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@ -1,14 +1,15 @@
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\manualmark
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\markright{Abkürzungsverzeichnis}
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\chapter*{Abkürzungsverzeichnis}
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\addchap{Abkürzungsverzeichnis}
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\begin{acronym}[F. trinervia]
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\setlength{\itemsep}{-\parsep}
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\acro{2YT}{\textit{2x Yeast extract and Tryptone} (engl.)}
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\acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
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\acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
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\acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
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\acro{CBB}[CBB G-250]{Coomassie-Brilliant-Blau G-250}
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\acro{CD}{Circulardichroismus}
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\acro{CV}{Säulenvolumen, engl. \textit{column volume}}
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\acro{dCTP}{Desoxycytidintriphosphat}
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\acro{ddH2O}[\ce{ddH2O}]{Doppelt destilliertes Wasser}
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\acro{DNA}{Desocyribonukleinsäure}
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\acro{dNTP}{Desoxyribonukleinsäuretriphosphat}
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\acro{DTT}{Dithiothreitol}
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@ -18,15 +19,17 @@
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\acro{HRP}{Meerrettich-Peroxidase, engl. \textit{horseradish peroxidase}}
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\acro{IMAC}{Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie}
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\acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
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\acro{OD}{Optische Dichte}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.)}
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\acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion}
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\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
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\acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
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\acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat}
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\acro{SDS-PAGE}{Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung}
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\acro{SOPMA}{\textit{self-optimized prediction method}}
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\acro{SOPMA}{\textit{Self-optimized prediction method} (engl.)}
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\acro{TAE}{Tris-Acetat-EDTA}
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\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
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\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
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||||
\end{acronym}
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\automark[section]{chapter}
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\acro{UV}{Ultraviolett}
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\end{acronym}
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@ -1,4 +1,4 @@
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\selectlanguage{english}
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\chapter*{Abstract}
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\addchap{Abstract}
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<Abstract>
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\selectlanguage{ngerman}
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176
inc/material.tex
176
inc/material.tex
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@ -12,7 +12,7 @@
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Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
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\acs{CD}-Spektrometer J-715 & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
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Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus & GE Healthcare, Freiburg \\
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DNA-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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||||
\acs{DNA}-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
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Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\
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@ -53,14 +53,14 @@
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\subsection{Chemikalien}
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\label{sec:chemikalien}
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\begin{longtable}{p{0.33\textwidth} r p{0.38\textwidth}}
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||||
\begin{longtable}{p{0.35\textwidth} r p{0.36\textwidth}}
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||||
\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
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||||
Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
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Coomassie Blue (CB250) & & \\
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||||
\ac{CBB} & 6104-58-1 & \\
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||||
Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
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||||
\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
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||||
\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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@ -149,6 +149,18 @@
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\subsection{Synthetische Oligonukleotide}
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\label{sec:synthetische_oligonukleotide}
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||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.3\textwidth}X}
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||||
\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Sequenz (5'~--~3')} \\
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\midrule
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pETEV-16b-PPDK-for & \texttt{CATGAAAACCTGTATTTTCAGGGACATATG \newline ACCGCTAAAAAACGCGTGTT}\\
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||||
pETEV-16b-PPDK-rev & \texttt{TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAG \newline TTAAACAATCACTTGGGCGG}\\
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||||
\bottomrule
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||||
\end{tabularx}
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||||
\subsection{Plasmide}
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\label{sec:plasmide}
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@ -162,15 +174,31 @@
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||||
\subsection{Kulturmedien}
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\label{sec:kulturmedien}
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||||
\begin{samepage}
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||||
\begin{description}
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||||
\item[2YT (pH 7,5)] \hfill \\
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\item[\acs{2YT} (pH 7,5)] \hfill \\
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||||
\SI{1,6}{\percent} (w/v) Pepton\\
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||||
\SI{1}{\percent} (w/v) Hefeextrakt\\
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||||
\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid\\
|
||||
\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid
|
||||
\end{description}
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||||
\end{samepage}
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||||
\subsection{Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese}
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\label{sec:puffer_agarose_gelelektrophorese}
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||||
\begin{samepage}
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||||
\begin{description}
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||||
\item[\ac{TAE}-Puffer (50x)] \hfill \\
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||||
\SI{100}{\milli\liter} \acs{EDTA} (\SI{0,5}{\Molar}, pH 8)\\
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||||
\SI{57,1}{\milli\liter} Essigsäure\\
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||||
\SI{242}{\gram} Tris\\
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||||
\SI{1}[ad~]{\liter} \ce{ddH2O}
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||||
\end{description}
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||||
\end{samepage}
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||||
\subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
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\label{sec:puffer_zellauschluss}
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||||
\begin{samepage}
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||||
\begin{description}
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||||
\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
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||||
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
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@ -181,14 +209,18 @@
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|||
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
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||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
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||||
\end{description}
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\end{samepage}
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||||
\subsection{Puffer und Lösungen für die Reinigung}
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\label{sec:reinigungspuffer}
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\begin{samepage}
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||||
\begin{description}
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||||
\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
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\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
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||||
\end{description}
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\end{samepage}
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||||
\begin{samepage}
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\begin{description}
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||||
\item[Waschpuffer] \hfill \\
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||||
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
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@ -198,7 +230,9 @@
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|||
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
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||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
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||||
\end{description}
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||||
\end{samepage}
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||||
\begin{samepage}
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\begin{description}
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||||
\item[Elutionspuffer] \hfill \\
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||||
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
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@ -209,7 +243,9 @@
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|||
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
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||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
||||
\end{description}
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\end{samepage}
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||||
\begin{samepage}
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||||
\begin{description}
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||||
\item[Lagerungspuffer] \hfill \\
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\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 8\\
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@ -218,6 +254,7 @@
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|||
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
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||||
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
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||||
\end{description}
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||||
\end{samepage}
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\end{singlespace}
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\section{Molekularbiologische Methoden}
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@ -244,11 +281,6 @@ Die Isolierung von Plasmiden erfolgte aus \SI{5}{\milli\liter} Übernachtkulture
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Die isolierte Plasmid-\acs{DNA} wurde in \SI{10}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl} pH 8,5 bei bei
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\SI{-20}{\celsius} gelagert.
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||||
\subsection{Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen}
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\label{sec:extraktion_dna_agarosegel}
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||||
Die Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen erfolgte mit dem "`illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"'
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||||
nach Herstellerangaben.
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\subsection{Restriktionsverdau von \acs{DNA}}
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\label{sec:restriktionsverdau_dna}
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\begin{samepage}
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@ -257,13 +289,33 @@ Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}
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\begin{description}
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\item[Ansatz Restriktionsverdau] \hfill \\
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\SI{4}{\micro\gram} Vektor-DNA\\
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\SI{2}{\micro\liter} NEBuffer 4 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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\SI{3}{\micro\liter} NEBuffer 4 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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\SI{10}{\Unit} \textit{BamH}I \\
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\SI{10}{\Unit} \textit{Nde}I\\
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||||
ad \SI{25}{\micro\liter} \ce{dH2O}
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ad \SI{25}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
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||||
\end{description}
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\end{samepage}
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\subsection{Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von \acs{DNA}}
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\label{sec:agarose_gelelektrophorese}
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Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe wurde die Agarose"=Gelelektrophorese eingesetzt.
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Hierbei wandern die durch das Phosphatrückrat negativ geladenen Nukleinsäuren im elektrischen Feld durch ein
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Agarose"=Gel zur Anode. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist hierbei abhängig von der Größe, es resultiert
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eine entsprechende Auftrennung im Gel.
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Eine \SI{1}{\percent}ige~(w/v) Lösung von Agarose in \ac{TAE}-Puffer wurde etwa \SI{1}{\centi\meter} hoch auf den
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Gelträger der Elektrophoresekammer gefüllt, mit Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von \SI{0,5}{\micro\gram\per\milli\liter} versetzt
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und durch Schwenken homogen verteilt.
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||||
Das erstarrte Gel wurde anschließend mit \acs{TAE}-Puffer überschichtet und mit \SI{5}{\micro\liter} Marker, sowie den zu analysierenden
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||||
Proben beladen. Die Laufzeit betrug bei \SI{150}{\volt} \SIrange{30}{45}{\minute}.
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||||
Die Dokumentation der \acs{DNA}"=Banden erfolgte fotografisch im \acs{UV}"=Transilluminator.
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||||
\subsection{Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen}
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||||
\label{sec:extraktion_dna_agarosegel}
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||||
Die Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen erfolgte mit dem "`illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"'
|
||||
nach Herstellerangaben.
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||||
\subsection{\acl{PCR}}
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\label{sec:pcr}
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@ -283,23 +335,24 @@ vervielfacht werden.
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\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
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\label{sec:inserts_slic}
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\begin{samepage}
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||||
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl. \ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach folgendem
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||||
Ansatz durchgeführt:
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Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl. \ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
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Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz.
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\begin{description}
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||||
\item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\
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\SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
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||||
\SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
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\SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
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||||
\SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
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||||
\SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (peqlab, Erlangen) \\
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||||
\SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (\SI{1}{\Unit\per\micro\liter}, peqlab, Erlangen) \\
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||||
\SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
|
||||
ad \SI{50}{\micro\liter} dH2O
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||||
\SI{50}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
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||||
\end{description}
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||||
\end{samepage}
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||||
Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
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der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
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des zum \acs{PPDK}-kodierenden Bereich homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
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zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.
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\begin{table}[hbt]
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||||
\centering
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||||
\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
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@ -322,9 +375,45 @@ zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs
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\label{tab:slic_cycler}
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||||
\end{table}
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||||
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\subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}}
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Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden zufällig ausgewählte Kolonien mittels einer Kolonie-PCR
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untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \ce{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
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||||
vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht
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||||
und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \acs{2YT}-Medium verwendet.
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||||
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||||
\begin{description}
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||||
\item[Kolonie-PCR-Ansatz] \hfill \\
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||||
\SI{1}{\micro\liter} T7-Pro-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
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||||
\SI{1}{\micro\liter} T7-Ter-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
|
||||
\SI{2,5}{\micro\liter} 10x~Thermo-Pol-Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
||||
\SI{0,5}{\Unit} Taq-Polymerase (\SI{5}{\Unit\per\micro\liter}, New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
||||
\SI{0,25}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar})\\
|
||||
\SI{25}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß dem in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt.
|
||||
|
||||
\begin{table}[hbt]
|
||||
\centering
|
||||
\caption[Cyclerprogramm Kolonie-\acs{PCR}]{Cyclerprogramm für die Kolonie-\acs{PCR}}
|
||||
\begin{tabular}{ccc}
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||||
\toprule
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||||
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit} & \textbf{Zyklen}\\
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||||
\midrule
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||||
95 & \SI{5}{\minute} & \multirow{4}{*}{30} \\
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||||
95 & \SI{30}{\second} & \\
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||||
48 & \SI{30}{\second} & \\
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||||
72 & \SI{40}[\SI{2}{\minute}~]{\second} & \\
|
||||
\midrule
|
||||
72 & \SI{5}{\minute} & 1 \\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabular}
|
||||
\label{tab:kolonie_pcr_cycler}
|
||||
\end{table}
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||||
|
||||
\subsection{\acf{SLIC}}
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||||
\label{sec:slic}
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||||
Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren,
|
||||
Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren,
|
||||
welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
|
||||
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||||
Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl. \ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor
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||||
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@ -337,22 +426,22 @@ Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Ins
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x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~≡~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
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||||
\SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
|
||||
\SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
||||
\SI{1}{\Unit} T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
||||
ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{dH2O}
|
||||
\SI{1}{\Unit} T4-\acs{DNA}-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
||||
ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
|
||||
\end{description}
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||||
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||||
Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von
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||||
\SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde
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||||
durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.
|
||||
|
||||
In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert DNA (\SI{2691}{\bp}) im zweifachen molaren Verhältnis eingesetzt:
|
||||
In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert-\acs{DNA} (\SI{2691}{\bp}) im zweifachen molaren Verhältnis eingesetzt:
|
||||
|
||||
\begin{description}
|
||||
\item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
|
||||
x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} ≡~\SI{150}{\nano\gram}\\
|
||||
y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} ≡~\SI{141}{\nano\gram}\\
|
||||
\SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
||||
ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{dH2O}
|
||||
ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
|
||||
\end{description}
|
||||
|
||||
Der Ansatz wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{37}{\celsius} inkubiert. \SI{5}{\micro\liter} der Ansätze wurden für die
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||||
|
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@ -361,6 +450,51 @@ Transformation von \acs{E. coli} XL1-Blue eingesetzt.
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|||
\section{Mikrobiologische Methoden}
|
||||
\label{sec:mikrobiologische_methoden}
|
||||
|
||||
\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
|
||||
\label{sec:transformation}
|
||||
Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation. \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetenter Zellen wurden auf
|
||||
Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-\acs{DNA} versetzt. Anschließend wurden die Zellen für \SI{15}{\minute} auf Eis inkubiert.
|
||||
Es folgte ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} von \SI{90}{\second} Dauer. Nach einer erneuten Inkubation auf Eis
|
||||
für \SI{2}{\minute} und der Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} \acs{2YT}-Medium wurden die Zellen für \SI{1}{\hour} unter leichtem
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||||
Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
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||||
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||||
Der \SI{150}{\micro\liter} des Ansatzes wurde anschließend auf \acs{2YT}"=Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin
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||||
ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
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||||
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||||
\subsection{Stammhaltung}
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||||
\label{sec:stammhaltung}
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||||
Die Stammhaltung erfolgte in \SI{20}{\percent}igen Glycerinkulturen bei \SI{-80}{\celsius}. Hierfür wurden \SI{800}{\micro\liter} einer Übernachtkultur
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||||
(vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren.
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||||
\subsection{Expression in \acs{E. coli}}
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||||
\label{sec:expression_ecoli}
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||||
Die Transformation kompetenter Zellen erfolgte wie in \ref{sec:transformation} beschrieben. Die Anzucht erfolgte in \acs{2YT}-Medium
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||||
mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin.
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||||
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||||
\subsubsection{Expressionsstudien}
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||||
\label{sec:expression_ecoli_studien}
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||||
Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
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||||
\SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt.
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||||
|
||||
Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter} Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
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||||
und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer
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||||
\acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar}, \SI{0,5}{\milli\Molar} und \SI{1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
|
||||
|
||||
Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Vier Stunden nach der Induktion bzw. am nächsten Tag
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||||
wurden die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet.
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||||
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||||
\subsubsection{Präparative Expression}
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||||
Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{100}{\milli\liter} Volumen in unschikanierten \SI{250}{\milli\liter}-Kolben angesetzt. Die
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||||
Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der
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||||
Hauptkulturen eingesetzt.
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||||
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||||
Hierfür wurden \SI{2}{\liter} Kolben mit Schikane und \SI{500}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
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||||
und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer
|
||||
\acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
|
||||
|
||||
Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Am nächsten Tag wurden
|
||||
die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet.
|
||||
|
||||
\section{Präparative Methoden}
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||||
\label{sec:praeparative_methoden}
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@ -1 +1,2 @@
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|||
\chapter*{Zusammenfassung}
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\addchap{Zusammenfassung}
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||||
<Zusammenfassung>
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@ -1,4 +1,5 @@
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% !Mode:: "TeX:UTF-8"
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\RequirePackage[ngerman=ngerman-x-latest]{hyphsubst}
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\documentclass[final, % Bearbeitungsstatus: final/draft
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a4paper, % DIN A4
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|
|
@ -15,11 +16,14 @@
|
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english % siunitx)
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]{scrreprt} % Dokumentenklasse
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||||
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\usepackage{libertineotf}
|
||||
\defaultfontfeatures{Ligatures=TeX} %,Numbers=OldStyle}% ,Scale=MatchLowercase} bug in current Biolinum
|
||||
|
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|
||||
% \setmainfont{Linux Libertine O}
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% \setsansfont{Linux Biolinum O}
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% \setmonofont{Lin Mono O}
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%\usepackage{lua-visual-debug}
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||||
|
||||
\usepackage[automark, % Lebende Kolumnentitel
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||||
|
|
@ -38,7 +42,6 @@
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|||
\usepackage{babel} % Neue Deutsche Rechtschreibung/Silbentrennung mit griechischen Buchstaben
|
||||
\usepackage{setspace} % Paket für das Setzen des Zeilenabstandes
|
||||
\onehalfspacing % 1,5facher Zeilenabstand
|
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\usepackage[draft,kerning,spacing,protrusion=true,expansion,tracking=true,babel=true]{microtype} %Mikrotypographie (erweitertes Kerning, etc.)
|
||||
\usepackage{acronym} % Abkürzungen und Abkürzungsverzeichnis
|
||||
\usepackage[alsoload=synchem,locale=DE,obeyall,math-micro=\textmu,text-micro=\textmu]{siunitx}
|
||||
|
||||
|
|
@ -46,13 +49,15 @@
|
|||
\newunit{\kb}{kb} % Definition eigener Einheiten: Kilo-Basenpaare
|
||||
\newunit{\Unit}{U} % Definition eigener Einheiten: Unit
|
||||
\newunit{\rpm}{rpm} % Definition eigener Einheiten: Umdrehungen/Minute
|
||||
\newunit{\g}{x~g} % Definition eigener Einheiten: relative Erdbeschleunigung
|
||||
\newunit{\xg}{\texttimes~g} % Definition eigener Einheiten: relative Erdbeschleunigung
|
||||
\newunit{\psi}{psi} % Definition eigener Einheiten: Pounds per inch
|
||||
\newunit{\CV}{CV}
|
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\newunit{\AS}{AS}
|
||||
|
||||
\usepackage{filecontents}
|
||||
\usepackage{listings}
|
||||
\lstset{breaklines=true,basicstyle=\footnotesize\ttfamily}
|
||||
|
||||
\usepackage{tabularx} % Tabellen mit fester Breite
|
||||
\usepackage{longtable} % Seitenüberspannende Tabellen
|
||||
\usepackage{booktabs} % 'Hübsche' Tabellen ohne vertikale Linien
|
||||
|
|
@ -62,26 +67,23 @@
|
|||
\usepackage{natbib} % Naturwissenschaftliche Zitierungsstile
|
||||
\usepackage[format=plain,footnotesize]{caption}[2008/08/24]
|
||||
\usepackage{subcaption} % Untergeordnete Abbildungen
|
||||
|
||||
\usepackage[fixlanguage]{babelbib} % Sprachanpassung für Literaturverzeichnis
|
||||
\selectbiblanguage{ngerman} % s.o.
|
||||
|
||||
\usepackage{hyperref} % PDF-Eigenschaften (s.u.)
|
||||
\hypersetup{
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||||
unicode=true, % non-Latin characters in Acrobat’s bookmarks
|
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|
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pdfmenubar=true, % show Acrobat’s menu?
|
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pdffitwindow=false, % window fit to page when opened
|
||||
pdfstartview={FitH}, % fits the width of the page to the window
|
||||
pdftitle={Masterarbeit}, % title
|
||||
pdfauthor={Alexander Ralph Michael Minges}, % author
|
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|
||||
pdfcreator={Alexander Ralph Michael Minges}, % creator of the document
|
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pdfkeywords={Masterarbeit, PPDK, Flaveria trinervia, Expression, Reinigung}, % list of keywords
|
||||
pdfnewwindow=true, % links in new window
|
||||
colorlinks=true, % false: boxed links; true: colored links
|
||||
linkcolor=black, % color of internal links
|
||||
citecolor=black, % color of links to bibliography
|
||||
filecolor=black, % color of file links
|
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urlcolor=black % color of external links
|
||||
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|
||||
pdfauthor={Alexander Ralph Michael Minges},
|
||||
pdfcreator={Alexander Ralph Michael Minges},
|
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|
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pdfsubject={Heterologe Expression und Reinigung der Pyruvat-Phosphat Dikikanse aus der C4 Pflanze Flaveria trinervia},
|
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pdfkeywords={Masterarbeit, PPDK, Flaveria trinervia, Expression, Reinigung},
|
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}
|
||||
|
||||
\usepackage{unicode-math}
|
||||
|
|
@ -92,8 +94,16 @@
|
|||
\setmathfont[range=\mathbfit/{latin,Latin,num,Greek,greek}]{Linux Libertine O Bold Italic}
|
||||
\setmathfont[range={"221E}]{Linux Libertine O}% "0221E = \infty
|
||||
\setmathfont[range={"2261}]{Linux Libertine O}% "02261 = \eqiv
|
||||
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|
||||
\setmathfont[range={"2219}]{Linux Libertine O}% "02213 = \cdot
|
||||
\setmathfont[range={"2212}]{Linux Libertine O}% "02212 = \cdot
|
||||
|
||||
|
||||
%\usepackage[draft,kerning,spacing,protrusion=true,expansion,tracking=true,babel=true]{microtype} %Mikrotypographie (erweitertes Kerning, etc.)
|
||||
\usepackage[final,
|
||||
kerning,
|
||||
expansion,
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|
||||
%opening
|
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\titlehead{\centering \includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.4\textwidth]{./img/HHU_Logo.eps}}
|
||||
\subject{Institut für Biochemische Pflanzenphysiologie}
|
||||
|
|
@ -144,12 +154,13 @@
|
|||
\onehalfspacing
|
||||
\clearpage
|
||||
|
||||
\addcontentsline{toc}{chapter}{Abstract}
|
||||
\addcontentsline{toc}{chapter}{Zusammenfassung}
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\include{./inc/abkuerzungen}
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||||
\include{./inc/abstract}
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||||
% \addcontentsline{toc}{chapter}{Abstract}
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||||
\include{./inc/zusammenfassung}
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||||
% \addcontentsline{toc}{chapter}{Zusammenfassung}
|
||||
|
||||
\include{./inc/einleitung}
|
||||
|
||||
|
|
@ -169,8 +180,6 @@
|
|||
\bibliographystyle{natdin}
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||||
\bibliography{./library}
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|
||||
\include{./inc/abkuerzungen}
|
||||
|
||||
\include{./inc/anhang}
|
||||
|
||||
\end{document}
|
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