diff --git a/.gitattributes b/.gitattributes new file mode 100644 index 0000000..e6b8fe1 --- /dev/null +++ b/.gitattributes @@ -0,0 +1,2 @@ +*.tex diff=tex +*.bib diff=bibtex diff --git a/.gitignore b/.gitignore new file mode 100644 index 0000000..a85b94b --- /dev/null +++ b/.gitignore @@ -0,0 +1,19 @@ +# TeX +*.aux +*.log +*.lof +*.lot +*.toc +*.out +# With PDFTeX, ignore DVIs +*.dvi +# BibTeX +*.bbl +*.blg +# Makeindex +*.idx +*.ilg +*.ind + +*-eps-converted-to.pdf + diff --git a/img/ergebnisse/agarose_gele/insert_pcr.png b/img/ergebnisse/agarose_gele/insert_pcr.png new file mode 100644 index 0000000..f30b49c Binary files /dev/null and b/img/ergebnisse/agarose_gele/insert_pcr.png differ diff --git a/img/ergebnisse/agarose_gele/vektor_linear.png b/img/ergebnisse/agarose_gele/vektor_linear.png new file mode 100644 index 0000000..ac14f7d Binary files /dev/null and b/img/ergebnisse/agarose_gele/vektor_linear.png differ diff --git a/inc/abkuerzungen.tex b/inc/abkuerzungen.tex index bf4ecaa..a0c4b95 100644 --- a/inc/abkuerzungen.tex +++ b/inc/abkuerzungen.tex @@ -17,15 +17,16 @@ \acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}} \acro{F. trinervia}[\textit{F. trinervia}]{\textit{Flaveria trinervia}} \acro{HRP}{Meerrettich-Peroxidase, engl. \textit{horseradish peroxidase}} + \acro{IDA}{Iminodiessigsäure} \acro{IMAC}{Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie} \acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid} \acro{OD}{Optische Dichte} \acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.)} + \acro{PAGE}{Polyacrylamidgelelektrophorese} \acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion} \acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid} \acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase} \acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat} - \acro{SDS-PAGE}{Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese} \acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung} \acro{SOPMA}{\textit{Self-optimized prediction method} (engl.)} \acro{TAE}{Tris-Acetat-EDTA} diff --git a/inc/anhang.tex b/inc/anhang.tex index 3a0079e..980466d 100644 --- a/inc/anhang.tex +++ b/inc/anhang.tex @@ -1,2 +1,12 @@ \appendix -\chapter{Anhang} \ No newline at end of file +\chapter{Anhang} + +\chapter{Erklärung} +Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Masterarbeit selbstständig verfasst und keine anderen, als die angegebenen Quellen und +Hilfsmittel benutzt habe. Alle Stellen, die ich aus den Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommen habe, sind als solche kenntlich gemacht. + +\vspace{6em} + +\noindent \rule{7cm}{1pt} + +Alexander Ralph Michael Minges \hfill Düsseldorf, \today \ No newline at end of file diff --git a/inc/material.tex b/inc/material.tex index 2d4a20c..dc651c5 100644 --- a/inc/material.tex +++ b/inc/material.tex @@ -11,8 +11,8 @@ Autoklav & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\ Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\ \acs{CD}-Spektrometer J-715 & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\ - Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus & GE Healthcare, Freiburg \\ - \acs{DNA}-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\ + Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus & GE Healthcare, Uppsala, SE \\ + \acs{DNA}-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\ Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\ Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\ Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\ @@ -40,7 +40,7 @@ \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\ \midrule Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\ - Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25 & GE Healthcare, Freiburg\\ + Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25 & GE Healthcare, Uppsala, SE\\ Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\ \acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter} & GE-Healthcare, Freiburg\\ Mikrotiterplatten & Hartenstein, Würzburg\\ @@ -118,7 +118,7 @@ \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\ \midrule - illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Freiburg\\ + illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Uppsala, SE\\ QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\ Roti-Quant$^\text{\textregistered}$ (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\ \bottomrule @@ -139,6 +139,7 @@ \subsection{Bakterienstämme} \label{sec:batrienstaemme} +\begin{samepage} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\ @@ -147,11 +148,13 @@ BL21 Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm} Tet$^\text{r}$ gal \textlambda(DE3) \textit{endA} Hte\\ XL1-Blue & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} \textit{recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac} [F' \textit{proAB lacI$^\text{q}$ Z\textDelta M15} Tn\textit{10} (Tet$^\text{r}$)]\\ \bottomrule - \end{tabularx} + \end{tabularx} +\end{samepage} \subsection{Synthetische Oligonukleotide} \label{sec:synthetische_oligonukleotide} +\begin{samepage} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.3\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Sequenz (5'~--~3')} \\ @@ -160,10 +163,13 @@ pETEV-16b-PPDK-rev & \texttt{TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAG \newline TTAAACAATCACTTGGGCGG}\\ \bottomrule \end{tabularx} +\end{samepage} \subsection{Plasmide} \label{sec:plasmide} + +\begin{samepage} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Marker}\\ @@ -171,6 +177,7 @@ pET-16b & Novagen, Darmstadt & Ampicillinresistenz\\ \bottomrule \end{tabularx} +\end{samepage} \subsection{Kulturmedien} \label{sec:kulturmedien} @@ -391,7 +398,7 @@ und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \ \SI{25}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O} \end{description} -Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß dem in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt. +Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt. \begin{table}[hbt] \centering @@ -466,17 +473,21 @@ ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert. Die Stammhaltung erfolgte in \SI{20}{\percent}igen Glycerinkulturen bei \SI{-80}{\celsius}. Hierfür wurden \SI{800}{\micro\liter} einer Übernachtkultur (vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren. -\subsection{Expression in \acs{E. coli}} +\subsection{Heterologe Expression in \acs{E. coli}} \label{sec:expression_ecoli} Die Transformation kompetenter Zellen erfolgte wie in \ref{sec:transformation} beschrieben. Die Anzucht erfolgte in \acs{2YT}-Medium mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin. \subsubsection{Expressionsstudien} \label{sec:expression_ecoli_studien} -Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei +Die optimalen Bedingungen zur heterologen Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} wurden durch Expressionsstudien evaluiert, bei denen +unterschiedliche Konzentrationen von \ac{IPTG} zur Induktion verwendet wurden. Es kamen hierbei die \acs{E. coli}"=Stämme BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3) +zum Einsatz. + +Von den Agarplatten (vgl. \ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt. -Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter} Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert +Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer \acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar}, \SI{0,5}{\milli\Molar} und \SI{1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}. @@ -484,22 +495,78 @@ Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30 wurden die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet. \subsubsection{Präparative Expression} +\label{sec:praeparative_expression} +Die heterologe Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} erfolgte mit den in den Expressionsstudien als besonders geeignet explorierten Bedingungen. +Als Expressionsstamm kam \acs{E. coli} BL21 (DE3) zum Einsatz. + Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{100}{\milli\liter} Volumen in unschikanierten \SI{250}{\milli\liter}-Kolben angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt. -Hierfür wurden \SI{2}{\liter} Kolben mit Schikane und \SI{500}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert +Hierfür wurden \SI{2}{\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{500}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer \acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}. Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Am nächsten Tag wurden -die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet. +die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet. Die Zellpellets wurden in \SI{4}{\gram}-Aliquots +in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für weitere Versuche bei \SI{-80}{\celsius} gelagert. \section{Präparative Methoden} \label{sec:praeparative_methoden} +\subsection{Zellaufschluss} +\label{sec:zellaufschluss} +Ein Aliquot eingefrorener Zellen (siehe \ref{sec:praeparative_expression}) wurde bei Raumtemperatur mit \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer, +sowie einer Spatelspitze DNAse I (Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt und durch Vortexen resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch Hochdruckdispersion +bei einem Druck von \SI{1,35}{\kilo\bar} und einer Temperatur von \SI{15}{\celsius}. + +\subsection{Proteinaufreinigung durch Affinitätschromatographie} +\label{sec:affinitaetschromatographie} +Proteine, die mit einem Poly-Histidin-Tag markiert sind, lassen sich über eine \acf{IMAC} aus +einem Proteingemisch isolieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden HisTrap$^\text{\textregistered}$ HP-Säulen mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} +eingesetzt. Als Säulenmaterial dient quervernetzte Agarose an welche \acf{IDA} immobilisiert ist. \ce{Ni2+}-Ionen werden von \acs{IDA} dreifach koordinativ +komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion Poly-Histidin-markierter Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni2+}-Ionen zur +Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über die Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu +Histidin in der Lage ist, dieses kompetitiv aus der Bindung mit \ce{Ni2+} zu verdrängen. + +Die wie in \ref{sec:zellaufschluss} beschrieben aufgeschlossenen Zellen wurden zunächst bei \SI{10000}{\xg} und \SI{15}{\celsius} für \SI{30}{\minute} +zentrifugiert um Zelltrümmer und \textit{Inclusion-Bodies} zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{100000}{\xg} und \SI{15}{\celsius} +ulrazentrifugiert um lediglich lösliche Proteine im Überstand zu halten und Membranfragmente zu präzipitieren. + +Die mit \ce{Ni2+} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \ce{ddH20} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende +\ce{Ni2+} von der Säule zu eluieren und die Bildung von amorphem Nickel bei der nachfolgenden Benutzung der Puffer mit reduzierend wirksamen \acs{DTT} +zu minimieren. + +Die Säule wurde mit Waschpuffer äquilibriert und das Zelllysat mit einer Flussrate von \SI{1,5}{\milli\liter\per\minute} auf die Säule geladen. Im Anschluss +Unspezifisch bindende Proteine wurde mit \SI{20}{\CV} Waschpuffer + \SI{50}{\milli\Molar} Imidazol von der Säule gelöst. Die Elution der \acs{PPDK} erfolgte dann mit je \SI{10}{\CV} Waschpuffer + \SI{150}{\milli\Molar}, \SI{200}{\milli\Molar} und \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Es wurden Fraktionen +mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} gesammelt und ggf. vereinigt. Zur Detektion der Proteinfraktionen wurde die Absorption bei \SI{280}{\nano\meter} verfolgt. + +Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt und neu mit \ce{Ni2+} beladen. + + +\subsection{Konzentrierung} +\label{sec:konzentrierung} + +\subsection{Entsalzung} +\label{sec:entsalzung} + \section{Analytische Methoden} \label{sec:analytische_methoden} +\subsection{Differentielle Zentrifugation} +\label{sec:differentielle_zentrifugation} + +\subsection{Größenauschlusschromatographie} +\label{sec:groessenausschluss} + +\subsection{SDS-\acl{PAGE}} +\label{sec:sds_page} + +\subsection{Konzentrationsbestimmung von Proteinen} +\label{sec:konzentrationsbestimmung_proteine} + +\subsection{\acl{CD}-Spektroskopie} +\label{sec:cd_spektroskopie} + \section{Bioinformatische Methoden} \label{sec:bioinformatische_methoden} diff --git a/masterarbeit.kilepr b/masterarbeit.kilepr index e8719c5..8492130 100644 --- a/masterarbeit.kilepr +++ b/masterarbeit.kilepr @@ -4,7 +4,7 @@ img_extIsRegExp=false img_extensions=.eps .jpg .jpeg .png .pdf .ps .fig .gif kileprversion=2 kileversion=2.1.2 -lastDocument=masterarbeit.tex +lastDocument=inc/material.tex masterDocument= name=Masterarbeit pkg_extIsRegExp=false @@ -118,10 +118,10 @@ order=-1 [item:inc/abkuerzungen.tex] archive=true -column=26 +column=29 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=21 +line=19 mode=LaTeX open=true order=2 @@ -138,13 +138,13 @@ order=3 [item:inc/anhang.tex] archive=true -column=16 +column=19 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=1 +line=3 mode=LaTeX -open=false -order=3 +open=true +order=5 [item:inc/diskussion.tex] archive=true @@ -178,10 +178,10 @@ order=6 [item:inc/material.tex] archive=true -column=46 +column=121 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=466 +line=540 mode=LaTeX open=true order=1 @@ -208,17 +208,17 @@ order=-1 [item:masterarbeit.tex] archive=true -column=25 +column=57 encoding=UTF-8 highlight=LaTeX -line=31 +line=104 mode=LaTeX open=true order=0 [view-settings,view=0,item:inc/abkuerzungen.tex] -CursorColumn=26 -CursorLine=21 +CursorColumn=29 +CursorLine=19 JumpList= ViMarks= @@ -229,8 +229,8 @@ JumpList= ViMarks= [view-settings,view=0,item:inc/anhang.tex] -CursorColumn=16 -CursorLine=1 +CursorColumn=19 +CursorLine=3 JumpList= ViMarks= @@ -253,8 +253,8 @@ JumpList= ViMarks= [view-settings,view=0,item:inc/material.tex] -CursorColumn=46 -CursorLine=466 +CursorColumn=121 +CursorLine=540 JumpList= ViMarks= @@ -265,7 +265,7 @@ JumpList= ViMarks= [view-settings,view=0,item:masterarbeit.tex] -CursorColumn=25 -CursorLine=31 +CursorColumn=57 +CursorLine=104 JumpList= ViMarks= diff --git a/masterarbeit.tex b/masterarbeit.tex index 1383c1a..6b345d7 100644 --- a/masterarbeit.tex +++ b/masterarbeit.tex @@ -19,16 +19,16 @@ \usepackage{fixltx2e} \usepackage{babel} \usepackage[final, - activate={true,nocompatibility} + activate={true,nocompatibility} % Aktiviere expansion und protrusion babel=true, - verbose=true, - factor=1100, - stretch=20, +% verbose=true, + factor=1100, % Faktor für protrusion erhöht (Standard: 1000) + stretch=20, % Faktoren für Streckung der Schrift (Standard: 20) shrink=20]{microtype} \usepackage{fontspec} %\newfontfeature{Microtype}{protrusion=default;expansion=default;} %\directlua{fonts.protrusions.setups.default.factor=.5} -\defaultfontfeatures{Ligatures=TeX} %,Numbers=OldStyle}% ,Scale=MatchLowercase} bug in current Biolinum +\defaultfontfeatures{Ligatures=TeX} %,Numbers=OldStyle}% ,Scale=MatchLowercase} \usepackage{libertineotf} %\usepackage{lua-visual-debug} @@ -101,8 +101,10 @@ \setmathfont[range={"221E}]{Linux Libertine O}% "0221E = \infty \setmathfont[range={"2261}]{Linux Libertine O}% "02261 = \eqiv \setmathfont[range={"2213}]{Linux Libertine O}% "02213 = \pm -\setmathfont[range={"2219}]{Linux Libertine O}% "02213 = \cdot -\setmathfont[range={"2212}]{Linux Libertine O}% "02212 = \cdot +\setmathfont[range={"2219}]{Linux Libertine O}% "02219 = \cdot +\setmathfont[range={"2212}]{Linux Libertine O}% "02212 = + +\newcommand{\todo}[1]{\textbf{\textsc{\textcolor{red}{(TODO: #1)}}}} %opening \titlehead{\centering \includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.4\textwidth]{./img/HHU_Logo.eps}}