\chapter{Einleitung}

\section{Das Phytohormon Ethylen}
Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanzen viele Aspekte von Entwicklung, Wachstum und Stressantwort reguliert \citep{kendrick_ethylene_2008}.

\textit{In vivo} wird Ethylen aus der Aminosäure Methionin synthetisiert, welche über \ac{AdoMet} und \ac{ACC} in Ethylen umgewandelt wird. Dies geschieht unter ATP-Verbrauch im Cytoplasma, wobei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, die Umwandlung von \ac{AdoMet} zu \ac{ACC}, von der \ac{ACC}-Synthase katalysiert wird. Aus dem freiwerdenden 5'-Methylthioadenosin wird im Yang-Zyklus Methionin regeneriert (vgl. Abbildung \ref{fig:yang_zyklus}).

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 \caption[Ethylensynthese und Yang-Zyklus]{Ethylensynthese ausgehend von Methionin und Regeneration von Methionin im Yang-Zyklus \citep{taiz_plant_2007}}
 \label{fig:yang_zyklus}
\end{figure}
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\section{Ethylensignalweg}
Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können \citep{resnick_involvement_2008}. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Durch die Bindung von Ethylen wird die nachgeschaltete \acs{MAP}-Kinase-Kinase-Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).

In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4) welche mit prokaryotischen Zwei-Komponenten-Histidinkinasen verwandt sind \citep{voet-van-vormizeele_mutants_2008}. Diese Rezeptoren zeigen eine funktionelle Redundanz und sind negative Regulatoren der Ethylenantwort \citep{resnick_involvement_2008}.

\begin{figure}[htbp!]
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 \caption[Ethylen-Signalweg]{Schematische Darstellung des Ethylen-Signalweges \citep{kendrick_ethylene_2008}}
 \label{fig:ethylen_signalweg}
\end{figure}
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\section{\acs{RTE1} im Ethylensignalweg}

Bei \ac{RTE1} handelt es sich um ein Homodimer (MW Monomer: \SI{28}{\kilo\dalton}), welches kolokalisiert mit dem Ethylenrezeptor \ac{ETR1} in der Membran des Golgi-Apparates bzw. des \ac{ER} vorliegt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Entdeckt wurde es bei der Suche nach zusätzlichen Komponenten des Ethylensignalweges. Die Ethylen-insensitiven Mutante \textit{etr1-2} zeigt bei Anwesenheit von Ethylen und Wachstum im Dunkeln \textit{nicht} den üblichen Phänotyp der Dreifachantwort: Verdickung und Verkürzung des Hypokotyls, Hemmung des Wurzelwachstums und Krümmung des Apikalhakens. Bei \textit{etr1-2} beruht die Insensitivität gegenüber Ethylen im Gegensatz zu \textit{etr1-1} nicht auf dem Unvermögen den für die Ethylenbindung erforderlichen Kofaktor Kupfer zu binden, sondern auf der Blockade der Weiterleitung des Ethylensignals zur Signaldomäne des Rezeptors. Es wird vermutet, dass die auf die Ethylenbindung folgende Konformationsänderung verhindert wird \citep{resnick_involvement_2008}.

Durch Mutagenese wurden Keimlinge aus dieser \textit{etr1-2}-Population erzeugt, welche wieder die Dreifachantwort \textit{zeigten}. Durch Komplementierungsversuche wurden die Mutanten \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} als allelisch identifiziert. Da beide Mutanten eine Ethylenantwort ähnlich der des Wildtyps aufwiesen, konnte darauf geschlossen werden, dass ein funktionelles \ac{RTE1} für die Insensitivität der \textit{etr1-2}-Mutanten notwendig ist. Folglich muss \ac{RTE1} zu einem frühen Zeitpunkt innerhalb des Ethylensignalweges gemeinsam mit \ac{ETR1} wirksam sein. Ein weiteres Allel \textit{rte1-3} wurde nach Analyse der Gensequenz von \ac{RTE1} identifiziert. Alle \ac{RTE1}-Mutanten zeigten einen ähnlichen Phänotyp, woraus geschlossen wurde, dass \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} \textit{loss-of-function}-Allele darstellen. Bei \textit{rte1-3} handelt es sich vermutlich um eine Nullmutation \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.

\textit{rte1-2} ist in der Lage, eine Reihe von Mutationen in \ac{ETR1} zu unterdrücken -- beispielsweise \textit{etr1-2} -- allerdings nur bei Mutationen, welche die eigentliche Ethylenbindung nicht oder zumindest nicht vollständig verhindern \citep{resnick_involvement_2008}.

Weitere Versuche zeigten, dass eine Überexpression von \ac{RTE1} im Wildtyp zu einer verminderten Ethylensensitivität führt, was die Annahme stützte, dass es sich bei \ac{RTE1} um einen negativen Regulator der Ethylenantwort handelt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Ebenso konnte durch die Analyse des Phänotyps von Doppel- und Dreifachmutanten mit \textit{etr1-2}, \textit{rte1-2} und \textit{ran1-3} gezeigt werden, dass \ac{RTE1} unabhängig von \ac{RAN1} auf die Ethylensignalkaskade wirkt \citep{resnick_involvement_2008}. So ist die Funktion von \ac{ETR1} im Wildtyp sowohl von \ac{RTE1} als auch von \ac{RAN1} abhängig, in \textit{etr1-2} hingegen nur von \ac{RTE1}. Hiervon ausgehend wurde das nachfolgend dargestellte (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}) Modell zum Signalzustand von \ac{ETR1} vorgeschlagen \citep{resnick_involvement_2008}.

Nach diesem Modell \ac{RTE1} reguliert die Ethylenantwort über eine Konformationsänderung der Ethylen"=Bindedomäne des Rezeptors ETR1 (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}). Hierfür wurden zwei unterschiedliche Möglichkeiten vorgeschlagen. Die erste besagt, dass ETR1 von einer nicht-funktionellen Konformation mit Hilfe von RTE1 in eine funktionelle Konformation übergeht, in welchem der Rezeptor sich in seinem "`an"'-Zustand befindet und die Ethylenantwort unterdrückt. In diesem Zustand kann nun auch Ethylen gebunden werden, wobei ETR1 in eine intermediäre Konformation übergeht, welche ebenfalls den "`an"'-Zustand repräsentiert und schließlich durch eine Konformationsänderung in den "`aus"'-Zustand wechselt. Die zweite Möglichkeit binhaltet, dass \ac{RTE1} am Übergang von \ac{ETR1} aus der inaktiven Form mit gebundenem Ethylen in den intermediären Zustand beteiligt ist. In beiden Möglichkeiten fördert \ac{RTE1} den inaktiven Zustand \citep{resnick_involvement_2008}.

\citet{resnick_involvement_2008} schlagen vor, dass \ac{RTE1} nach der ersten beschriebenen Möglichkeit wirkt und begründen dies mit der phänotypischen Ähnlichkeit von \textit{rte1 loss-of-function}-Mutationen mit der \textit{etr1}-Nullmutante. Der nicht-funktionelle Grundzustand von \ac{ETR1} entspräche dann phänotypisch der \textit{etr1}-Nullmutante.

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 \caption[Modell des Signalzustandes von ETR1]{Modell des Signalzustandes von ETR1 \citep[eigene Abbildung nach][]{resnick_involvement_2008}; Es wurden zwei mögliche Wirkungsweisen von \ac{RTE1} auf \ac{ETR1} vorgeschlagen: Nach der ersten Möglichkeit bewirkt \ac{RTE1} den Übergang von \ac{ETR1} von einer nicht-funktionellen (I) in eine funktionelle Konformation (II). Diese spiegelt den "`an"'-Zustand des Rezeptors wider. Wird Ethylen gebunden, geht der Rezeptor in einen intermediären Zustand (III) über, aus welchem er in den "`aus"'-Zustand (IV) wechselt. Die zweite Möglichkeit beinhaltet, dass \ac{RTE1} am Übergang vom "`aus"'-Zustand (IV) in den intermediären Zustand (III) beteiligt ist, aus welchem \ac{ETR1} dann in zurück in den "`an"'-Zustand (II) wechselt. In beiden Fällen fördert \ac{RTE1} den aktiven Zustand des Rezeptors.}
 \label{fig:etr1_zustaende}
\end{figure}

Homologe zu \ac{RTE1} wurden in einer Vielzahl weiterer Eukaryoten mit Ausnahme der Pilze gefunden, beispielsweise in \textit{Homo sapiens}, \textit{Drosophila melanogaster}, \textit{Caenorhabditis elegans} und \textit{Plasmodium}. Das menschliche Homolog weist eine Sequenzidentität im Vergleich zu \ac{RTE1} aus \ac{A. thaliana} von \SI{40,5}{\percent} auf \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Nach bisherigem Kenntnisstand verfügen die genannten Spezies über jeweils eine Kopie des Gens, mit Ausnahme von \ac{A. thaliana}, bei welcher sich eine zweite Kopie -- \ac{RTH} -- mit \SI{51}{\percent} Sequenzidentität findet \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.

Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies ohne Ethylenrezeptoren \citep{resnick_involvement_2008} lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Durch Sequenz-\textit{Alignments} konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cystein- und Histidinreste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-1} ist Cys$^\text{161}$ durch ein Tyrosin ersetzt. Darüberhinaus zeigen sequenzbasierte Vorhersagen, dass pflanzliche \ac{RTE1}-Homologe zwei bis vier Transmembrandomänen besitzen, eine nahe des N-Terminus sowie zwei bis drei am C-Terminus. In \textit{rte1-2} sind durch einen von einer \textit{missense}-Mutation hervorgerufenen \textit{Frameshift} die letzten 27 Aminosäurereste, welche sich in einer vorhergesagten Transmembrandomäne befinden, durch 15 inkorrekte Reste ersetzt worden, was vermutlich zu einer falschen Ausrichtung des Proteins in der Membran führt. Tierische Homologe zeigen in der Sequenzanalyse die ersten drei Transmembrandomänen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.

\section{Zielsetzung}
In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Eigenschaften von \ac{RTE1} näher charakterisiert werden. Da für das humane Homolog von \ac{RTE1} eine Häminbindung bereits nachgewiesen werden konnte \citep{chang_2009}, sollte der Fokus dieser Arbeit auf dem Nachweis und wenn möglich auch der Quantifizierung einer Häminbindung von \ac{RTE1} liegen.

