Athemis/Masterarbeit
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0 exch rlineto 0 rlineto closepath } bind def
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/f* { eofill } bind def
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/W { clip } bind def
/W* { eoclip } bind def
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/ET { } bind def
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{ globaldict begin /?pdfmark /pop load def /pdfmark
/cleartomark load def end } ifelse
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/Tj { show currentpoint cairo_store_point } bind def
/TJ {
{
dup
type /stringtype eq
{ show } { -0.001 mul 0 cairo_font_matrix dtransform rmoveto } ifelse
} forall
currentpoint cairo_store_point
} bind def
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cairo_font exch selectfont cairo_point_x cairo_point_y moveto } bind def
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{ pop cairo_selectfont } if } bind def
/Td { matrix translate cairo_font_matrix matrix concatmatrix dup
/cairo_font_matrix exch def dup 4 get exch 5 get cairo_store_point
/cairo_font where { pop cairo_selectfont } if } bind def
/Tm { 2 copy 8 2 roll 6 array astore /cairo_font_matrix exch def
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\markright{Abkürzungsverzeichnis}
\chapter*{Abkürzungsverzeichnis}
\begin{acronym}[F. trinervia]
\setlength{\itemsep}{-\parsep}
\acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
\acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
\acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
\acro{CD}{Circulardichroismus}
\acro{CV}{Säulenvolumen, engl. \textit{column volume}}
\acro{dCTP}{Desoxycytidintriphosphat}
\acro{DNA}{Desocyribonukleinsäure}
\acro{dNTP}{Desoxyribonukleinsäuretriphosphat}
\acro{DTT}{Dithiothreitol}
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\acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}}
\acro{F. trinervia}[\textit{F. trinervia}]{\textit{Flaveria trinervia}}
\acro{HRP}{Meerrettich-Peroxidase, engl. \textit{horseradish peroxidase}}
\acro{IMAC}{Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie}
\acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
\acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion}
\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
\acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
\acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat}
\acro{SDS-PAGE}{Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese}
\acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung}
\acro{SOPMA}{\textit{self-optimized prediction method}}
\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
\end{acronym}
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\chapter{Anhang}

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175
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\chapter{Material und Methoden}
\section{Material}
\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
\label{sec:geraete_hilfsmittel}
\begin{singlespace}
\begin{longtable}{p{0.5\textwidth} p{0.45\textwidth}}
\toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
\midrule
Analysen-/Präzisionswaagen & Sartorius, Göttingen\\
Autoklav & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
\acs{CD}-Spektrometer J-715 & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
Chromatographiesystem \newlineÄKTAprime plus & GE Healthcare, Freiburg \\
DNA-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\
Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R & Eppendorf, Hamburg\\
Image Analyzer LAS-4000 mini & Fujifilm, Düsseldorf\\
Magnetrührer MR 3000/3001 & Heidolph, Schwabach\\
Microplate Reader Infinite 200 PRO & Tecan, Crailsheim \\
Mikrozentrifuge Minispin & Eppendorf, Hamburg\\
Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage & Millipore, Schwalbach\\
Minishaker MS 2 & IKA, Staufen\\
Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti & Beckman Coulter, Krefeld\\
Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwalbach\\
Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\
Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
Zellaufschlusssystem 'One-Shot' & Constant Systems, Daventry, UK\\
\bottomrule
\end{longtable}
\subsection{Verbrauchsmaterialien}
\label{sec:verbrauchsmaterialien}
%\begin{center}
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
\toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
\midrule
Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\
Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25 & GE Healthcare, Freiburg\\
Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
\acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter} & GE-Healthcare, Freiburg\\
Mikrotiterplatten & Hartenstein, Würzburg\\
Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One,\newline Frickenhausen\\
Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter}) & Merck, Bruchsal\\
\bottomrule
\end{tabularx}
\subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren}
\label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren}
%\begin{center}
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
\toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
\midrule
\acs{BSA}-Standard (\SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter}) & Qiagen, Hilden\\
\acs{DNA} \SI{1}{\kb}/\SI{100}{\bp} Ladder & New England Biolabs, Frankfurt\\
PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained) & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\
\bottomrule
\end{tabularx}
\end{singlespace}
\section{Methoden}
\label{sec:methoden}
\subsection{DNA-Konzentrationsbestimmung}
\label{sec:dna_konzentrationsbestimmung}
Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
\begin{align}
\text{OD}_{600} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
\label{eq:dna_konz}
\end{align}
\SI{2}{\micro\liter} der Probe und des verwendeten Puffers werden hierbei auf einer NanoQuant-
Platte im Mikroplatten-Lesegerät vermessen und die Konzentration aus der Differenz
aus Probe und Puffer gemäß Gleichung \ref{eq:dna_konz} berechnet.
\subsection{\acl{PCR}}
\label{sec:pcr}
Mit Hilfe der \ac{PCR} konnen Nukleinsäurefragmente gezielt
vervielfaltigt werden. Die Spezifität der Reaktion ist hierbei durch die Auswahl der
eingesetzten Primer gegeben.
Eine PCR gliedert sich grundsätzlich in drei aufeinanderfolgende Phasen: Während
der Denaturierung bei \SI{95}{\celsius} wird der Doppelstrang in die beiden Einzelstränge
aufgespalten. Das Annealing bei \SIrange{50}{60}{\celsius} führt zur Anlagerung der Primer an die
komplementären Sequenzabschnitte der Einzelstränge des Templates. Die exakte
Temperatur ist hierbei von den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer abhängig.
Während der Elongationsphase erfolgt die Synthese neuer Komplementärstränge
ausgehend von den Primern durch eine DNA-Polymerase.
Durch eine mehrfache Wiederholung kann die Ziel-DNA in kurzer Zeit exponentiell
vervielfacht werden.
\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
\label{sec:inserts_slic}
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} wurde mittels einer \ac{PCR} nach folgendem
Ansatz durchgeführt:
\begin{description}
\item[\ac{PCR}-Ansatz (\SI{50}{\micro\liter})] \hfill \\
\SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
\SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
\SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
\SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
\SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (peqlab, Erlangen) \\
\SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
ad \SI{50}{\micro\liter} dH2O
\end{description}
Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
des zum \ac{PPDK}-Gen homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.
\begin{table}
\centering
\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
\begin{tabular}{ccc}
\toprule
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit [\si{\minute}]} & \textbf{Zyklen}\\
\midrule
95 & 5 & \multirow{4}{*}{10} \\
95 & 1 & \\
46 & 1 & \\
72 & 5 & \\
\midrule
95 & 1 & \multirow{3}{*}{20} \\
65 & 1 & \\
72 & 5 & \\
\midrule
95 & 10 & 1 \\
\bottomrule
\end{tabular}
\label{tab:slic_cycler}
\end{table}
\subsection{\acf{SLIC}}
\label{sec:slic}
Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren, welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I (New England Biolabs, Frankfurt) linearisiert. Hierfür wurden in einem Gesamtvolumen von \SI{25}{\micro\liter} \SI{4000}{\nano\gram} Plasmid-\acs{DNA} für \SI{2}{\hour} bei \SI{22}{\celsius} nach Herstellerangaben gedaut.
Der linearisierte Vektor wurde anschlieend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst.
Die für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
\begin{description}
\item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~\textequiv~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
\SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
\SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
\SI{1}{\Unit} T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{dH2O}
\end{description}
Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von \SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{3,5}{\micro\liter} \ac{dCTP} gestoppt.
In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert DNA im zweifachen molaren Verhältnis (\SI{144}{\nano\gram}) eingesetzt:
\begin{description}
\item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} \textequiv~\SI{150}{\nano\gram}\\
y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} \textequiv~\SI{144}{\nano\gram}\\
\SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{dH2O}
\end{description}

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\subject{Institut für Biochemische Pflanzenphysiologie}
\title{Masterarbeit}
\subtitle{Heterologe Expression und Reinigung der \acl{PPDK} aus der C4 Pflanze \acl{F. trinervia}}
\author{Alexander Ralph Michael Minges}
\begin{document}
\begin{titlepage}
\begin{center}
\large
\vspace*{\fill}
\includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.4\textwidth]{./img/HHU_Logo.eps}\\
Institut für Biochemische Pflanzenphysiologie
\vfill
\Huge
\textsf{\textbf{Masterarbeit}}
\normalsize
\textsf{\textbf{Heterologe Expression und Reinigung der \acl{PPDK} aus der C4 Pflanze \acl{F. trinervia}}}
\vfill
Zur Erlangung des akademischen Grades\\ Master of Science (M. Sc.) - Biochemistry
\vfill
vorgelegt von \\ \textbf{B. Sc. Alexander Ralph Michael Minges \\ (1804535)}
\vfill
im August 2011
\vfill \begin{description}
\item[Erstprüfer:]{Univ. Prof. Dr. G. Groth\\ Institut für Biochemische Pflanzenphysiologie \\ Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf}
\item[Zweitprüfer:]{Univ. Prof. Dr. H. Gohlke\\ Institut für Pharmazeutische und Medizinische Chemie \\ Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf}
\end{description}
\end{center}
\end{titlepage}
% Widmung
\thispagestyle{empty}
\vspace*{\fill}
\begin{center}
\Large <Widmung>
\end{center}
\vspace*{\fill}
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