\chapter{Diskussion}
\section{Nachweis und Quantifizierung der Häminbindung}
Die Ergebnisse aller zum Bindungsnachweis eingesetzten Methoden lassen auf eine Häminbindung durch \ac{RTE1} schließen. Zunächst ist aus dem Häminagarose-Assay ersichtlich, dass eine stabile Bindung von \ac{RTE1} an immobilisiertes Hämin zu Stande kommt. Durch einfache Waschschritte mit Puffer konnte \ac{RTE1} nicht mehr vom Säulenmaterial eluiert werden, erst unter denaturierenden Bedingungen oder Einsatz einer Häminlösung kam es zur Elution. Dies deutet auf eine relativ stabile Bindung von \ac{RTE1} an die Häminagarose hin.

Beim photometrischen Bindungsassay (siehe \ref{sec:ergebnis_photometrie}) zeigt sich das Zustandekommen einer Bindung in der Absorptionszunahme im Soretband, sowie der Verschiebung der Absorptionsmaxima. Vergleichbares wurde auch von \citet{vincent_protein_1985}, sowie \citet{duncan_heme-binding_1999} bei ihren Untersuchungen von Häm-bindenden Proteinen beobachtet, so dass das Auftreten von Absorptionszunahme im Soretband und Verschiebung der Maxima als Charakteristikum einer Häminbindung angesehen werden kann.

Die Fluoreszenzspektroskopie zeigte einen sehr deutlichen Quench bei Häminzugabe. Ähnliche Untersuchungen an einem anderen Häm-bindenden Protein wurden von \citet{vincent_protein_1985} durchgeführt. Auch in diesem Fall kann davon ausgegangen werden, dass der Quench durch die Interaktion zwischen \ac{RTE1} und Hämin zu Stande kommt. Im Unterschied zu \citet{vincent_protein_1985} konnte aber bei Anregung mit \SI{278}{\nano\meter} kein Emissionspeak von Tyrosin bei \SI{305}{\nano\meter} festgestellt werden. Stattdessen zeigte sich eine Tryptophanfluoreszenz mit einem Maximum bei \SI{350}{\nano\meter}, welche letztlich auch für die Messung genutzt wurde.

Sehr deutlich ist die Änderung in der Sekundärstruktur von \ac{RTE1} bei Zugabe von Hämin. Der \textalpha-helikale Anteil verdoppelt sich nahezu, während der Anteil an \textbeta-Faltblättern stark zurückgeht. Eine Änderung in der Sekundärstruktur bei der Zugabe eines Liganden kann als Hinweis auf eine Bindung gedeutet werden. Die Aussagekraft der Daten aus der \ac{CD}-Spektroskopie wird allerdings dadurch gemindert, dass hierbei die Spektren aus zwei unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1} miteinander verglichen wurden. Es ist dabei nicht auszuschließen, dass präparationsbedingte Unterschiede -- beispielsweise durch Variationen in Reinheit und Konzentration von \ac{RTE1} oder der Konzentration verschiedener Ionen -- die Messung direkt oder indirekt beeinflusst haben. Somit sollte diese Messreihe mit Proteinproben aus derselben Präparation wiederholt werden.

Die Quantifizierung der Häminbindung ergab ausgehend von der photometrischen Messung einen K$_\text{d}$-Wert von bei \SI[seperr]{7,24(223)}{\micro\Molar} bei pH 7,5. Ein ähnlicher K$_\text{d}$ von \SI[seperr]{8,40(104)}{\micro\Molar} wurde für pH 8,5 bestimmt. Unter Berücksichtigung der Standardabweichung sind beide als nahezu identisch zu bewerten. Der K$_\text{d}$ bei pH 6,5 lag um eine Größenordnung höher bei \SI[seperr]{79,6(127)}{\micro\Molar}.  Bei der Interpretation dieser Daten ist zu beachten, dass bei pH 6,5 die Sättigung nicht annähernd erreicht wurde und somit die Regression relativ ungenau ist. Hierauf deutet vor allem die viel zu hohe Kapazität hin, während durch die Normierung ein Wert von eins zu erwarten wäre. Trotzdem zeigt sich, dass die Bindung von Hämin an \ac{RTE1} bei saurem pH deutlich schwächer ist, als bei physiologischem oder leicht alkalischem pH.

Die in der photometrischen Messung erhobenen Daten lassen sich durch die Fluoreszenzspektroskopie bestätigen. Hierbei ergab sich ein K$_\text{d}$ von \SI[seperr]{4,90(23)}{\micro\Molar} bei pH 7,5. Dieser Wert entspricht nahezu dem photometrisch bestimmten K$_\text{d}$-Wert in seinem unteren Grenzwert. Allgemein betrachtet besitzt die Fluoreszenzspektroskopie im Vergleich zur UV-Vis-Spektroskopie die höhere Aussagekraft, da die Fluoreszenzsignale mit höherer Sensitivität detektiert werden können, während bei der UV-Vis-Spektroskopie bei zunehmender Absorption Störeffekte auftreten. Daher konnte auch bei höheren Häminkonzentrationen gemessen werden, als beim photometrischen Bindungsassay.

Des Weiteren muss auch hier beachtet werden, dass beim photometrischen Bindungsassay und der Fluoreszenzspektroskopie \ac{RTE1} aus unterschiedlichen Präparationen zum Einsatz kam. Auch hier kann nicht ausgeschlossen werden, dass präparationsbedingte Unterschiede die Ergebnisse beeinflusst haben. So wäre denkbar, dass verschiedene lösliche \ac{RTE1}-Spezies mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften in variablen Konzentrationen vorlagen, oder aber unterschiedliche Ionenkonzentrationen -- beispielsweise \ce{K^+} -- die Affinität von \ac{RTE1} zu Hämin beeinflusst haben. Somit sollte auch hier zur Verifizierung eine gemeinsame Messreihe mit \ac{RTE1} aus derselben Präparation durchgeführt werden.

Andere Häm-bindende Proteine weisen K$_\text{d}$-Werte im mikromolaren bis oberen nanomolaren Bereich auf (Tabelle \ref{tab:haemin_kinetik}). Insofern scheinen die ermittelten K$_\text{d}$-Werte für \ac{RTE1} in einem für Häm-bindende Proteine realistischen Bereich zu liegen.

\begin{table}[ht]
\centering
\caption[K$_\text{d}$ verschiedener Häm-bindender Proteine im Vergleich zu \ac{RTE1}]{K$_\text{d}$ verschiedener Häm-bindender Proteine im Vergleich zu \ac{RTE1}. Für \ac{RTE1} ist der K$_\text{d}$ aus der Fluoreszenzspektroskopie bzw. in Klammern aus dem photometrischen Bindungsassay angegeben. Bei denen zum Vergleich herangezogenen Proteinen handelt es sich um \acl{RFABG} (\acs{RFABG}), \acl{HBP} (\acs{HBP}) und \acl{HasAp} (\acs{HasAp})}
\begin{tabularx}{\textwidth}{Xcl}
\toprule
\textbf{Protein} & \textbf{K$_\text{d}$ [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Literatur}\\
\midrule
\acs{RFABG} & 0,38 & \citet{duncan_heme-binding_1999}\\
\acs{HBP}   & 0,43 & \citet{vincent_protein_1985}\\
\acs{HasAp} & 35 & \citet{yukl_kinetic_2010}\\
\midrule
\ac{RTE1} & \num[seperr]{4,90(23)} (\num[seperr]{7,24(223)}) & \\
\bottomrule
\end{tabularx}
\label{tab:haemin_kinetik}
\end{table}

\section{Spezifität der Häminbindung}
Dass es sich bei der im Häminagarose-Assay beobachteten Bindung von \ac{RTE1} an das Säulenmaterial (vgl. \ref{sec:ergebnis_haeminagarose}) um eine spezifische Bindung handelt, kann als gesichert betrachtet werden, da eine Elution nicht nur unter denaturierenden Bedingungen -- mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen -- sondern auch durch Waschen mit einer Häminlösung erfolgt. Unspezifisch an die Trägermatrix gebundenes Protein ließe sich hierdurch nicht eluieren. Bei einer spezifischen Bindung an das an der Matrix immobilisierte Hämin kann dieses als Bindungspartner durch das freie Hämin in der Lösung verdrängt werden, wodurch das Protein eluiert.

\citet{tsutsui_affinity_1982} beschreiben eine Möglichkeit das immobilisierte Hämin durch Natronlauge weitestgehend von der Agarosematrix zu lösen. Die damit erhaltenen Agarosebeads ohne gebundenes Hämin könnten dann zur Quantifizierung einer möglichen unspezifischen Bindung an die Matrix dienen. Hierdurch ließe sich in zukünftigen Versuchen der Anteil des spezifisch bindenden Proteins bestimmen.

\section{Ausblick}
Es konnten Bindungsassays für die Häminbindung von \ac{RTE1} etabliert werden, welche rein qualitativ (Häminagarose) oder auch quantitativ (UV-Vis-Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie) eingesetzt werden können. Sollte die Häminbindung ein Charakteristikum eines funktionell gefalteten \ac{RTE1} sein, so ließe sich mit Hilfe dieser Assays überprüfen, ob ein denaturierend gereinigtes \ac{RTE1} wieder erfolgreich renaturiert werden kann. Wie in Kapitel \ref{sec:ergebnis_denaturierende_reinigung} beschrieben, ergeben sich aus der denaturierenden Reinigung durch die Solubilisierung von \textit{Inclusion Bodies} weitaus höhere Proteinausbeuten. Sollte die Rückfaltung gelingen, ließe sich genügend Protein für Kristallisationsansätze gewinnen, welche letztlich eine Vorbereitung zur Strukturaufklärung mittels Röntgenkristallographie wären.

Darüberhinaus zeigt sich, dass die Häminbindung nicht ein Alleinstellungsmerkmal des humanen \ac{RTE1}-Homologs ist, sondern auch in \ac{A. thaliana} und möglicherweise auch anderen pflanzlichen und tierischen \ac{RTE1}-Homologen zu finden ist. Damit stellt sich die Frage nach der Funktion dieser Bindung, oder ob diese in Pflanzen ohne funktionellen Hintergrund zufällig entstand und erst in tierischen Organismen ohne Ethylensignalweg eine biologisch signifikante Funktion erhielt. Möglicherweise liegt hier auch die Erklärung weshalb \ac{RTE1}-Homologe konserviert in einer Vielzahl von Eukaryoten mit Ausnahme der Pile zu finden sind, von denen -- abgesehen von den Pflanzen -- keine einen bekannten Ethylensignalweg aufweisen.

Weitere Versuche könnten außerdem zum Einfluss des Redoxstatus auf die Bindungseigenschaften durchgeführt werden. Hierfür könnten Disulfidbrücken in \ac{RTE1} zunächst mit \ac{DTT} reduziert und die Cysteine mit \ac{NEM} als Schutzgruppe modifiziert werden. \ac{DTT} würde entfernt, um nicht mit dem zugesetzten oder an die Häminagarose gebundenen Hämin zu reagieren. Der weitere Verlauf entspräche dann den hier beschriebenen Bindungsassays. In diesem Zusammenhang wäre zunächst auch die Kenntnis über den Anteil an freien Sulfhydrylgruppen im Protein von Interesse, welche nach Ellmann \citep{riener_quick_2002} bestimmt werden kann.

Zur Optimierung des photometrischen Bindungsassays könnte ein \textit{NanoDrop}-Spektralphotometer zum Einsatz kommen. Da hier bei einem Probenvolumen von etwa \SI{1}{\micro\liter} eine Schichtdicke von \SI{1}{\milli\meter} erreicht wird, können Proben bis zu einer Absorption von 300 vermessen werden. Somit könnten auch höhere Häminkonzentrationen eingesetzt werden, wie sie beispielsweise nötig wären, um bei pH 6,5 eine Sättigung zu erreichen. Gleichzeitig würde nur ein Bruchteil der bisher benötigten Proteinmenge verbraucht.