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\manualmark
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\markright{Abkürzungsverzeichnis}
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\chapter*{Abkürzungsverzeichnis}
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\begin{acronym}[F. trinervia]
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\setlength{\itemsep}{-\parsep}
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\acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
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\acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
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\acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
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\acro{CD}{Circulardichroismus}
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\acro{CV}{Säulenvolumen, engl. \textit{column volume}}
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\acro{dCTP}{Desoxycytidintriphosphat}
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\acro{DNA}{Desocyribonukleinsäure}
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\acro{dNTP}{Desoxyribonukleinsäuretriphosphat}
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\acro{DTT}{Dithiothreitol}
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\acro{EDTA}{Ethylendiamintetraessigsäure}
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\acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}}
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\acro{F. trinervia}[\textit{F. trinervia}]{\textit{Flaveria trinervia}}
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\acro{HRP}{Meerrettich-Peroxidase, engl. \textit{horseradish peroxidase}}
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\acro{IMAC}{Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie}
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\acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
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\acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion}
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\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
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\acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
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\acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat}
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\acro{SDS-PAGE}{Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung}
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\acro{SOPMA}{\textit{self-optimized prediction method}}
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\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
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\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
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||||
\end{acronym}
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\automark[section]{chapter}
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\chapter*{Abstract}
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\appendix
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\chapter{Anhang}
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inc/diskussion.tex
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\chapter{Diskussion}
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\chapter{Einleitung}
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1
inc/ergebnisse.tex
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\chapter{Ergebnisse}
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175
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\chapter{Material und Methoden}
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\section{Material}
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||||
\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
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||||
\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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||||
\begin{singlespace}
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||||
\begin{longtable}{p{0.5\textwidth} p{0.45\textwidth}}
|
||||
\toprule
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||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
||||
\midrule
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||||
Analysen-/Präzisionswaagen & Sartorius, Göttingen\\
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||||
Autoklav & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
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||||
Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
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||||
\acs{CD}-Spektrometer J-715 & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
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||||
Chromatographiesystem \newlineÄKTAprime plus & GE Healthcare, Freiburg \\
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||||
DNA-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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||||
Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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||||
Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
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||||
Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\
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||||
Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
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||||
Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R & Eppendorf, Hamburg\\
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||||
Image Analyzer LAS-4000 mini & Fujifilm, Düsseldorf\\
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||||
Magnetrührer MR 3000/3001 & Heidolph, Schwabach\\
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||||
Microplate Reader Infinite 200 PRO & Tecan, Crailsheim \\
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||||
Mikrozentrifuge Minispin & Eppendorf, Hamburg\\
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||||
Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage & Millipore, Schwalbach\\
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||||
Minishaker MS 2 & IKA, Staufen\\
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||||
Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti & Beckman Coulter, Krefeld\\
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||||
Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwalbach\\
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||||
Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\
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||||
Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
|
||||
Zellaufschlusssystem 'One-Shot' & Constant Systems, Daventry, UK\\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{longtable}
|
||||
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||||
\subsection{Verbrauchsmaterialien}
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||||
\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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||||
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||||
%\begin{center}
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||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
|
||||
\toprule
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||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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||||
\midrule
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||||
Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\
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||||
Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25 & GE Healthcare, Freiburg\\
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||||
Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
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||||
\acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter} & GE-Healthcare, Freiburg\\
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||||
Mikrotiterplatten & Hartenstein, Würzburg\\
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||||
Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
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||||
Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
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||||
Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One,\newline Frickenhausen\\
|
||||
Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter}) & Merck, Bruchsal\\
|
||||
\bottomrule
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||||
\end{tabularx}
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||||
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||||
\subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren}
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||||
\label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren}
|
||||
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||||
%\begin{center}
|
||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
|
||||
\toprule
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||||
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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||||
\midrule
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||||
\acs{BSA}-Standard (\SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter}) & Qiagen, Hilden\\
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||||
\acs{DNA} \SI{1}{\kb}/\SI{100}{\bp} Ladder & New England Biolabs, Frankfurt\\
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||||
PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained) & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\
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||||
\bottomrule
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||||
\end{tabularx}
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||||
\end{singlespace}
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||||
\section{Methoden}
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||||
\label{sec:methoden}
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||||
\subsection{DNA-Konzentrationsbestimmung}
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||||
\label{sec:dna_konzentrationsbestimmung}
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||||
Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
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bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
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durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
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\begin{align}
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||||
\text{OD}_{600} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
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||||
\label{eq:dna_konz}
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||||
\end{align}
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\SI{2}{\micro\liter} der Probe und des verwendeten Puffers werden hierbei auf einer NanoQuant-
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Platte im Mikroplatten-Lesegerät vermessen und die Konzentration aus der Differenz
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aus Probe und Puffer gemäß Gleichung \ref{eq:dna_konz} berechnet.
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\subsection{\acl{PCR}}
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\label{sec:pcr}
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||||
Mit Hilfe der \ac{PCR} konnen Nukleinsäurefragmente gezielt
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vervielfaltigt werden. Die Spezifität der Reaktion ist hierbei durch die Auswahl der
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eingesetzten Primer gegeben.
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Eine PCR gliedert sich grundsätzlich in drei aufeinanderfolgende Phasen: Während
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der Denaturierung bei \SI{95}{\celsius} wird der Doppelstrang in die beiden Einzelstränge
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aufgespalten. Das Annealing bei \SIrange{50}{60}{\celsius} führt zur Anlagerung der Primer an die
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komplementären Sequenzabschnitte der Einzelstränge des Templates. Die exakte
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Temperatur ist hierbei von den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer abhängig.
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Während der Elongationsphase erfolgt die Synthese neuer Komplementärstränge
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ausgehend von den Primern durch eine DNA-Polymerase.
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||||
Durch eine mehrfache Wiederholung kann die Ziel-DNA in kurzer Zeit exponentiell
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vervielfacht werden.
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||||
\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
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\label{sec:inserts_slic}
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||||
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} wurde mittels einer \ac{PCR} nach folgendem
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Ansatz durchgeführt:
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||||
\begin{description}
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\item[\ac{PCR}-Ansatz (\SI{50}{\micro\liter})] \hfill \\
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||||
\SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
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||||
\SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
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||||
\SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
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||||
\SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
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||||
\SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (peqlab, Erlangen) \\
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||||
\SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
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||||
ad \SI{50}{\micro\liter} dH2O
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||||
\end{description}
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||||
Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
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der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
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des zum \ac{PPDK}-Gen homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
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zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.
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||||
\begin{table}
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||||
\centering
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||||
\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
|
||||
\begin{tabular}{ccc}
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||||
\toprule
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||||
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit [\si{\minute}]} & \textbf{Zyklen}\\
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||||
\midrule
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||||
95 & 5 & \multirow{4}{*}{10} \\
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95 & 1 & \\
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||||
46 & 1 & \\
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||||
72 & 5 & \\
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\midrule
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||||
95 & 1 & \multirow{3}{*}{20} \\
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||||
65 & 1 & \\
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||||
72 & 5 & \\
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||||
\midrule
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||||
95 & 10 & 1 \\
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||||
\bottomrule
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||||
\end{tabular}
|
||||
\label{tab:slic_cycler}
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||||
\end{table}
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||||
\subsection{\acf{SLIC}}
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\label{sec:slic}
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||||
Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren, welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
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Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I (New England Biolabs, Frankfurt) linearisiert. Hierfür wurden in einem Gesamtvolumen von \SI{25}{\micro\liter} \SI{4000}{\nano\gram} Plasmid-\acs{DNA} für \SI{2}{\hour} bei \SI{22}{\celsius} nach Herstellerangaben gedaut.
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Der linearisierte Vektor wurde anschlieend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst.
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Die für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
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||||
Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
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\begin{description}
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||||
\item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
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x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~\textequiv~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
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||||
\SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
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||||
\SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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||||
\SI{1}{\Unit} T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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||||
ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{dH2O}
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||||
\end{description}
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||||
Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von \SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{3,5}{\micro\liter} \ac{dCTP} gestoppt.
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||||
In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert DNA im zweifachen molaren Verhältnis (\SI{144}{\nano\gram}) eingesetzt:
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\begin{description}
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||||
\item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
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||||
x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} \textequiv~\SI{150}{\nano\gram}\\
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||||
y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} \textequiv~\SI{144}{\nano\gram}\\
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||||
\SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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||||
ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{dH2O}
|
||||
\end{description}
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1
inc/zusammenfassung.tex
Normal file
1
inc/zusammenfassung.tex
Normal file
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\chapter*{Zusammenfassung}
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