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\textsf{\textbf{Bachelorarbeit}}
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\textsf{\textbf{Molekulare Charakterisierung von \acs{RTE1} aus \acl{A. thaliana}}}
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\textsf{\textbf{Molekulare Charakterisierung des Membranproteins \acs{RTE1} aus \linebreak \acl{A. thaliana}}}
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\vfill
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Zur Erlangung des Bachelorgrades\\ (Bachelor of Science - Biochemistry)
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\vfill
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@ -147,7 +147,6 @@
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\listoffigures
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\addcontentsline{toc}{chapter}{Abbildungsverzeichnis}
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\listoftables
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\addcontentsline{toc}{chapter}{Tabellenverzeichnis}
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\manualmark
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\markright{Abkürzungsverzeichnis}
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\chapter*{Abkürzungsverzeichnis}
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@ -45,4 +47,5 @@
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\acro{SOPMA}{\textit{self-optimized prediction method}}
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\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
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\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
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\automark[section]{chapter}
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@ -0,0 +1,48 @@
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\chapter*{Abkürzungsverzeichnis}
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\begin{acronym}[SDS-PAGE]
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\setlength{\itemsep}{-\parsep}
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\acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
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\acro{ACC}{1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure}
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\acro{AdoMet}{Adenosylmethionin}
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\acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
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\acro{A. thaliana}[\textit{A. thaliana}]{\textit{Arabidopsis thaliana}}
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\acro{BisTris}{Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan}
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\acro{BCA}{Bicinchoninsäure}
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\acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
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\acro{CD}{Circulardichroismus}
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\acro{cmc}{\textit{critical micelle concentration}, kritische Mizellenkonzentration}
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\acro{CTR1}{\textit{CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE 1}}
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\acro{CV}{\textit{column volume}, Säulenvolumen}
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% \acro{dNTP}{desoxyribo-Nukleinsäure-Triphosphat}
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\acro{DTT}{Dithiothreitol}
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\acro{EBF1}{\textit{EIN3 BINDING FACTOR 1}}
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\acro{EBF2}{\textit{EIN3 BINDING FACTOR 2}}
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\acro{EDTA}{Ethylendiamintetraessigsäure}
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\acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}}
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\acro{EIL1}{\textit{ETHYLENE INSENSITIVE3 LIKE 1}}
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\acro{EIN2}{\textit{ETHYLENE INSENSITIVE 2}}
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\acro{EIN3}{\textit{ETHYLENE INSENSITIVE 3}}
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\acro{ER}{Endoplasmatisches Retikulum}
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\acro{ERF1}{\textit{ETHYLENE RESPONSE FACTOR 1}}
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\acro{ETR1}{\textit{ETHYLENE RESISTANT 1}}
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% \acro{GR}{\textit{GREEN RIPE}}
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\acro{HasAp}{\textit{HEME-BINDING PROTEIN A}}
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\acro{HBP}{\textit{HEME-BINDING PROTEIN}}
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\acro{HRP}{\textit{horseradish peroxidase}, Meerrettich-Peroxidase}
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\acro{IDA}{Im\-in\-o\-di\-es\-sig\-säu\-re}
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\acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
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\acro{MAP}{\textit{mitogen activated protein}}
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\acro{MCS}{\textit{multiple cloning site}}
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\acro{NEM}{N-Ethylmaleinimid}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
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\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
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\acro{RFABG}{\textit{RETINOID- AND FATTY ACID-BINDING GLYCOPROTEIN}}
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\acro{RAN1}{\textit{RESPONSIVE TO ANTAGONIST 1}}
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\acro{RTE1}{\textit{REVERSION TO ETHYLENE 1}}
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\acro{RTH}{\textit{RTE1-HOMOLOG}}
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\acro{SDS}{\textit{sodium dodecylsulfate}, Natriumdodecylsulfat}
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\acro{SDS-PAGE}{\textit{sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis}, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\acro{SOPMA}{\textit{self-optimized prediction method}}
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\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
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\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
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\end{acronym}
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@ -32,6 +32,7 @@ Andere Häm-bindende Proteine weisen K$_\text{d}$-Werte im mikromolaren bis ober
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\end{tabularx}
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\label{tab:haemin_kinetik}
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\end{table}
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\pagebreak
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\section{Spezifität der Häminbindung}
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Dass es sich bei der im Häminagarose-Assay beobachteten Bindung von \ac{RTE1} an das Säulenmaterial (vgl. \ref{sec:ergebnis_haeminagarose}) um eine spezifische Bindung handelt, kann als gesichert betrachtet werden, da eine Elution nicht nur unter denaturierenden Bedingungen -- mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen -- sondern auch durch Waschen mit einer Häminlösung erfolgt. Unspezifisch an die Trägermatrix gebundenes Protein ließe sich hierdurch nicht eluieren. Bei einer spezifischen Bindung an das an der Matrix immobilisierte Hämin kann dieses als Bindungspartner durch das freie Hämin in der Lösung verdrängt werden, wodurch das Protein eluiert.
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@ -52,8 +52,7 @@ Nach diesem Modell \ac{RTE1} reguliert die Ethylenantwort über eine Konformatio
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Homologe zu \ac{RTE1} wurden in einer Vielzahl weiterer Eukaryoten mit Ausnahme der Pilze gefunden, beispielsweise in \textit{Homo sapiens}, \textit{Drosophila melanogaster}, \textit{Caenorhabditis elegans} und \textit{Plasmodium}. Das menschliche Homolog weist eine Sequenzidentität im Vergleich zu \ac{RTE1} aus \ac{A. thaliana} von \SI{40,5}{\percent} auf \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Nach bisherigem Kenntnisstand verfügen die genannten Spezies über jeweils eine Kopie des Gens, mit Ausnahme von \ac{A. thaliana}, bei welcher sich eine zweite Kopie -- \ac{RTH} -- mit \SI{51}{\percent} Sequenzidentität findet \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies ohne Ethylenrezeptoren \citep{resnick_involvement_2008} lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Durch Sequenz-\textit{Alignments} konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cystein- und Histidinreste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-1} ist Cys$^\text{161}$ durch ein Tyrosin ersetzt. Darüberhinaus zeigen sequenzbasierte Vorhersagen, dass pflanzliche \ac{RTE1}-Homologe zwei bis vier Transmembrandomänen besitzen, eine nahe des N-Terminus sowie zwei bis drei am C-Terminus. In \textit{rte1-2} sind durch einen von einer \textit{missense}-Mutation hervorgerufenen \textit{Frameshift} die letzten 27 Aminosäurereste, welche sich in einer vorhergesagten Transmembrandomäne befinden, durch 15 inkorrekte Reste ersetzt worden, was vermutlich zu einer falschen Ausrichtung des Proteins in der Membran führt. Tierische Homologe zeigen in der Sequenzanalyse die ersten drei Transmembrandomänen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies ohne Ethylenrezeptoren \citep{resnick_involvement_2008} lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Durch Sequenz-\textit{Alignments} konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cystein- und Histidinreste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-1} ist Cys$^\text{161}$ durch ein Tyrosin ersetzt. Darüberhinaus zeigen sequenzbasierte Vorhersagen, dass pflanzliche \ac{RTE1}-Homologe zwei bis vier Transmembrandomänen besitzen, eine nahe des N-Terminus sowie zwei bis drei am C-Terminus. \pagebreak In \textit{rte1-2} sind durch einen -- von einer \textit{missense}-Mutation hervorgerufenen -- \textit{Frameshift} die letzten 27 Aminosäurereste, welche sich in einer vorhergesagten Transmembrandomäne befinden, durch 15 inkorrekte Reste ersetzt worden. Dies führt vermutlich zu einer falschen Ausrichtung des Proteins in der Membran. Tierische Homologe zeigen in der Sequenzanalyse die ersten drei Transmembrandomänen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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\section{Zielsetzung}
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In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Eigenschaften von \ac{RTE1} näher charakterisiert werden. Da für das humane Homolog von \ac{RTE1} eine Häminbindung bereits nachgewiesen werden konnte \citep{chang_2009}, sollte der Fokus dieser Arbeit auf dem Nachweis und wenn möglich auch der Quantifizierung einer Häminbindung von \ac{RTE1} liegen.
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In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Eigenschaften von \ac{RTE1} näher charakterisiert werden. Da für das humane Homolog von \ac{RTE1} eine Häminbindung bereits nachgewiesen werden konnte \citep{chang_2009}, sollte der Fokus dieser Arbeit auf dem Nachweis und wenn möglich auch der Quantifizierung einer Häminbindung von \ac{RTE1} liegen.
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\chapter{Einleitung}
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\section{Das Phytohormon Ethylen}
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Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanzen viele Aspekte von Entwicklung, Wachstum und Stressantwort reguliert \citep{kendrick_ethylene_2008}.
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\textit{In vivo} wird Ethylen aus der Aminosäure Methionin synthetisiert, welche über \ac{AdoMet} und \ac{ACC} in Ethylen umgewandelt wird. Dies geschieht unter ATP-Verbrauch im Cytoplasma, wobei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, die Umwandlung von \ac{AdoMet} zu \ac{ACC}, von der \ac{ACC}-Synthase katalysiert wird. Aus dem freiwerdenden 5'-Methylthioadenosin wird im Yang-Zyklus Methionin regeneriert (vgl. Abbildung \ref{fig:yang_zyklus}).
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\begin{figure}[htbp!]
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\caption[Ethylensynthese und Yang-Zyklus]{Ethylensynthese ausgehend von Methionin und Regeneration von Methionin im Yang-Zyklus \citep{taiz_plant_2007}}
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\label{fig:yang_zyklus}
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\end{figure}
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\clearpage
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\section{Ethylensignalweg}
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Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können \citep{resnick_involvement_2008}. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Durch die Bindung von Ethylen wird die nachgeschaltete \acs{MAP}-Kinase-Kinase-Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).
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In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4) welche mit prokaryotischen Zwei-Komponenten-Histidinkinasen verwandt sind \citep{voet-van-vormizeele_mutants_2008}. Diese Rezeptoren zeigen eine funktionelle Redundanz und sind negative Regulatoren der Ethylenantwort \citep{resnick_involvement_2008}.
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\caption[Ethylen-Signalweg]{Schematische Darstellung des Ethylen-Signalweges \citep{kendrick_ethylene_2008}}
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\label{fig:ethylen_signalweg}
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\end{figure}
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\clearpage
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\section{\acs{RTE1} im Ethylensignalweg}
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Bei \ac{RTE1} handelt es sich um ein Homodimer (MW Monomer: \SI{28}{\kilo\dalton}), welches kolokalisiert mit dem Ethylenrezeptor \ac{ETR1} in der Membran des Golgi-Apparates bzw. des \ac{ER} vorliegt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Entdeckt wurde es bei der Suche nach zusätzlichen Komponenten des Ethylensignalweges. Die Ethylen-insensitiven Mutante \textit{etr1-2} zeigt bei Anwesenheit von Ethylen und Wachstum im Dunkeln \textit{nicht} den üblichen Phänotyp der Dreifachantwort: Verdickung und Verkürzung des Hypokotyls, Hemmung des Wurzelwachstums und Krümmung des Apikalhakens. Bei \textit{etr1-2} beruht die Insensitivität gegenüber Ethylen im Gegensatz zu \textit{etr1-1} nicht auf dem Unvermögen den für die Ethylenbindung erforderlichen Kofaktor Kupfer zu binden, sondern auf der Blockade der Weiterleitung des Ethylensignals zur Signaldomäne des Rezeptors. Es wird vermutet, dass die auf die Ethylenbindung folgende Konformationsänderung verhindert wird \citep{resnick_involvement_2008}.
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Durch Mutagenese wurden Keimlinge aus dieser \textit{etr1-2}-Population erzeugt, welche wieder die Dreifachantwort \textit{zeigten}. Durch Komplementierungsversuche wurden die Mutanten \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} als allelisch identifiziert. Da beide Mutanten eine Ethylenantwort ähnlich der des Wildtyps aufwiesen, konnte darauf geschlossen werden, dass ein funktionelles \ac{RTE1} für die Insensitivität der \textit{etr1-2}-Mutanten notwendig ist. Folglich muss \ac{RTE1} zu einem frühen Zeitpunkt innerhalb des Ethylensignalweges gemeinsam mit \ac{ETR1} wirksam sein. Ein weiteres Allel \textit{rte1-3} wurde nach Analyse der Gensequenz von \ac{RTE1} identifiziert. Alle \ac{RTE1}-Mutanten zeigten einen ähnlichen Phänotyp, woraus geschlossen wurde, dass \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} \textit{loss-of-function}-Allele darstellen. Bei \textit{rte1-3} handelt es sich vermutlich um eine Nullmutation \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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\textit{rte1-2} ist in der Lage, eine Reihe von Mutationen in \ac{ETR1} zu unterdrücken -- beispielsweise \textit{etr1-2} -- allerdings nur bei Mutationen, welche die eigentliche Ethylenbindung nicht oder zumindest nicht vollständig verhindern \citep{resnick_involvement_2008}.
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Weitere Versuche zeigten, dass eine Überexpression von \ac{RTE1} im Wildtyp zu einer verminderten Ethylensensitivität führt, was die Annahme stützte, dass es sich bei \ac{RTE1} um einen negativen Regulator der Ethylenantwort handelt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Ebenso konnte durch die Analyse des Phänotyps von Doppel- und Dreifachmutanten mit \textit{etr1-2}, \textit{rte1-2} und \textit{ran1-3} gezeigt werden, dass \ac{RTE1} unabhängig von \ac{RAN1} auf die Ethylensignalkaskade wirkt \citep{resnick_involvement_2008}. So ist die Funktion von \ac{ETR1} im Wildtyp sowohl von \ac{RTE1} als auch von \ac{RAN1} abhängig, in \textit{etr1-2} hingegen nur von \ac{RTE1}. Hiervon ausgehend wurde das nachfolgend dargestellte (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}) Modell zum Signalzustand von \ac{ETR1} vorgeschlagen \citep{resnick_involvement_2008}.
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Nach diesem Modell \ac{RTE1} reguliert die Ethylenantwort über eine Konformationsänderung der Ethylen"=Bindedomäne des Rezeptors ETR1 (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}). Hierfür wurden zwei unterschiedliche Möglichkeiten vorgeschlagen. Die erste besagt, dass ETR1 von einer nicht-funktionellen Konformation mit Hilfe von RTE1 in eine funktionelle Konformation übergeht, in welchem der Rezeptor sich in seinem "`an"'-Zustand befindet und die Ethylenantwort unterdrückt. In diesem Zustand kann nun auch Ethylen gebunden werden, wobei ETR1 in eine intermediäre Konformation übergeht, welche ebenfalls den "`an"'-Zustand repräsentiert und schließlich durch eine Konformationsänderung in den "`aus"'-Zustand wechselt. Die zweite Möglichkeit binhaltet, dass \ac{RTE1} am Übergang von \ac{ETR1} aus der inaktiven Form mit gebundenem Ethylen in den intermediären Zustand beteiligt ist. In beiden Möglichkeiten fördert \ac{RTE1} den inaktiven Zustand \citep{resnick_involvement_2008}.
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\citet{resnick_involvement_2008} schlagen vor, dass \ac{RTE1} nach der ersten beschriebenen Möglichkeit wirkt und begründen dies mit der phänotypischen Ähnlichkeit von \textit{rte1 loss-of-function}-Mutationen mit der \textit{etr1}-Nullmutante. Der nicht-funktionelle Grundzustand von \ac{ETR1} entspräche dann phänotypisch der \textit{etr1}-Nullmutante.
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/ETR1-Zustaende.pdf}
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% ETR1-Zustaende.pdf: 870x309 pixel, 72dpi, 30.69x10.90 cm, bb=0 0 870 309
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\caption[Modell des Signalzustandes von ETR1]{Modell des Signalzustandes von ETR1 \citep[eigene Abbildung nach][]{resnick_involvement_2008}; Es wurden zwei mögliche Wirkungsweisen von \ac{RTE1} auf \ac{ETR1} vorgeschlagen: Nach der ersten Möglichkeit bewirkt \ac{RTE1} den Übergang von \ac{ETR1} von einer nicht-funktionellen (I) in eine funktionelle Konformation (II). Diese spiegelt den "`an"'-Zustand des Rezeptors wider. Wird Ethylen gebunden, geht der Rezeptor in einen intermediären Zustand (III) über, aus welchem er in den "`aus"'-Zustand (IV) wechselt. Die zweite Möglichkeit beinhaltet, dass \ac{RTE1} am Übergang vom "`aus"'-Zustand (IV) in den intermediären Zustand (III) beteiligt ist, aus welchem \ac{ETR1} dann in zurück in den "`an"'-Zustand (II) wechselt. In beiden Fällen fördert \ac{RTE1} den aktiven Zustand des Rezeptors.}
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\label{fig:etr1_zustaende}
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\end{figure}
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Homologe zu \ac{RTE1} wurden in einer Vielzahl weiterer Eukaryoten mit Ausnahme der Pilze gefunden, beispielsweise in \textit{Homo sapiens}, \textit{Drosophila melanogaster}, \textit{Caenorhabditis elegans} und \textit{Plasmodium}. Das menschliche Homolog weist eine Sequenzidentität im Vergleich zu \ac{RTE1} aus \ac{A. thaliana} von \SI{40,5}{\percent} auf \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Nach bisherigem Kenntnisstand verfügen die genannten Spezies über jeweils eine Kopie des Gens, mit Ausnahme von \ac{A. thaliana}, bei welcher sich eine zweite Kopie -- \ac{RTH} -- mit \SI{51}{\percent} Sequenzidentität findet \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies ohne Ethylenrezeptoren \citep{resnick_involvement_2008} lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Durch Sequenz-\textit{Alignments} konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cystein- und Histidinreste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-1} ist Cys$^\text{161}$ durch ein Tyrosin ersetzt. Darüberhinaus zeigen sequenzbasierte Vorhersagen, dass pflanzliche \ac{RTE1}-Homologe zwei bis vier Transmembrandomänen besitzen, eine nahe des N-Terminus sowie zwei bis drei am C-Terminus. In \textit{rte1-2} sind durch einen von einer \textit{missense}-Mutation hervorgerufenen \textit{Frameshift} die letzten 27 Aminosäurereste, welche sich in einer vorhergesagten Transmembrandomäne befinden, durch 15 inkorrekte Reste ersetzt worden, was vermutlich zu einer falschen Ausrichtung des Proteins in der Membran führt. Tierische Homologe zeigen in der Sequenzanalyse die ersten drei Transmembrandomänen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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\section{Zielsetzung}
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In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Eigenschaften von \ac{RTE1} näher charakterisiert werden. Da für das humane Homolog von \ac{RTE1} eine Häminbindung bereits nachgewiesen werden konnte \citep{chang_2009}, sollte der Fokus dieser Arbeit auf dem Nachweis und wenn möglich auch der Quantifizierung einer Häminbindung von \ac{RTE1} liegen.
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@ -40,8 +40,6 @@ Unter denaturierenden Bedingungen lassen sich auch \textit{Inclusion-Bodies} sol
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\label{sec:ergebnis_haeminagarose}
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Das gereinigte \ac{RTE1} wurde wie unter \ref{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet} beschrieben mit Häminagarose inkubiert. Gebundenes \ac{RTE1} wurde mittels Erhitzen in 2x SDS-Probenpuffer oder über die Zugabe von Hämin eluiert. Die \acs{SDS-PAGE} der Proben aus dem Häminagarose-Assay zeigt in der Elutionsfraktion eine Bande bei \SI{28}{\kilo\dalton}. Eine entsprechende Bande zeigt sich im aufgetragenen Proteinkonzentrat. Im Durchlauf ist nur ein sehr schwaches Signal zu erkennen, die Waschfraktionen weisen keine sichtbaren Banden auf (Abbildung \ref{fig:haeminagarose}).
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Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elution eine Lösung von freiem Hämin (\SI{11}{\milli\Molar}) eingesetzt. Auch hier zeigte sich eine -- allerdings schwächere -- Bande in der Elutionsfraktion. Danach noch gebundenes Protein wurde wie zuvor mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen eluiert (Abbildung \ref{fig:haeminagarose_2}).
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/haeminagarose_assay/haemin_agarose_batch_11_08_10_beschriftet.pdf}
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@ -50,6 +48,8 @@ Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elut
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\label{fig:haeminagarose}
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\end{figure}
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Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elution eine Lösung von freiem Hämin (\SI{11}{\milli\Molar}) eingesetzt. Auch hier zeigte sich eine -- allerdings schwächere -- Bande in der Elutionsfraktion. Danach noch gebundenes Protein wurde wie zuvor mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen eluiert (Abbildung \ref{fig:haeminagarose_2}).
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\begin{figure}[htbp!]
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\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/haeminagarose_assay/haemin_agarose_batch_11_08_10_2_beschriftet.pdf}
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@ -109,7 +109,7 @@ a sei hierbei die Kapazität. Die entsprechenden Auftragungen und Sättingungsfu
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\section{Fluoreszenzspektroskopischer Nachweis der Häminbindung}
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\label{sec:ergebnis_fluoreszenzspektroskopie}
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Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei einem pH von 7,5 zeigte, wurde diese Bedingung auch für die Fluoreszenzspektroskopie gewählt. Nach Anregung bei einer Wellenlänge von \SI{280}{\nano\meter} und Abzug des Pufferspektrums ergaben sich die in Abbildung \ref{fig:fluoreszenz_spektrum} dargestellten Emissionsspektren. Es zeigte sich ein deutlicher Quench bei zunehmender Häminkonzentration, der seine volle Ausprägung bei einer Häminkonzentration von \SIrange{20}{40}{\micro\Molar} erreichte. Die Analyse der Daten ergibt einen K$_\text{d}$-Wert von \SI{4,9}{\micro\Molar}. Hierfür wurde die relative Intensität des Fluoreszenzsignals bei \SI{353}{\nano\meter} im Vergleich zum Signal von \ac{RTE1} ohne Häminzugabe gegen die eingesetzte Häminjonzentration aufgetragen. Es wurde eine nichtlineare Regression durchgeführt (vgl. \ref{sec:ergebnis_photometrie}). Der K$_\text{d}$ konnte dann Gleichung \ref{eq:bindung} entnommen werden.
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Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei einem pH von 7,5 zeigte, wurde diese Bedingung auch für die Fluoreszenzspektroskopie gewählt. Nach Anregung bei einer Wellenlänge von \SI{280}{\nano\meter} und Abzug des Pufferspektrums ergaben sich die in Abbildung \ref{fig:fluoreszenz_spektrum} dargestellten Emissionsspektren. Es zeigte sich ein deutlicher Quench bei zunehmender Häminkonzentration, der seine volle Ausprägung bei einer Häminkonzentration von \SIrange{20}{40}{\micro\Molar} erreichte.
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\begin{figure}[htbp!]
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@ -119,6 +119,8 @@ Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei
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\label{fig:fluoreszenz_spektrum}
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\end{figure}
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Die Analyse der Daten ergibt einen K$_\text{d}$-Wert von \SI{4,9}{\micro\Molar}. Hierfür wurde die relative Intensität des Fluoreszenzsignals bei \SI{353}{\nano\meter} im Vergleich zum Signal von \ac{RTE1} ohne Häminzugabe gegen die eingesetzte Häminjonzentration aufgetragen. Es wurde eine nichtlineare Regression durchgeführt (vgl. \ref{sec:ergebnis_photometrie}). Der K$_\text{d}$ konnte dann Gleichung \ref{eq:bindung} entnommen werden.
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/fluoreszenz_assay/binding_inset.pdf}
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@ -2,12 +2,12 @@
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\section{Material}
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\label{sec:material}
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\begin{singlespace}
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\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
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\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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\begin{singlespace}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
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% \begin{tabularx}{0.98\textwidth}{lX}
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\begin{longtable}{p{0.47\textwidth} p{0.47\textwidth}}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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@ -32,10 +32,11 @@
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Spectrophotometer DU 800 & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwabach\\
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Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\
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Ultraschalldesintegrator Branson-Sonifier & Heinemann, Schwäbisch Gmünd\\
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Ultraschalldesintegrator \newline Branson"=Sonifier & Heinemann, Schwäbisch Gmünd\\
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Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\end{longtable}
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% \end{tabularx}
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%\end{center}
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\subsection{Verbrauchsmaterialien}
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@ -74,12 +75,12 @@
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\end{tabularx}
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%\end{center}
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\pagebreak
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\subsection{Chemikalien}
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\label{sec:chemikalien}
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%\begin{center}
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% \begin{tabularx}{\textwidth}{XrX}
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\begin{longtable}{p{0.36\textwidth} r p{0.39\textwidth}}
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\begin{longtable}{p{0.33\textwidth} r p{0.38\textwidth}}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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@ -94,7 +95,7 @@
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\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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Essigsäure & 64-19-7 & VWR, Darmstadt\\
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Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
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Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 \newline (n-Hexadecylphosphocholin) & 58066-85-6 & Affymetrix, Wooburn Green, UK\\
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Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 \newline (n"=Hexadecylphosphocholin) & 58066-85-6 & Affymetrix, Wooburn Green, UK\\
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Formaldehyd & 50-00-0 & AppliChem, Darmstadt\\
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Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Hämin & 16009-13-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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@ -208,6 +209,7 @@
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\end{description}
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\clearpage
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\subsection{Puffer und Lösungen für die denaturierende Reinigung}
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\label{sec:puffer_denaturierende_reinigung}
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\begin{description}
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@ -313,6 +315,7 @@
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\end{description}
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\end{singlespace}
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\clearpage
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\section{Methoden}
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\label{sec:methoden}
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@ -476,7 +479,7 @@ Es folgte eine Inkubation bei \SI{37}{\celsius} für \SI{30}{\minute} im Brutsch
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\end{tabular}
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\label{tab:bca_ansaetze_proben}
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\end{table}
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\pagebreak
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\subsection{Nachweis der Häminbindung}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung}
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@ -540,7 +543,7 @@ Wie beim photometrischen Bindungsnachweis erfolgte die Bestimmung der tatsächli
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\caption{Häminkonzentration für die Fluoreszenzspektroskopie}
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\begin{tabularx}{0.85\textwidth}{XXX}
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\toprule
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\textbf{Häminkonzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen Stammlösung [\si{\micro\liter}]} & \textbf{Konzentration Stammlösung [\si{\milli\Molar}]}\\
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\small\textbf{Häminkonzentration [\si{\micro\Molar}]} & \small\textbf{Volumen Stammlösung [\si{\micro\liter}]} & \small\textbf{Konzentration Stammlösung [\si{\milli\Molar}]}\\
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\midrule
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0 & 0 &\multirow{8}{*}{\SI{0,275}{\milli\Molar}}\\
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0,5 & 0,9 &\\
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@ -6,7 +6,7 @@ Hierfür wurde der \ac{RTE1}-kodierende Genabschnitt in einen aus pET-15b abgele
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Zum Nachweis einer Häminbindung kam zunächst ein Häminagaroseassay zum Einsatz. Hämin ist hierbei an einer Agarosematrix immobilisiert und kann mit \ac{RTE1} in Lösung interagieren. Die Elution von gebundenem \ac{RTE1} erfolgte denaturierend oder unter Zugabe von freiem Hämin. In beiden Fällen ließ sich eine Bindung nachweisen.
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Darüberhinaus wurden Messungen im UV-Vis-Spektrophotometer durchgeführt. \ac{RTE1} mit gebundenem Hämin zeigt hier einen Absorptionsanstieg im Soret-Band bei gleichzeitiger Blauverschiebung, wobei letztere für die Bestimmung eines K$_\text{d}$-Wertes herangezogen wurde. Im Fluoreszenzspektrometer führt die Zugabe von Hämin zu einem Quench der Tryptophanfluoreszenz, welcher ebenfalls zur K$_\text{d}$-Bestimmung ausgewertet wurde. Beide Methoden ergaben für pH 7,5 einen K$_\text{d}$ von \SI[seperr]{7,24(223)}{\micro\Molar} (UV-Vis) bzw. \SI[seperr]{4,90(23)}{\micro\Molar} (Fluoreszenz). Es zeigte sich auch, dass die Bindungsaffinität bei saurem pH deutlich geringer ist, als bei physiologischem oder leicht alkalischen pH.
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\pagebreak
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Schließlich konnte mit Hilfe der \ac{CD}-Spektroskopie gezeigt werden, dass die Zugabe von Hämin eine Veränderung der Sekundärstruktur hin zu deutlich höherem \textalpha-helikalem Strukturanteil zur Folge hat.
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Die etablierten Bindungsassays können in zukünftigen Versuchen Hinweise -- beispielsweise zur erfolgreichen Renaturierung von denaturierend gereinigtem \ac{RTE1} -- liefern.
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