setcounter{footnote}{0} +\setcounter{mpfootnote}{0} +\setcounter{part}{0} +\setcounter{chapter}{0} +\setcounter{section}{0} +\setcounter{subsection}{0} +\setcounter{subsubsection}{0} +\setcounter{paragraph}{0} +\setcounter{subparagraph}{0} +\setcounter{figure}{0} +\setcounter{table}{0} +\setcounter{fontspec_tmp_int}{0} +\setcounter{LT@tables}{1} +\setcounter{LT@chunks}{2} +\setcounter{KVtest}{2} +\setcounter{subfigure}{0} +\setcounter{subfigure@save}{3} +\setcounter{lofdepth}{1} +\setcounter{subtable}{0} +\setcounter{subtable@save}{0} +\setcounter{lotdepth}{1} +\setcounter{parentequation}{0} +\setcounter{mhchem@cf@length}{0} +\setcounter{NAT@ctr}{18} +\setcounter{ContinuedFloat}{0} +\setcounter{Item}{0} +\setcounter{Hy@AnnotLevel}{0} +\setcounter{bookmark@seq@number}{44} +\setcounter{section@level}{1} +} diff --git a/inc/diskussion.aux b/inc/diskussion.aux new file mode 100644 index 0000000..ae499ce --- /dev/null +++ b/inc/diskussion.aux @@ -0,0 +1,41 @@ +\relax +\@writefile{toc}{\contentsline {chapter}{\numberline {5}Diskussion}{44}{chapter.5}} +\@writefile{lof}{\addvspace {10\p@ }} +\@writefile{lot}{\addvspace {10\p@ }} +\@setckpt{./inc/diskussion}{ +\setcounter{page}{45} +\setcounter{equation}{0} +\setcounter{enumi}{0} +\setcounter{enumii}{0} +\setcounter{enumiii}{0} +\setcounter{enumiv}{0} +\setcounter{footnote}{0} +\setcounter{mpfootnote}{0} +\setcounter{part}{0} +\setcounter{chapter}{5} +\setcounter{section}{0} +\setcounter{subsection}{0} +\setcounter{subsubsection}{0} +\setcounter{paragraph}{0} +\setcounter{subparagraph}{0} +\setcounter{figure}{0} +\setcounter{table}{0} +\setcounter{fontspec_tmp_int}{0} +\setcounter{LT@tables}{1} +\setcounter{LT@chunks}{2} +\setcounter{KVtest}{2} +\setcounter{subfigure}{0} +\setcounter{subfigure@save}{3} +\setcounter{lofdepth}{1} +\setcounter{subtable}{0} +\setcounter{subtable@save}{0} +\setcounter{lotdepth}{1} +\setcounter{parentequation}{0} +\setcounter{mhchem@cf@length}{0} +\setcounter{NAT@ctr}{0} +\setcounter{ContinuedFloat}{0} +\setcounter{Item}{0} +\setcounter{Hy@AnnotLevel}{0} +\setcounter{bookmark@seq@number}{41} +\setcounter{section@level}{1} +} diff --git a/inc/ergebnisse.tex b/inc/ergebnisse.tex index fa0ce7f..a528471 100644 --- a/inc/ergebnisse.tex +++ b/inc/ergebnisse.tex @@ -117,7 +117,7 @@ Die Daten der \ac{CD}-Spektren von \ac{RTE1} mit und ohne Hämin stammen aus unt \centering \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd_spektroskopie/spektrum.pdf} % spektrum.pdf: 548x427 pixel, 72dpi, 19.33x15.06 cm, bb=0 0 548 427 - \caption[\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}]{\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}; Die Daten stammen von unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1}. \ac{RTE1} wurde in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16${^\text{\textregistered}}$ gelöst. Die Proteinkonzentration betrug \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von \SI{0,5}{\nano\meter} (\ac{RTE1} + Hämin) bzw. \SI{1}{\nano\meter} (\ac{RTE1}) und \SI{20}{\nano\meter\per\minute} aufgenommen. Es wurden jeweils 15 Spektren akkumuliert. Deutlich ist in beiden Fällen ein negativer Cotton-Effekt bei etwa \SI{207}{\nano\meter} zu erkennen, welcher charakteristisch für α-helikale Strukturanteile ist. Der α-helikale Anteil ist bei Häminzugabe deutlich erhöht. } + \caption[\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}]{\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}; Die Daten stammen von unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1}. \ac{RTE1} wurde in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16${^\text{®}}$ gelöst. Die Proteinkonzentration betrug \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von \SI{0,5}{\nano\meter} (\ac{RTE1} + Hämin) bzw. \SI{1}{\nano\meter} (\ac{RTE1}) und \SI{20}{\nano\meter\per\minute} aufgenommen. Es wurden jeweils 15 Spektren akkumuliert. Deutlich ist in beiden Fällen ein negativer Cotton-Effekt bei etwa \SI{207}{\nano\meter} zu erkennen, welcher charakteristisch für α-helikale Strukturanteile ist. Der α-helikale Anteil ist bei Häminzugabe deutlich erhöht. } \label{fig:cd_spektrum} \end{figure} diff --git a/inc/material.tex b/inc/material.tex index 67417be..7578a76 100644 --- a/inc/material.tex +++ b/inc/material.tex @@ -94,7 +94,7 @@ \acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\ Essigsäure & 64-19-7 & VWR, Darmstadt\\ Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\ - Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 \newline (n-Hexadecylphosphocholin) & 58066-85-6 & Affymetrix, Wooburn Green, UK\\ + Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 \newline (n-Hexadecylphosphocholin) & 58066-85-6 & Affymetrix, Wooburn Green, UK\\ Formaldehyd & 50-00-0 & AppliChem, Darmstadt\\ Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\ Hämin & 16009-13-5 & Sigma-Aldrich, München\\ @@ -113,8 +113,8 @@ Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\ Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\ \acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\ - Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\ - Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\ + Polysorbat 20 (Tween$^{\text{®}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\ + Rotiphorese$^\text{®}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\ Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\ Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\ Silbernitrat & 7761-88-8 & Honeywell Riedel-de-Ha\"{e}n, Seelze\\ @@ -200,12 +200,12 @@ \SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\ \SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\ \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\ - \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 + \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 \item[Waschpuffer pH 7,5] \hfill \\ \SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\ \SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\ \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\ - \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 + \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 \end{description} \subsection{Puffer und Lösungen für die denaturierende Reinigung} @@ -226,7 +226,7 @@ \subsection{Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE} \label{sec:puffer_sds_page} \begin{description} - \item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30)] \hfill \\ + \item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{®}$ Gel 30)] \hfill \\ \SI{30}{\percent} Acrylamid\\ \SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid \item[Entwickler] \hfill \\ @@ -302,15 +302,15 @@ \SI{30}{\milli\Molar} BisTris/\ce{HCl} pH 6,5\\ \SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\ \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\ - \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 + \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 \item[Waschpuffer pH 8,5] \hfill \\ \SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 8,5\\ \SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\ \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\ - \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 + \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 \item[CD-Puffer] \hfill \\ \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat pH 7,4\\ - \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 + \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 \end{description} \end{singlespace} @@ -346,7 +346,7 @@ Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von \subsection{Zellaufschluss} \label{sec:zellaufschluss} -\SI{4}{\gram} eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch dreifache Hochdruckdispersion in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten French-Press$^\text{\textregistered}$ bei einem Druck von \SIrange{1200}{1500}{\psi}. +\SI{4}{\gram} eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch dreifache Hochdruckdispersion in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten French-Press$^\text{®}$ bei einem Druck von \SIrange{1200}{1500}{\psi}. %\subsection{Differentielle Zentrifugation} %\label{sec:differentielle_zentrifugation} @@ -355,7 +355,7 @@ Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von \label{sec:native_reinigung} Mit einem Poly-Histidin-Tag markierte Proteine lassen sich über eine Metallchelat"=Affinitätschromatographie aus einem Proteingemisch isolieren. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Säulenmaterial handelt es sich um \ac{IDA}, welche an Agarose immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \ac{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion der Poly-Histidin-markierten Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen. -Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 versetzt. +Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 versetzt. Das ursprüngliche Reinigungsprotokoll \citep[vgl.][]{malach_expression_2009} sah eine Solubilisierung über einen Zeitraum von \SI{10}{\minute} bei Raumtemperatur im Ultraschallbad vor. Hierfür musste das Lysat auf mehrere \SI{1,5}{\milli\liter}-Reaktionsgefäße aufgeteilt werden. Um die Anzahl der Arbeitsschritte zu verringern und die Kühlkette nicht bei der Solubilisierung abbrechen zu lassen, erfolgte die Solubilisierung im Rahmen dieser Arbeit über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators. Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Scrhitten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen. @@ -366,7 +366,7 @@ Das Säulenmaterial wurde gemäß den Herstellerangaben vor der Wiederverwendung \subsection{Denaturierende Reinigung} \label{sec:denaturierende_reinigung} -Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde. +Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde. Wasch- und Elutionspuffer enthielten ebenfalls \SI{8}{\Molar} Harnstoff. \subsection{\acs{SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese} @@ -496,9 +496,9 @@ Für den Nachweis einer Häminbindung durch \ac{RTE1} kamen vier unterschiedlich \label{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet} Beim affinitätschromatographischen Nachweis wurde ein Säulenmaterial eingesetzt, bei welchem Hämin kovalent an Agarose als Trägermatrix gebunden ist. Hämin-bindende Proteine können dann an das immobilisierte Hämin binden. Die Elution kann entweder über die Zugabe von freiem Hämin, welches mit dem immobilisierten Hämin um die Bindung mit den Proteinen konkurriert, oder denaturierend über die Zugabe von \acs{SDS} und gleichzeitigem Erhitzen des Säulenmaterials erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam ein Batch-Verfahren zum Einsatz, welches den Nachweis einer Bindung mit vergleichsweise wenig Säulenmaterial ermöglicht \citep{tsutsui_affinity_1982}. -\SI{50}{\micro\liter} Hämin-Agarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert. +\SI{50}{\micro\liter} Hämin-Agarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert. -Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11}{\milli\Molar} Hämin-Lösung. %Als Negativkontrolle kam eine \ac{BSA}-Lösung in gleicher Konzentration wie die \ac{RTE1}-Probe zum Einsatz. +Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{®}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11}{\milli\Molar} Hämin-Lösung. %Als Negativkontrolle kam eine \ac{BSA}-Lösung in gleicher Konzentration wie die \ac{RTE1}-Probe zum Einsatz. \subsubsection{Photometrie} \label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie} diff --git a/inc/zusammenfassung.aux b/inc/zusammenfassung.aux new file mode 100644 index 0000000..42fd667 --- /dev/null +++ b/inc/zusammenfassung.aux @@ -0,0 +1,41 @@ +\relax +\@writefile{toc}{\contentsline {chapter}{\numberline {1}Zusammenfassung}{4}{chapter.1}} +\@writefile{lof}{\addvspace {10\p@ }} +\@writefile{lot}{\addvspace {10\p@ }} +\@setckpt{./inc/zusammenfassung}{ +\setcounter{page}{5} +\setcounter{equation}{0} +\setcounter{enumi}{0} +\setcounter{enumii}{0} +\setcounter{enumiii}{0} +\setcounter{enumiv}{0} +\setcounter{footnote}{0} +\setcounter{mpfootnote}{0} +\setcounter{part}{0} +\setcounter{chapter}{1} +\setcounter{section}{0} +\setcounter{subsection}{0} +\setcounter{subsubsection}{0} +\setcounter{paragraph}{0} +\setcounter{subparagraph}{0} +\setcounter{figure}{0} +\setcounter{table}{0} +\setcounter{fontspec_tmp_int}{0} +\setcounter{LT@tables}{0} +\setcounter{LT@chunks}{0} +\setcounter{KVtest}{2} +\setcounter{subfigure}{0} +\setcounter{subfigure@save}{0} +\setcounter{lofdepth}{1} +\setcounter{subtable}{0} +\setcounter{subtable@save}{0} +\setcounter{lotdepth}{1} +\setcounter{parentequation}{0} +\setcounter{mhchem@cf@length}{0} +\setcounter{NAT@ctr}{0} +\setcounter{ContinuedFloat}{0} +\setcounter{Item}{0} +\setcounter{Hy@AnnotLevel}{0} +\setcounter{bookmark@seq@number}{1} +\setcounter{section@level}{0} +}