\chapter{Ergebnisse}
\section{Native Reinigung von \acs{RTE1}}
\label{sec:ergebnis_native_reinigung}
Die native Reinigung nach dem angepassten Protokoll (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) zeigte vergleichbare Ergebnisse zum ursprünglichen Reinigungsprotokoll \citep{malach_expression_2009}, so dass auf Grund der einfacheren Verfahrensweise dieses auch im weiteren Verlauf der Arbeit angewandt wurde.

Sowohl Westernblot (Abbildung \ref{fig:blot_reinigung}), als auch SDS-PAGE (Abbildung \ref{fig:sds-page_reinigung}) zeigen einen großen Anteil nicht solubilisierten Proteins im Größenbereich um \SI{28}{\kilo\dalton}. Darüberhinaus zeigen sich Multimere unterschiedlicher Molekularität. Durchschnittlich ließen sich aus \SI{4}{\gram} Zellen etwa \SI{0,75}{\milli\gram} Protein reinigen.

\begin{figure}[htbp!]
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 \caption[SDS-PAGE der native Reinigung von RTE1]{SDS-PAGE der native Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Solubilisat (S), Überstand aus Ultrazentrifugation (ÜS), Pellet aus Ultrazentrifugation (P), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Zahlen unterhalb von E250 geben die Säulenvolumen an. Rot umrandet wurden die Banden des \ac{RTE1}-Monomers (\SI{28}{\kilo\dalton}), blau umrandet die eines mutmaßlichen \ac{RTE1}-Dimers (\SI{56}{\kilo\dalton}). Deutlich sind bei P große Mengen nicht solubilisierten Proteins (\SI{28}{\kilo\dalton}) zu erkennen.}
 \label{fig:sds-page_reinigung}
\end{figure}

\begin{figure}[htbp!]
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 % blot_17_08_10_beschriftet.pdf: 980x407 pixel, 72dpi, 34.57x14.36 cm, bb=0 0 980 407
 \caption[Westernblot der nativen Reinigung von \ac{RTE1}]{Westernblot der nativen Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Solubilisat (S), Überstand aus Ultrazentrifugation (ÜS), Pellet aus Ultrazentrifugation (P), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Zahlen unterhalb von E250 geben die Säulenvolumen an. Chemilumineszenzsignale sind rot hervorgehoben, Markerbanden grün. Gut zu erkennen sind die Signale in der ersten Elutionsfraktion, sowie dem Solubilisat und Pellet nach Ultrazentrifugation. In letzterem zeigt sich, dass große Mengen \ac{RTE1} nicht solubilisiert wurden. In S und P zeigen sich \ac{RTE1}-Multimere bzw. Aggregate.}
 \label{fig:blot_reinigung}
\end{figure}
\clearpage
\section{Denaturierende Reinigung}
\label{sec:ergebnis_denaturierende_reinigung}
In der Regel konnte unter nativen Bedingungen \ac{RTE1} in ausreichender Menge für die nachfolgenden Versuche präpariert werden. In einigen Fällen schlug die Solubilisierung von \ac{RTE1} allerdings fehl, so dass die Möglichkeit einer denaturierenden Reinigung in Hinblick auf zukünftige Experimente untersucht wurde.

Unter denaturierenden Bedingungen konnten weitaus größere Mengen \ac{RTE1} gereinigt werden, als mit der nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:ergebnis_native_reinigung}). Das SDS-Gel zeigt entsprechend kräftigere Banden in den Elutionsfraktionen (Abbildung \ref{fig:sds-page_denaturierende_reinigung}).

\begin{figure}[htbp!]
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 \caption[SDS-PAGE der denaturierenden Reinigung von \ac{RTE1}]{SDS-PAGE der denaturierenden Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Zelllysat (L), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Rot umrandet sind die \ac{RTE1}-Bande.}
 \label{fig:sds-page_denaturierende_reinigung}
\end{figure}

\section{Häminagarose-Assay}
\label{sec:ergebnis_haeminagarose}
Die SDS-PAGE der Proben aus dem Häminagarose-Assay zeigt in der Elutionsfraktion eine Bande bei \SI{28}{\kilo\dalton}. Eine entsprechende Bande zeigt sich im aufgetragenen Proteinkonzentrat. Im Durchlauf ist nur ein sehr schwaches Signal zu erkennen, die Waschfraktionen weisen keine sichtbaren Banden auf (Abbildung \ref{fig:haeminagarose}).

Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elution eine Lösung von freiem Hämin (\SI{11}{\milli\Molar}) eingesetzt. Auch hier zeigte sich eine -- allerdings schwächere -- Bande in der Elutionsfraktion. Danach noch gebundenes Protein wurde wie zuvor mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen eluiert.

\begin{figure}[htbp!]
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 % haemin_agarose_batch_11_08_10_beschriftet.pdf: 683x621 pixel, 72dpi, 24.09x21.91 cm, bb=0 0 683 621
 \caption[SDS-PAGE eines Häminagarose-Assays]{SDS-PAGE eines Häminagarose-Assays; Von links nach rechts: Marker (M), Proteinkonzentrat (K), Durchlauf (D), Waschschritte (W1-3), Elution (E); Eluiert wurde mit 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius}. Die \ac{RTE1}-Banden in Konzentrat und Elution sind durch Pfeile markiert. Beim Auftragen wurden die Verdünnungsfaktoren berücksichtigt. }
 \label{fig:haeminagarose}
\end{figure}

\begin{figure}[htbp!]
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 \caption[Spezifität der Hämin-Bindung]{Spezifität der Hämin-Bindung; Von links nach rechts: Marker (M), Proteinkonzentrat (K), Durchlauf (D), Waschschritte (W1-3), Elutionen (E1, E2); E1 wurde mit \SI{11}{\milli\Molar} freiem Hämin, E2 im Anschluss an E1 mit 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} eluiert. Die \ac{RTE1}-Banden sind durch Pfeile markiert. Die durchgängige Hintergrundfärbung von E1 und E2 und insbesondere die starke Färbung im Bereich unterhalb von \SI{15}{\kilo\dalton} wird durch das freie Hämin hervorgerufen. Beim Auftragen wurden die Verdünnungsfaktoren berücksichtigt. }
 \label{fig:haeminagarose}
\end{figure}

\clearpage
\section{Photometrischer Bindungsassay}
\label{sec:ergebnis_photometrie}
Zur Analyse der Bindungseigenschaften von \ac{RTE1} an Hämin wurden drei Messreihen bei unterschiedlichen pH-Werten -- pH 6,5; pH 7,5; pH 8,5 -- durchgeführt. Hierfür wurden Aliquots der gereinigten Proteinlösung mit einem Volumen von jeweils \SI{2,5}{\milli\liter} wie in \ref{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie} beschrieben in die Waschpuffer pH 6,5, pH 7,5 und pH 8,5 umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden die Proteinlösungen dann auf eine Konzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} verdünnt und in die Messung eingesetzt. Die Obergrenze der eingesetzten Häminkonzentration von \SI{40}{\micro\Molar} ergab sich durch die Spezifikationen des verwendeten Photometers. Eine \SI{50}{\micro\Molar} Häminlösung weist bereits eine maximale Absorption von über 3 auf, der Obergrenze laut Herstellerangaben.

\begin{figure}[htbp!]
 %\centering
 \subfloat[pH 6,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph65_spektrum_klein.pdf}}
 \subfloat[pH 7,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph75_spektrum_klein.pdf}}\\
 \subfloat[pH 8,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph85_spektrum_klein.pdf}}
 \caption[Differenzspektren des photometrischen Bindungsassays]{Differenzspektren des photometrischen Bindungsassays; Insbesondere bei pH 6,5 (a) und pH 7,5 (b) ist deutlich eine Verschiebung der Absorptionsmaxima bei höheren Häminkonzentrationen hin zu kürzeren Wellenlängen sichtbar.}
 \label{fig:spektren_uv_vis}
\end{figure}

Zur Bestimmung des K$_\text{d}$-Werts der Bindung wurde die Verschiebung der Absorptionsmaxima \textDelta A zueinander gegen die größte gemessene Verschiebung normiert und gegen die tatsächlich vorliegende Häminkonzentration c aufgetragen. Letztere wurde über den Absorptionskoeffizienten von Hämin aus den aufgenommenen Pufferspektren bestimmt. Anschließend wurde eine Sättigungsfunktion über eine nichtlineare Regression angepasst:

\begin{equation}
 \Delta A =  \frac{a \cdot c}{K_d + c}
\end{equation}

a sei hierbei die Kapazität. Die entsprechenden Auftragungen und Sättingungsfunktionen sind in Abbildung \ref{fig:fit_uv_vis} dargestellt. Es ergaben sich K$_\text{d}$-Werte von \SI[seperr]{79,60(1272)}{\micro\Molar} (pH 6,5), \SI[seperr]{7,24(223)}{\micro\Molar} (pH 7,5) und \SI[seperr]{8,40(104)}{\micro\Molar} (pH 8,5), wobei jedoch zu beachten ist, dass bei pH 6,5 die Sättigung deutlich nicht erreicht wurde. Bei pH 8,5 streuen hingegen die Messwerte im Vergleich zu pH 7,5 relativ stark.

\begin{figure}[htbp!]
 %\centering
 \subfloat[pH 6,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph65_binding.pdf}}
 \subfloat[pH 7,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph75_binding.pdf}}\\
 \subfloat[pH 8,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph85_binding.pdf}}
 \caption[Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima]{Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima; Bei pH 7,5 und 8,5 ist eine beginnende Sättigung zu erkennen, die Kapaziät liegt hierbei jeweils um 1, die K$_\text{d}$-Werte sind unter Berücksichtigung der Standardabweichung annähernd identisch. Bei pH 8,5 fallen die großen Standardabweichungen der Messwerte, bei pH 6,5 die zu hohe Kapazität auf. Letztere sollte durch die Normierung eigentlich 1 betragen. Darüberhinaus ist bei pH 6,5 die Sättigung noch nicht erreicht.}
 \label{fig:fit_uv_vis}
\end{figure}

\clearpage
\section{Fluoreszenzspektroskopie}
\label{sec:ergebnis_fluoreszenzspektroskopie}

Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei einem pH von 7,5 zeigte, wurde diese Bedingung auch für die Fluoreszenzspektroskopie gewählt. Nach Anregung bei einer Wellenlänge von \SI{280}{\nano\meter} und Abzug des Pufferspektrums ergaben sich die in Abbildung \ref{fig:fluoreszenz_spektrum} dargestellten Emissionsspektren. Es zeigte sich ein deutlicher Quench bei zunehmender Häminkonzentration, der seine volle Ausprägung bei einer Häminkonzentration von \SIrange{20}{40}{\micro\Molar} erreichte. Die Analyse der Daten ergibt einen K$_\text{d}$-Wert von \SI{4,9}{\micro\Molar}.

\begin{figure}[htbp!]
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 \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/fluoreszenz_assay/spektrum.pdf}
 % spektrum.pdf: 428x377 pixel, 72dpi, 15.10x13.30 cm, bb=0 0 428 377
 \caption[Emissionsspektrum des Fluoreszenz-Assays]{Emissionsspektrum des Fluoreszenz-Assays nach Abzug des Pufferspektrums; Die Anregung erfolgte bei \SI{280}{\nano\meter}. Es ist ein deutlicher Quench bei zunehmender Häminkonzentration zu erkennen. Der Quench ist bei etwa \SIrange{20}{40}{\micro\Molar} Hämin vollständig.}
 \label{fig:fluoreszenz_spektrum}
\end{figure}

\begin{figure}[htbp!]
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 \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/fluoreszenz_assay/binding_inset.pdf}
 % spektrum.pdf: 428x377 pixel, 72dpi, 15.10x13.30 cm, bb=0 0 428 377
 \caption[Häminbindung im Fluoreszenz-Assay]{Häminbindung im Fluoreszenz-Assay; Aufgetragen sind die relative Intensität des Fluoreszenzsignals gegen die Häminkonzentration. Letztere wurde aus einer Absorptionsmessung mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten ermittelt. Das Inset zeigt eine halblogarithmische Auftragung der Daten.  In beiden Auftragungen zeigt sich das Erreichen der Sättigung.}
 \label{fig:fluoreszenz_bindung}
\end{figure}
\clearpage

\section{\ac{CD}-Spektroskopie}
\label{sec:ergebnis_cd_spektroskopie}
Die Daten der \ac{CD}-Spektren von \ac{RTE1} mit und ohne Hämin stammen aus unterschiedlichen Präparationen, da während der Messung von \ac{RTE1} mit Hämin ein Defekt an der Küvette und später am Spektrometer auftrat, so dass die Probe mit \ac{RTE1} ohne Hämin aus derselben Präparation nicht mehr gemessen werden konnte. Zum Vergleich wurden daher Daten aus einer vorangegangenen Messung von \ac{RTE1} ohne Hämin unter identischen Bedingungen herangezogen. Abbildung \ref{fig:cd_spektrum} zeigt beide Spektren nach Abzug der Pufferspektren von den Rohdaten.

\begin{figure}[htbp!]
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 \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd_spektroskopie/spektrum.pdf}
 % spektrum.pdf: 548x427 pixel, 72dpi, 19.33x15.06 cm, bb=0 0 548 427
 \caption[\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}]{\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}; Die Daten stammen von unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1}. \ac{RTE1} wurde in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16${^\text{\textregistered}}$ gelöst. Die Proteinkonzentration betrug \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von \SI{0,5}{\nano\meter} (\ac{RTE1} + Hämin) bzw. \SI{1}{\nano\meter} (\ac{RTE1}) und \SI{20}{\nano\meter\per\minute} aufgenommen. Es wurden jeweils 15 Spektren akkumuliert. Deutlich ist in beiden Fällen ein negativer Cotton-Effekt bei etwa \SI{207}{\nano\meter} zu erkennen, welcher charakteristisch für \textalpha-helikale Strukturanteile ist. Der \textalpha-helikale Anteil ist bei Häminzugabe deutlich erhöht. }
 \label{fig:cd_spektrum}
\end{figure}

Anhand der \ac{CD}-Spektren wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit CONTINLL \citep{provencher_estimation_1981} durchgeführt. Sie ergab für \ac{RTE1} ohne Häminzugabe einen Sekundärstrukturanteil von \SI{18}{\percent} \textalpha-Helix, \SI{30}{\percent} \textbeta-Faltblatt, \SI{22}{\percent} \textbeta-Schleife und \SI{30}{\percent} \textit{Random Coil}. Bei Zugabe von Hämin ergibt die Strukturvorhersage Anteile von \SI{44}{\percent} \textalpha-Helix, \SI{6}{\percent} \textbeta-Faltblatt, \SI{25}{\percent} \textbeta-Schleife und \SI{25}{\percent} \textit{Random Coil}. Zusätzlich wurde die Sekundärstruktur von \ac{RTE1} ohne Häminzugabe aus der Aminosäuresequenz mit \acs{SOPMA} berechnet \citep{geourjon_sopma:_1995}. Hierbei wurden \SI{27}{\percent} \textalpha-Helix, \SI{23}{\percent} \textbeta-Faltblatt, \SI{8}{\percent} \textbeta-Schleife und \SI{42}{\percent} \textit{Random Coil} vorhergesagt (Abbildung \ref{fig:strukturvorhersage}). Eine Gegenüberstellung der Sekundärstrukturanteile findet sich in Tabelle \ref{tab:sekundaerstruktur}.

Bei Zugabe von Hämin zeigt sich also ein höherer Anteil von \textalpha-Helices und ein geringerer Anteil \textbeta-Faltblättern.

\begin{table}[ht]
\centering
\small
\caption[Sekundärstrukturanteile]{Sekundärstrukturanteile; Vergleich zwischen Vorhersage aus Aminosäuresequenz und \ac{CD}-Daten}
\begin{tabularx}{\textwidth}{Xllll}
\toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{\textalpha-Helix [\si{\percent}]} & \textbf{\textbeta-Faltblatt [\si{\percent}]} & \textbf{\textbeta-Schleife [\si{\percent}]} & \textbf{\textit{Random Coil} [\si{\percent}]}\\
\midrule
\ac{RTE1} (\ac{SOPMA})         & 27 & 23 & 8 & 42\\
\midrule
\ac{RTE1}             & 18 & 30 & 22 & 30 \\
\ac{RTE1}/Hämin       & 44 & 6 & 25 & 25 \\
\bottomrule
\end{tabularx}
\label{tab:sekundaerstruktur}
\end{table}