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\chapter{Material und Methoden}
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\section{Material}
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\label{sec:material}
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\begin{singlespace}
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\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
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\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Analysen-/Präzisionswaagen & Sartorius, Göttingen\\
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Autoklav & H+P Labortechnik, Oberschleißheim\\
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Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
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DNA-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Fluoreszenzspektrometer LS 55 & PerkinElmer, Rodgau\\
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%Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
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Hochdruckhomogenisator ("`French Press"') & Heinemann, Schwäbisch Gmünd\\
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Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\
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Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R & Eppendorf, Hamburg\\
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LAS-4000 mini (Luminescent Image Analyzer) & Fujifilm, Deutschland\\
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Magnetrührer MR 3000/3001 & Heidolph, Schwabach\\
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Mikrozentrifuge Minispin & Eppendorf, Hamburg\\
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Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage & Millipore, Schwalbach\\
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Minishaker MS 2 & IKA, Staufen\\
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Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Spectrophotometer DU 800 & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwabach\\
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Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\
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Ultraschalldesintegrator Branson-Sonifier & Heinemann, Schwäbisch Gmünd\\
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Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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%\end{center}
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\subsection{Verbrauchsmaterialien}
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\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\
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Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
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Größenausschlusschromatographie PD-10 & GE-Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, SK\\
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Halbmikroküvetten & Hartenstein, Würzburg\\
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Hämin-Agarose & Sigma-Aldrich, München\\
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Ni-IDA & Macherey-Nagel, Düren\\
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Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
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Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
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Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
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Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter}) & Merck, Bruchsal\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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%\end{center}
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\subsection{Standards für Proteinbestimmung und SDS-PAGE}
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\label{sec:standards}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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BSA Standard for Protein Assay \SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter} & Qiagen, Hilden\\
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Precision Plus Protein Standards Dual Color/Unstained & Bio-Rad, München\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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%\end{center}
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\subsection{Chemikalien}
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\label{sec:chemikalien}
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%\begin{center}
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% \begin{tabularx}{\textwidth}{XrX}
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\begin{longtable}{p{0.4\textwidth} r p{0.37\textwidth}}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
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\acf{BisTris} & 6976-37-0 & Serva, Heidelberg\\
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Borsäure & 10043-35-3 & Merck, Bruchsal\\
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Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
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Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
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Dinatriumhydrogenphosphat & 10028-24-7 & VWR, Darmstadt\\
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\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
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\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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Essigsäure & 64-19-7 & VWR, Darmstadt\\
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Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
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Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 \newline (n-Hexadecylphosphocholin) & 58066-85-6 & Affymetrix, Wooburn Green, UK\\
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Formaldehyd & 50-00-0 & AppliChem, Darmstadt\\
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Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Hämin & 16009-13-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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Hefeextrakt & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Imidazol & 288-32-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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\acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\
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Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\
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Natriumacetat (wasserfrei) & 127-09-3 & Merck, Bruchsal\\
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Natriumcarbonat (wasserfrei) & 497-19-8 & Merck, Bruchsal\\
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Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\
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Natriumdihydrogenphosphat & 10049-21-5 & Merck, Bruchsal\\
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Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\
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Natriumthiosulfat & 10102-17-7 & Sigma-Aldrich, München\\
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Nickelsulfat & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
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Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
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\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
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Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
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Silbernitrat & 7761-88-8 & Honeywell Riedel-de-Ha\"{e}n, Seelze\\
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\acf{Tris} & 77-86-1 & VWR, Darmstadt\\
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Zitronensäure & 5949-29-1 & Grüssing, Filsum\\
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\bottomrule
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% \end{tabularx}
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\end{longtable}
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%\end{center}
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\subsection{Antibiotoka-Stammlösungen}
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\label{sec:antibiotika_stammloesungen}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{XlX}
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\toprule
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\textbf{Antibiotikum} & \textbf{Konzentration} & \textbf{Lösungsmittel}\\
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\midrule
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Ampicillin & \SI{100}{\milli\gram\per\milli\liter} & Wasser (demineralisiert, steril)\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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%\end{center}
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\subsection{Kulturmedien}
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\begin{description}
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\item[2YT] \hfill \\
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\SI{1,6}{\percent} (w/v) Pepton\\
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\SI{1}{\percent} (w/v) Hefeextrakt\\
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\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid
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\end{description}
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\subsection{Puffer und Lösungen für den Zellaufschluss}
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\begin{description}
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\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
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\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
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\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{10}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
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|
\SI{10}{\percent} (v/v) Glycerin\\
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|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
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\end{description}
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\subsection{Puffer und Lösungen für die native Reinigung}
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\label{sec:puffer_native_reinigung}
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\begin{description}
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\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
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\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
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\item[Solubilisierungspuffer] \hfill \\
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\SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\
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|
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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|
\SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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|
\item[Waschpuffer pH 7,5] \hfill \\
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|
\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
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|
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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|
\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\end{description}
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\subsection{Puffer und Lösungen für die denaturierende Reinigung}
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\label{sec:puffer_denaturierende_reinigung}
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\begin{description}
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\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
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\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
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\item[Solubilisierungspuffer] \hfill \\
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|
\SI{30}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5\\
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|
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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|
\SI{8}{\Molar} Harnstoff
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|
\item[Waschpuffer] \hfill \\
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\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
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|
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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|
\SI{8}{\Molar} Harnstoff
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\end{description}
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\subsection{Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE}
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\label{sec:puffer_sds_page}
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\begin{description}
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\item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30)] \hfill \\
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\SI{30}{\percent} Acrylamid\\
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\SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid
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\item[Entwickler] \hfill \\
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\SI{2,5}{\percent} (w/v) Natriumcarbonat (wasserfrei)\\
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\SI{0,02}{\percent} (v/v) Formaldehyd
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\item[Färbelösung] \hfill \\
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\SI{0,1}{\percent} (w/v) Silbernitrat\\
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|
\SI{0,02}{\percent} (v/v) Formaldehyd
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\item[Fixierer] \hfill \\
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\SI{30}{\percent} (v/v) Ethanol\\
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\SI{10}{\percent} (v/v) Essigsäure
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\item[Inkubator] \hfill \\
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\SI{30}{\percent} (v/v) Ethanol\\
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\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumacetat (wasserfrei)\\
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\SI{0,2}{\percent} (w/v) Natriumthiosulfat
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\item[Laufpuffer, 10x] \hfill \\
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\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}\\
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\SI{1,92}{\Molar} Glycin\\
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\SI{0,5}{\percent} \acs{SDS}
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|
\item[Sammelgelpuffer, 5x, pH 6,7] \hfill \\
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|
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
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|
\SI{0,5}{\percent} \acs{SDS}
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|
\item[Stopplösung] \hfill \\
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\SI{2,3}{\Molar} Zitronensäure
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\item[Trenngelpuffer, 2,5x, pH 8,9] \hfill \\
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|
\SI{1,875}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
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|
\SI{0,25}{\percent} \acs{SDS}
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|
\item[Probenpuffer, 4x] \hfill \\
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|
\SI{30}{\milli\Molar} Borsäure\\
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|
\SI{30}{\milli\Molar} \acs{Tris}\\
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|
\SI{0,7}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
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|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
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|
\SI{50}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{6,7}{\percent} (w/v) \acs{SDS}\\
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\SI{16,7}{\percent} (w/v) Saccharose\\
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\SI{0,16}{\percent} (w/v) Bromphenolblau
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\end{description}
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\subsection{Puffer und Lösungen für den Westernblot}
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\label{sec:puffer_westernblot}
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\begin{description}
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\item[Transferpuffer]\hfill \\
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\SI{25}{\milli\Molar} Tris\\
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\SI{190}{\milli\Molar} Glycin\\
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\SI{10}{\percent} (v/v) Ethanol
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|
\item[TBS pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
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|
\SI{10}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl}\\
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\SI{150}{\milli\Molar} Natriumchlorid
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|
\item[TBT pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
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|
\SI{20}{\milli\Molar} Tris\\
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\SI{500}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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|
\SI{0,05}{\percent} (v/v) Polysorbat 20
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\item[Caseinlösung pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
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\SI{1}{\percent} (w/v) Casein in TBS\\
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\SI{2}{\milli\liter} \SI{2}{\Molar} \ce{NaOH} je \SI{500}{\milli\liter}
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\end{description}
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\subsection{Puffer und Lösungen für den Nachweis der Häminbindung}
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\label{sec:puffer_haeminbindung}
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\begin{description}
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\item[Häminlösung (\SI{1,1}{\milli\Molar})] \hfill \\
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\SI{1}{\milli\gram} Hämin\\
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\SI{50}{\micro\liter} \SI{1}{\Molar} \ce{NaOH}\\
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ad \SI{1,39}{\milli\liter} \ce{dH2O}
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\item[Puffer NP] \hfill \\
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\SI{500}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{10}{\milli\Molar} Natriumphosphat pH 7,5
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\item[Waschpuffer pH 6,5] \hfill \\
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\SI{30}{\milli\Molar} BisTris/\ce{HCl} pH 6,5\\
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\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\item[Waschpuffer pH 8,5] \hfill \\
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\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 8,5\\
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|
\SI{200}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}\\
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|
\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\item[CD-Puffer] \hfill \\
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\SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat pH 7,4\\
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|
\SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16
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\end{description}
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\end{singlespace}
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\section{Methoden}
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\label{sec:methoden}
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\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
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\label{sec:transformation}
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Zur Transformation von \ac{E. coli} wurde ein auf dem Vektor pET-15b der Firma Novagen basierendes Konstrukt eingesetzt. Hierbei wurde die \ac{RTE1}-kodierende Sequenz über die \textit{NdeI}-Schnittstelle hineinkloniert. N-terminal sitzt ein Hexa-His-Tag zur späteren affinitätschromatographischen Reinigung des Proteins. Das \acs{RTE1}-kodierende Gen befindet sich zwischen einem T7-Promotor bzw. -Terminator, so dass zur Transkription eine T7-RNA-Polymerase benötigt wird. Sowohl die Transkription der T7-RNA-Polymerase, als auch der T7-Promotor werden durch den Lac-Repressor (lacl) reprimiert. Durch Zugabe des Lactose-Analogons \ac{IPTG} löst sich der Repressor von den regulatorischen Sequenzen und ermöglicht zunächst die Transkription der T7-RNA-Polymerase, welche ihrerseits dann die für \ac{RTE1}-kodierende Sequenz transkribiert.
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Als Selektionsmarker vermittelt pET-15b eine Ampicillinresistenz. Das Konstrukt aus pET-15b und der \ac{RTE1}-kodierenden Sequenz wird im Folgenden als pET-15b-RTE1 bezeichnet.
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.8\textwidth]{./img/einleitung/vektor.png}
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% vektor.png: 1059x800 pixel, 72dpi, 37.36x28.22 cm, bb=0 0 1059 800
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\caption[Vektorkarte von pET-15b-RTE1]{Vektorkarte von pET-15b-RTE1. RTE1 ist rosa markiert und befindet sich zwischen Position 5377 und 6142. Die Vektorkarte wurde mit PlasMapper \citep{dong_plasmapper:web_2004} erstellt.}
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\label{fig:vektor}
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\end{figure}
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Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation: \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetente Zellen wrden auf Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-Lösung versetzt. Anschließend werden die Zellen für \SI{10}{\minute} auf Eis inkubiert. Es erfolgt ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} für \SI{90}{\second}. Die Zellen für \SI{2}{\minute} auf Eis und nach Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} 2YT-Medium für \SI{1}{\hour} unter leichtem Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
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Der Ansatz wurde dann auf 2YT-Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
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\subsection{Expression in \acs{E. coli}}
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Kompetente Zellen wurden wie in \ref{sec:transformation} beschrieben transformiert. Von den Platten wurden dann Vorkulturen mit einem Volumen von \SI{100}{\milli\liter} 2YT-Medium in \SI{250}{\milli\liter}-Kolben ohne Schikane angeimpft, mit \SI{100}{\micro\liter} Ampicillin-Lösung versetzt und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} inkubiert.
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Die Hauptkulturen mit einem Volumen von \SI{500}{\milli\liter} 2YT-Medium in schikanierten \SI{1}{\liter}-Kolben wurden mit \SI{500}{\micro\liter} Ampicillin-Lösung versetzt und mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert. Die Induktion erfolgte bei einer OD$_{\text{600}}$ von 0,6 bis 0,8 mit \SI{0,3}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
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Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von \SI{35}{\celsius} und nach der Induktion bei \SI{30}{\celsius}. \SI{4}{\hour} nach der Induktion wurden die Zellen bei \SI{7000}{\g} für \SI{10}{\minute} bei \SI{4}{\celsius} abzentrifugiert.
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\label{sec:expression}
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\subsection{Zellaufschluss}
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\label{sec:zellaufschluss}
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\SI{4}{\gram} eingefrorene Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch dreifache Hochdruckdispersion in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten French-Press$^\text{\textregistered}$ bei einem Druck von \SIrange{1200}{1500}{\psi}.
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%\subsection{Differentielle Zentrifugation}
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%\label{sec:differentielle_zentrifugation}
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\subsection{Native Reinigung}
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\label{sec:native_reinigung}
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Mit einem Poly-Histidin-Tag markierte Proteine lassen sich über eine Metallchelat"=Affinitätschromatographie aus einem Proteingemisch isolieren. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Säulenmaterial handelt es sich um \ac{IDA}, welche an Agarose immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \ac{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion der Poly-Histidin-markierten Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen.
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Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\texttrademark}$ 16 versetzt. Die Solubilisierung erfolgte über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
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Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Scrhitten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
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Das Säulenmaterial wurde gemäß den Herstellerangaben vor der Wiederverwendung regeneriert und in \SI{20}{\percent} (v/v) Ethanol bei \SI{4}{\celsius} gelagert.
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\subsection{Denaturierende Reinigung}
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\label{sec:denaturierende_reinigung}
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Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
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Wasch- und Elutionspuffer enthielten ebenfalls \SI{8}{\Molar} Harnstoff.
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\subsection{\acs{SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\label{sec:sds_page}
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Die Proteinproben wurden auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen und dort nach ihrer Masse aufgetrennt \citep{laemmli_cleavage_1970}.
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Durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat \acs{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einer negativen Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Die Wanderungsgeschwindigkeit im dann angelegten elektrischen Feld durch das Gel ist somit allein von der Proteinmasse abhängig.
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Vor dem Auftrag auf das Gel wurden die Proben mit 4x-Probenpuffer versetzt. Expressionsproben wurden vor dem Auftragen für \SI{10}{\minute} auf \SI{95}{\celsius} erhitzt. Das Auftragsvolumen berechnete sich dann wie folgt:
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\begin{align}
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V[\si{\micro\liter}] = \frac{15}{\text{OD}_\text{600}} \cdot 0,75
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\end{align}
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Für die Elektrophorese wurden \SI{15}{\percent}ige Gele eingesetzt. Tabelle \ref{tab:sds_rezept} enthält ein Pipettierschema für drei kleine Gele der Größe \SI{9}{\centi\meter} x \SI{10}{\centi\meter}.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
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\begin{tabular}{lll}
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\toprule
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& \textbf{Trenngel} & \textbf{Sammelgel}\\
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\midrule
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AA/BAA 30 & \SI{16,5}{\milli\liter} & \SI{2}{\milli\liter}\\
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Trenn-/Sammelgelpuffer & \SI{12,9}{\milli\liter} & \SI{2,6}{\milli\liter}\\
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Milli-Q-Wasser & \SI{3,6}{\milli\liter} & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
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\acs{TEMED} & \SI{16,5}{\micro\liter} & \SI{12,3}{\micro\liter}\\
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\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112}{\micro\liter} & \SI{129}{\micro\liter}\\
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\bottomrule
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\end{tabular}
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\label{tab:sds_rezept}
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\end{table}
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Zur späteren Größenzuordnung wurden die in \ref{sec:standards} genannten Größenstandards eingesetzt. Nach dem Beladen wurde für etwa \SI{45}{\minute} \SI{35}{\milli\ampere} je Gel angelegt.
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\subsection{Silberfärbung}
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\label{sec:silberfaerbung}
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Mit Hilfe der Silberfärbung lassen sich Proteine in Polyacrylamidgelen bis zu einer Nachweisgrenze von etwa \SI{5}{\nano\gram} pro Bande detektieren.
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\ce{Ag+}-Ionen bilden Komplexe mit den Seitenketten der Aminosäuren Glutamat, Aspartat und Cystein aus und können durch formaldehydhaltige Natriumcarbonatlösung zu elementarem Silber reduziert werden. Hierdurch treten die Banden im Gel dunkelbraun bis schwarz hervor. Der Ablauf der Färbung ist Tabelle \ref{tab:silberfaerbung} zu entnehmen.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption{Silberfärbung von Polyacrylamidgelen}
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\begin{tabular}{lcc}
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\toprule
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\textbf{Lösung} & \textbf{Dauer} & \textbf{Wiederholungen}\\
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\midrule
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Fixierer & \SI{10}{\minute} & 1 \\
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Inkubator & \SI{10}{\minute} & 1 \\
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\ce{dH2O} & \SI{10}{\minute} & 3 \\
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Färbelösung & \SI{10}{\minute} & 1 \\
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\ce{dH2O} & kurzes Waschen & 1 \\
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\bottomrule
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\end{tabular}
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\label{tab:silberfaerbung}
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\end{table}
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Anschließend wurde das Gel mit Entwicklerlösung überschichtet und bis zur genügenden Ausprägung der Färbung geschwenkt. Die Färbung wurde durch Zugabe von \SI{2,3}{\Molar} Zitronensäure ($\frac{1}{10}$ des Volumens an Entwicklerlösung) gestoppt.
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%\subsection{Coomassie-Färbung}
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%\label{sec:coomassiefaerbung}
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\subsection{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen}
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\label{sec:westernblot}
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Über einen Westernblot können Proteine aus einem SDS-Gel elektrophoretisch auf einen Membran übertragen und dort fixiert werden. Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteinen auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.
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Bei Gelen, welche für einen Westernblot vorgesehen waren, kam ein gefärbter Proteingrößenstandard zum Einsatz. Das Gel wurde für etwa \SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die benötigten Filterpapiere, sowie die Nitrozellulosemembran wurden ebenfalls kurz in Transferpuffer getränkt.
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Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von \SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.
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Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute} an.
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Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-HRP-Antikörper im Verhältnis 1:10000 enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten wiederum zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper ließ sich über die gekoppelte \ac{HRP} mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. die \ac{HRP} oxidiert in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es einer Lichtemission kommt.
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Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor (LAS 4000 mini, Fuji) eingesetzt.
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\subsection{Nachweis der Häminbindung}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung}
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Bei Häminen handelt es sich um Komplexverbindungen der Häme, wobei das Eisenion in der Oxidationsstufe +III vorliegt. Als axialen Liganden weisen sie ein Chlorid-Ion auf. Das Hämin b des Häm b wird als Hämin bezeichnet \citep{fischer_haemin_1999}.
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\begin{figure}[htbp]
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\centering
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\includegraphics[width=0.4\textwidth]{./img/material/hemin.pdf}
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% hemin.pdf: 211x185 pixel, 72dpi, 7.44x6.53 cm, bb=0 0 211 185
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\caption[Struktur des Hämins]{Struktur des Hämins (eigene Darstellung)}
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\label{fig:haemin_struktur}
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\end{figure}
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Für den Nachweis einer Häminbindung durch \ac{RTE1} kamen vier unterschiedliche Methoden zum Einsatz: Eine Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose, ein Photometrischer Nachweis über die Zugabe von freiem Hämin, der Nachweis über einen Tyrosin-Quench bei Zugabe von freiem Hämin sowie der Nachweis einer Sekundärstrukturänderung bei Häminzugabe über eine \ac{CD}-Spektroskopie.
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\subsubsection{Affinitätschromatographie mit Hämin-Agarose}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet}
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Beim affinitätschromatographischen Nachweis wurde ein Säulenmaterial eingesetzt, bei welchem Hämin kovalent an Agarose als Trägermatrix gebunden ist. Hämin-bindende Proteine können dann an das immobilisierte Hämin binden. Die Elution kann entweder über die Zugabe von freiem Hämin, welches mit dem immobilisierten Hämin um die Bindung mit den Proteinen konkurriert, oder denaturierend über die Zugabe von \acs{SDS} und gleichzeitigem Erhitzen des Säulenmaterials erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam ein Batch-Verfahren zum Einsatz, welches den Nachweis einer Bindung mit vergleichsweise wenig Säulenmaterial ermöglicht \citep{tsutsui_affinity_1982}.
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\SI{50}{\micro\liter} Hämin-Agarose-Suspension wurden in ein \SI{1,5}{\milli\liter} Reaktionsgefäß gegeben und drei Mal mit jeweils \SI{150}{\micro\liter} NP-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 im Thermoschüttler bei \SI{20}{\celsius} unter Schütteln äquilibriert. Zum Sedimentieren der Agarose-Beads wurden die Reaktionsgefäße \SI{10}{\second} bei \SI{2000}{\g} zentrifugiert.
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Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Beads gegeben und für \SI{30}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} im Thermoschüttler unter Schütteln inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte mit jeweils \SI{500}{\micro\liter} NP-Puffer versetzt mit \SI{0,003}{\percent} Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 an. Hierbei wurden die Reaktionsgefäße wiederum unter Schütteln für \SI{10}{\minute} bei \SI{20}{\celsius} inkubiert. Die Elution erfolgte durch Zugabe von \SI{50}{\micro\liter} 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} für \SI{5}{\minute} oder durch Zugabe einer \SI{11,1}{\milli\Molar} Hämin-Lösung.
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\subsubsection{Photometrie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie}
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Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei in vielen Fällen eine Rotverschiebung des Soret-Peaks zu beobachten, da das Protein bzw. der Protein-Häm-Komplex unterschiedliche Absorptionsmaxima aufweisen \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bzw. ihrer relativen Verschiebung zueinander bestimmt werden.
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Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}.
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Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Hämin-Zugabe. Aus den Pufferspektren wurden dann über den Exktionktionskoeffizienten (Datenblatt des Herstellers) die tatsächliche Hämin-Konzentration in der Küvette bestimmt. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren.
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\begin{table}[ht]
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\centering
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\caption{Hämin-Konzentration für die UV-Vis-Spektroskopie}
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\begin{tabularx}{0.6\textwidth}{rr}
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\toprule
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\textbf{Hämin-Konzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen [\si{\micro\liter}]}\\
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\midrule
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0 & 0\\
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2 & 0,9\\
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5 & 0,9\\
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10 & 0,9\\
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15 & 2,3\\
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20 & 2,3\\
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30 & 4,6\\
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40 & 4,6\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\label{tab:haemin_konzentration_photometrie}
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\end{table}
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\subsubsection{Fluoreszenzspektroskopie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_fluoreszenz}
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Bei der Anregung eines Fluorophors mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, kommt es zu einer Stokes-verschobenen Lichtemission bei einer für das Fluorophor spezifischen Wellenlänge. Bei Zugabe eines Quenchers tritt eine Fluoreszenzauslöschung (Quench) auf. Hierfür können unterschiedliche Effekte verantwortlich sein, allen gemein ist aber, dass sie entweder den Übergang des Fluorophors von seinem Grund- in den angeregten Zustand verhindern, oder den angeregten Zustand strahlungslos zurück in den Grundzustand überführen. Beispielsweise kann dies über eine Stoßdeaktivierung -- eine Kollision zwischen Fluorophor und Quencher -- oder einen Resonanzenergietransfer vom Fluorophor auf den Quencher erfolgen \citep{atkins_physikalische_2006}. In der Proteinanalytik wird häufig Tryptophan angeregt, dessen Absorptionsmaximum bei \SI{280}{\nano\meter} liegt und ein Emissionsmaximum im Bereich zwischen \SIrange{300}{350}{\nano\meter} aufweist \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}.
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Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Tryptophane in \ac{RTE1} bei \SI{280}{\nano\meter} angeregt und das Emissionsspektrum zwischen \SIrange{300}{400}{\nano\meter} aufgenommen. Hierfür wurde zunächst \ac{RTE1} nach der Reinigung in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol über eine PD10-Säule umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden \SI{500}{\micro\liter} mit einer Proteinkonzentration von \SI{2,5}{\micro\Molar} in die Messung eingesetzt. Im Verlauf der Messung wurde Hämin bis zu einer Endkonzentration von \SI{60}{\micro\Molar} hinzutitriert. Zusätzlich wurde ein Pufferspektrum mit entsprechender Häminkonzentration aufgenommen. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren.
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Wie beim photometrischen Bindungsnachweis erfolgte die Bestimmung der tatsächlich vorliegenden Häminkonzentration über die Aufnahme von Absorptionsspektren und den vom Hersteller angegebenen Extinktionskoeffizienten.
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\begin{table}[ht]
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\centering
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\caption{Hämin-Konzentration für die Fluoreszenzspektroskopie}
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\begin{tabularx}{0.85\textwidth}{XXX}
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\toprule
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\textbf{Hämin-Konzentration [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Volumen Stammlösung [\si{\micro\liter}]} & \textbf{Konzentration Stammlösung [\si{\milli\Molar}]}\\
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\midrule
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0 & 0 &\multirow{8}{*}{\SI{0,275}{\milli\Molar}}\\
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0,5 & 0,9 &\\
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1 & 0,9 &\\
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1,5 & 0,9 &\\
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2 & 0,9 &\\
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2,5 & 0,9 &\\
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3 & 0,9 &\\
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4 & 1,8 &\\
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\cmidrule(r){3-3}
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6 & 0,92 & \multirow{6}{*}{\SI{1,1}{\milli\Molar}}\\
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8 & 0,92 &\\
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10 & 0,92 &\\
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20 & 4,6 &\\
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40 & 9,4 &\\
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60 & 9,5 &\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\label{tab:haemin_konzentration_photometrie}
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\end{table}
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\clearpage
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\subsubsection{\ac{CD}}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
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