Athemis/Masterarbeit
1
0
Fork 0
Code Releases Activity

Material und Methoden; Alignment hinzugefügt

Browse source
This commit is contained in:
Alexander Minges 2012-08-01 03:24:07 +02:00
parent f59d279abd
commit 9119d1667b
6 changed files with 1880 additions and 1598 deletions
Download patch file Download diff file Expand all files Collapse all files

12
inc/anhang.tex
View file

@ -1,4 +1,16 @@
\appendix
\chapter{Nuklein- und Aminosäuresequenzen}
\begin{texshade}{./misc/align_seq_ref.aln}
\setsize{names}{scriptsize}
\setsize{residues}{scriptsize}
\showruler{1}{top}
\hidenumbering
\hideconsensus
\showcaption{Sequenzalignment der \acs{PPDK}-kodierenden Sequenz im Vektor pETEV-16b-ppdk und der
Referenzsequenz}
\shortcaption{Sequenzalignment pETEV-16b-ppdk}
\end{texshade}
\chapter{Anhang}
\chapter{Erklärung}

52
inc/material.tex
View file

@ -420,7 +420,7 @@ vervielfacht werden.
\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
\label{sec:inserts_slic}
\begin{samepage}
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl. \ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl.~\ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz.
\begin{description}
\item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\
@ -501,8 +501,8 @@ Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cyc
Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren,
welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl. \ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor
wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl. \ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die
Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor
wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl.~\ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die
für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
%
@ -549,7 +549,7 @@ ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
\subsection{Stammhaltung}
\label{sec:stammhaltung}
Die Stammhaltung erfolgte in \SI{20}{\percent}igen Glycerinkulturen bei \SI{-80}{\celsius}. Hierfür wurden \SI{800}{\micro\liter} einer Übernachtkultur
(vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren.
(vgl.~\ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren.
\subsection{Heterologe Expression in \acs{E. coli}}
\label{sec:expression_ecoli}
@ -562,7 +562,7 @@ Die optimalen Bedingungen zur heterologen Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. c
unterschiedliche Konzentrationen von \ac{IPTG} zur Induktion verwendet wurden. Es kamen hierbei die \acs{E. coli}"=Stämme BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3)
zum Einsatz.
Von den Agarplatten (vgl. \ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
Von den Agarplatten (vgl.~\ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
\SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt.
Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
@ -592,9 +592,12 @@ in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für weitere Versuche bei \SI{-80}{\
\section{Präparative Methoden}
\label{sec:praeparative_methoden}
Aufgrund der Kältelabilität der \acs{PPDK}, welche bei der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} besonder ausgeprägt ist \citep{Burnell1990}, wurden alle
Schritte des Zellaufschlusses und der Reinigung -- wenn nicht abweichend angegeben -- bei Raumtemperatur durchgeführt.
\subsection{Zellaufschluss}
\label{sec:zellaufschluss}
Ein Aliquot eingefrorener Zellen (siehe \ref{sec:praeparative_expression}) wurde bei Raumtemperatur mit \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer,
Ein Aliquot eingefrorener Zellen (siehe~\ref{sec:praeparative_expression}) wurde bei Raumtemperatur mit \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer,
sowie einer Spatelspitze DNAse I (Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt und durch Vortexen resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch Hochdruckdispersion
bei einem Druck von \SI{1,35}{\kilo\bar} und einer Temperatur von \SI{15}{\celsius}.
@ -628,18 +631,18 @@ von \SI{30}{\kilo\dalton} zu Einsatz.
\subsection{Entsalzung von Proteinlösungen}
\label{sec:entsalzung}
Nach der Reinigung wurden Fraktionen, welche die \acs{PPDK} enthielten mittels Ultrafiltration (vgl. \ref{sec:konzentrierung}) auf ein Volumen
Nach der Reinigung wurden Fraktionen, welche die \acs{PPDK} enthielten mittels Ultrafiltration (vgl.~\ref{sec:konzentrierung}) auf ein Volumen
von etwa \SI{2,5}{\milli\liter} eingeengt. Zur Umpufferung des Konzentrats in Lagerungspuffer kam eine PD-10-Säule zum Einsatz. Es handelt sich
hierbei um eine Größenauschlusschromatographie-Säule, bei welcher die Proteinanteile der Lösung eine wesentlich geringere Retentionszeit aufweisen,
als die gelösten Salzionen und somit mit einem geringeren Volumen von der Säule eluieren.
Die Säule wurde mit \SI{25}{\milli\liter} Lagerungspuffer äquilibriert und anschließend mit der konzentrierten Probe beladen. Anschließend wurde die
Differenz des Probenvolumens zu \SI{2,5}{\milli\liter} durch Lagerungspuffer ausgeglichen. Die Elution erfolgte mit \SI{3,5}{\milli\liter}
Lagerungspuffer. Die entsalzten Proben wurden erneut aufkonzentriert (vgl. \ref{sec:konzentrierung}).
Lagerungspuffer. Die entsalzten Proben wurden erneut aufkonzentriert (vgl.~\ref{sec:konzentrierung}).
\subsection{Lagerung von PPDK-Konzentraten}
\label{sec:lagerung}
Die kurzfristige Lagerung (max \SI{24}{\hour}) entsalzter \acs{PPDK}-Konzentrate (vgl. \ref{sec:entsalzung}) erfolgte nach Zugabe von \SI{1}{\percent}iger
Die kurzfristige Lagerung (max.~\SI{24}{\hour}) entsalzter \acs{PPDK}-Konzentrate (vgl.~\ref{sec:entsalzung}) erfolgte nach Zugabe von \SI{1}{\percent}iger
\ac{NaN3}-Lösung im Verhältnis 1:1000 bei Raumtemperatur.
Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v) Glycerin bei \SI{-20}{\celsius} gelagert.
@ -650,7 +653,7 @@ Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v)
\subsection{Differentielle Zentrifugation}
\label{sec:differentielle_zentrifugation}
Nach dem Zellaufschluss (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurde eine Probe von \SI{10}{\micro\liter} aus dem Homogenisat als Kontrolle entnommen.
Nach dem Zellaufschluss (vgl.~\ref{sec:zellaufschluss}) wurde eine Probe von \SI{10}{\micro\liter} aus dem Homogenisat als Kontrolle entnommen.
Anschließend wurde das Homogenisat bei \SI{2000}{\xg} für \SI{15}{\minute} bei \SI{15}{\celsius} zentrifugiert. Das resultierende Pellet
wurde im gleichen Volumen Aufschlusspuffer unter Zusatz von \SI{0,1}{\percent} (w/v) \acs{SDS} bei Raumtemperatur und unter Rühren rückgelöst.
@ -676,8 +679,8 @@ Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v)
\subsection{Größenauschlusschromatographie}
\label{sec:groessenausschluss}
Um die Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmen, wurde ein entsalztes Konzentrat (vgl. \ref{sec:entsalzung}) nach der Reinigung mittels
\acs{IMAC} (vgl. \ref{sec:affinitaetschromatographie}) einer analytischen Größenausschlusschromatographie unterzogen. Hierbei dient die Säulenmatrix
Um die Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmen, wurde ein entsalztes Konzentrat (vgl.~\ref{sec:entsalzung}) nach der Reinigung mittels
\acs{IMAC} (vgl.~\ref{sec:affinitaetschromatographie}) einer analytischen Größenausschlusschromatographie unterzogen. Hierbei dient die Säulenmatrix
als Molekularsieb. Höhermolekulare Anteile eluieren hierbei schneller von der Säule, als niedermolekulare Anteile, da letztere in die Poren des
Säulenmaterials eindringen können.
@ -712,13 +715,13 @@ Pipettierschema für drei kleine Gele (\SI{9}{\centi\meter}~\texttimes~\SI{10}{\
\caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
\begin{tabular}{lll}
\toprule
& \textbf{Trenngel} & \textbf{Sammelgel}\\
& {\textbf{Trenngel}} & {\textbf{Sammelgel}}\\
\midrule
\acs{AA/BAA} 30 & \SI{10,9}{\milli\liter} & \SI{2}{\milli\liter}\\
Trenn-/Sammelgelpuffer & \SI{9,2}{\milli\liter} & \SI{2,6}{\milli\liter}\\
\acs{ddH2O} & \SI{3,6}{\milli\liter} & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
Trenn-/Sammelgelpuffer & \SI{13,2}{\milli\liter} & \SI{2,5}{\milli\liter}\\
\acs{ddH2O} & \SI{8,6}{\milli\liter} & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
\acs{TEMED} & \SI{16,5}{\micro\liter} & \SI{12,3}{\micro\liter}\\
\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112}{\micro\liter} & \SI{129}{\micro\liter}\\
\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112,2}{\micro\liter} & \SI{129}{\micro\liter}\\
\bottomrule
\end{tabular}
\label{tab:pipettierschema_sds_page}
@ -814,9 +817,11 @@ Der \acs{NADH}-Verbrauch kann photometrisch über die Abnahme der \acs{NADH}-spe
Verbrauch eines \acs{NADH}-Moleküls gleichbedeutend ist mit der Bildung eines \acl{PEP}-Moleküls durch die \acs{PPDK}, kann aus dem Verbrauch an
\acs{NADH} direkt auf die Bildungsrate von \acl{PEP} und somit auf die Aktivität der \acs{PPDK} geschlossen werden.
Der Reaktionsansatz nach \citet{Salahas1990} (vgl. \ref{sec:puffer_aktivitaetsassay}) wurde mit \SI{0,5}{\micro\liter} gereinigtem und entsalztem
\acs{PPDK}-Konzentrat versetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{2,5}{\milli\liter} einer \SI{100}{\milli\Molar} \acs{ATP}-Lösung
(Endkonzentration: \SI{1,25}{\milli\Molar}) gestartet und die Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} über einen Zeitraum von \SI{3}{\minute} aufgezeichnet.
Der Reaktionsansatz nach \citet{Salahas1990} (vgl.~\ref{sec:puffer_aktivitaetsassay}) wurde mit \SI{0,5}{\micro\liter} gereinigtem und entsalztem
\acs{PPDK}-Konzentrat versetzt. Die \acs{PPDK}-Lösung wurde zuvor für \SI{30}{\minute} bei \SI{30}{\celsius} inkubiert, um eine möglichst vollständige
Aktivierung zu erreichen \citep{Ashton1990}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{2,5}{\milli\liter} einer \SI{100}{\milli\Molar} \acs{ATP}-Lösung
(Endkonzentration: \SI{1,25}{\milli\Molar}) gestartet und die Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} über einen Zeitraum von \SI{3}{\minute} bei \SI{30}{\celsius}
aufgezeichnet.
Der Verbrauch an \acs{NADH} kann über das Lambert-Beer'sche Gesetz in Gleichung \eqref{eq:lambert_beer} aus der gemessenen Extinktion mit Hilfe des molaren Extinktionskoeffizienten für NADH
$\epsilon_{340} = \SI{6,3e3}{\per\Molar\per\centi\meter}$ \citep{McComb1976} und der Schichtdicke berechnet werden.
@ -837,3 +842,12 @@ $\epsilon_{340} = \SI{6,3e3}{\per\Molar\per\centi\meter}$ \citep{McComb1976} und
\subsection{Erstellung von Homologiemodellen}
\label{sec:erstellung_homologiemodell}
Zur Visualisierung der wahrscheinlichen dreidimensionalen Struktur der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} und zur Vorbereitung zukünftiger Analysen
wurden Homologiemodelle erstellt. Diese basieren auf den aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBG/1VBH) und \textit{Chlostridium symbiosum} (PDB: 1KBL) bekannten
Extremkonformationen des putativen \textit{Domain-swiveling}-Mechanismus.
Die Homologiemodelle wurden mit dem Programm \textit{Modeller} \citep{Sali1993a} aus den jeweiligen Templaten und der Primärstruktur der
\acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Rosche1990} generiert. Im Falle des von \textit{Zea mays} abgeleiteten Modells wurde als Vorlage die Pyruvat gebundene Struktur
verwendet (PDB: 1VBH). Lücken in der dreidimensionalen Struktur wurden anhand der ungebundenen Struktur (PDB: 1VBG) ergänzt.
Die Evaluation der erstellten Modelle erfolgte mit dem Programmpaket \textit{PROCHECK} \citep{Laskowski1993,Laskowski1996}.