\chapter{Ergebnisse}
\section{Native Reinigung von \ac{RTE1}}
\label{sec:ergebnis_native_reinigung}
Die native Reinigung nach dem angepassten Protokoll (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) zeigte vergleichbare Ergebnisse zum ursprünglichen Reinigungsprotokoll \citep{malach_expression_2009}, so dass auf Grund der einfacheren Verfahrensweise dieses auch im weiteren Verlauf der Arbeit angewandt wurde.

Sowohl Westernblot (Abbildung \ref{fig:blot_reinigung}), als auch SDS-PAGE (Abbildung \ref{fig:sds-page_reinigung}) zeigen einen großen Anteil nicht solubilisierten Proteins im Größenbereich um \SI{28}{\kilo\dalton}. Darüberhinaus zeigen sich Multimere unterschiedlicher Molekularität. In der Regel ließen sich aus \SI{4}{\gram} Zellen etwa \SI{0,75}{\milli\gram} Protein reinigen.

\begin{figure}[htbp!]
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 \caption[SDS-PAGE der native Reinigung von RTE1]{SDS-PAGE der native Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Solubilisat (S), Überstand aus Ultrazentrifugation (ÜS), Pellet aus Ultrazentrifugation (P), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Zahlen unterhalb von E250 geben die Säulenvolumen an. Rot umrandet wurden die Banden des \ac{RTE1}-Monomers (\SI{28}{\kilo\dalton}), blau umrandet die eines mutmaßlichen \ac{RTE1}-Dimers (\SI{56}{\kilo\dalton}). Deutlich sind bei P große Mengen nicht solubilisierten Proteins (\SI{28}{\kilo\dalton}) zu erkennen.}
 \label{fig:sds-page_reinigung}
\end{figure}

\begin{figure}[htbp!]
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 \caption[Westernblot der nativen Reinigung von \ac{RTE1}]{Westernblot der nativen Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Solubilisat (S), Überstand aus Ultrazentrifugation (ÜS), Pellet aus Ultrazentrifugation (P), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Zahlen unterhalb von E250 geben die Säulenvolumen an. Chemilumineszenzsignale sind rot hervorgehoben, Markerbanden grün. Gut zu erkennen sind die Signale in der ersten Elutionsfraktion, sowie dem Solubilisat und Pellet nach Ultrazentrifugation. In letzterem zeigt sich, dass große Mengen \ac{RTE1} nicht solubilisiert wurden. In S und P zeigen sich \ac{RTE1}-Multimere bzw. Aggregate.}
 \label{fig:blot_reinigung}
\end{figure}
\clearpage
\section{Denaturierende Reinigung}
In der Regel konnte unter nativen Bedingungen \ac{RTE1} in ausreichender Menge für die nachfolgenden Versuche präpariert werden. In einigen Fällen schlug die Solubilisierung von \ac{RTE1} allerdings fehl, so dass die Möglichkeit einer denaturierenden Reinigung in Hinblick auf zukünftige Experimente untersucht wurde.

Unter denaturierenden Bedingungen konnten weitaus größere Mengen \ac{RTE1} gereinigt werden, als mit der nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:ergebnis_native_reinigung}). Das SDS-Gel zeigt entsprechend kräftigere Banden in den Elutionsfraktionen (Abbildung \ref{fig:sds-page_denaturierende_reinigung}).

\begin{figure}[htbp!]
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 \caption[SDS-PAGE der denaturierenden Reinigung von \ac{RTE1}]{SDS-PAGE der denaturierenden Reinigung von \ac{RTE1}; In der Reihenfolge des Auftragens: Marker (M), Zelllysat (L), Durchlauf (D), Waschschritte (W0, W75), Elution (E250); Rot umrandet sind die \ac{RTE1}-Bande.}
 \label{fig:sds-page_denaturierende_reinigung}
\end{figure}

\section{Häminagarose-Assay}
\label{sec:ergebnis_haeminagarose}
Die SDS-PAGE der Proben aus dem Häminagarose-Assay zeigt in der Elutionsfraktion eine Bande bei \SI{28}{\kilo\dalton}. Eine entsprechende Bande zeigt sich im aufgetragenen Proteinkonzentrat. Im Durchlauf ist nur ein sehr schwaches Signal zu erkennen, die Waschfraktionen weisen keine sichtbaren Banden auf (Abbildung \ref{fig:haeminagarose}.

Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elution eine Lösung von freiem Hämin (\SI{11,1}{\milli\Molar}) eingesetzt. Auch hier zeigte sich eine -- allerdings schwächere -- Bande in der Elutionsfraktion. Danach noch gebundenes Protein wurde wie zuvor mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen eluiert.

\begin{figure}[htbp!]
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 \caption[SDS-PAGE eines Häminagarose-Assays]{SDS-PAGE eines Häminagarose-Assays; Von links nach rechts: Marker (M), Proteinkonzentrat (K), Durchlauf (D), Waschschritte (W1-3), Elution (E); Eluiert wurde mit 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius}. Die \ac{RTE1}-Banden in Konzentrat und Elution sind durch Pfeile markiert. Beim Auftragen wurden die Verdünnungsfaktoren berücksichtigt. }
 \label{fig:haeminagarose}
\end{figure}

\begin{figure}[htbp!]
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 \caption[Spezifität der Hämin-Bindung]{Spezifität der Hämin-Bindung; Von links nach rechts: Marker (M), Proteinkonzentrat (K), Durchlauf (D), Waschschritte (W1-3), Elutionen (E1, E2); E1 wurde mit \SI{11,1}{\milli\Molar} freiem Hämin, E2 im Anschluss an E1 mit 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} eluiert. Die \ac{RTE1}-Banden sind durch Pfeile markiert. Die durchgängige Hintergrundfärbung von E1 und E2 und insbesondere die starke Färbung im Bereich unterhalb von \SI{15}{\kilo\dalton} wird durch das freie Hämin hervorgerufen. Beim Auftragen wurden die Verdünnungsfaktoren berücksichtigt. }
 \label{fig:haeminagarose}
\end{figure}

