Athemis/Masterarbeit
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Alexander Minges 2012-10-04 11:02:08 +02:00
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inc/abkuerzungen.tex
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@ -1,7 +1,7 @@
\addchap{Abkürzungsverzeichnis}
\begin{acronym}[C. symbiosum]
\setlength{\itemsep}{-\parsep}
\acro{2YT}{\textit{2x Yeast extract and Tryptone} (engl.)}
\acro{2YT}{\textit{2\texttimes Yeast extract and Tryptone} (engl.)}
\acro{3PGAK}{3-Phosphoglycerat Kinase}
\acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
\acro{ADP}{Adenosindiphosphat}
@ -18,6 +18,7 @@
\acro{ddH2O}[\ce{ddH2O}]{Doppelt destilliertes Wasser}
\acro{DNA}{Desocyribonukleinsäure}
\acro{dNTP}{Desoxyribonukleinsäuretriphosphat}
\acro{DOPE}{\textit{Discrete Optimized Protein Energy}~(engl.)}
\acro{DTT}{Dithiothreitol}
\acro{EDTA}{Ethylendiamintetraessigsäure}
\acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}}
@ -50,6 +51,8 @@
\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
\acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
\acro{rcf}{\textit{relative centrifugal force}~(engl.)}
\acro{RMSD}{\textit{root mean square deviation}~(engl.)}
\acro{RNA}{Ribonukleinsäure}
\acro{RuBisCO}{Ribulose"=1,5"=bisphosphat"=carboxylase/"=oxygenase}
\acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat}
\acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung}
@ -60,5 +63,6 @@
\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
\acro{TEV}{\textit{Tobacco etch virus}~(engl.)}
\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
\acro{tRNA}{Transfer-\acs{RNA}}
\acro{UV}{Ultraviolett}
\end{acronym}

9
inc/abstract.tex
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@ -1,4 +1,13 @@
\selectlanguage{english}
\addchap{Abstract}
\acresetall
The objective of this work was the heterologous expression and purification of the pyruvate, phosphate dikinase (PPDK) from \ac{F. trinervia} and to provide evidence for its functional folding by conducting an activity assay.
Codon-optimized \acs{DNA} was cloned in an expression vector derived from pET-16b. Cells of the \ac{E. coli} strain BL21 (DE3) were subsequently transformed using this vector and used for the expression of the \ac{PPDK}. The expressed protein was purified using its His-tag for an affinity chromatography. Yields of up to \SI{118}{\milli\gram\per\liter} culture could be achieved in high purity.
The functional folding of the expressed \ac{PPDK} was tested measuring \acs{CD} spectra in combination with a coupled enzyme assay in which pyruvate, \acs{ATP} and inorganic phosphate react to phosphoenolpyruvate (PEP), \acs{AMP} and pyrophosphate. Using this assay, the kinetic parameters of the heterologous expressed \acs{PPDK} from \acs{F. trinervia} could be obtained: the \ce{K_m} were measured as \SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} (\acs{ATP}) and \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar} (pyruvate), the specific activity was \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram}.
As a result of a size exclusion chromatography it could be shown that certain fractions of the purified \acs{PPDK} were monodisperse and hence suitable for crystallization experiments.
In conclusion, the \ac{PPDK} from \ac{F. trinervia} could be successfully expressed and purified to a high degree. Furthermore the purified protein was active and hence folded natively.
\selectlanguage{ngerman}

21
inc/anhang.tex
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@ -20,6 +20,7 @@
\showcaption{Sequenzalignment der \acs{PPDK}-kodierenden Sequenz im Vektor pETEV-16b-ppdk und der
Referenzsequenz}
\shortcaption{Sequenzalignment pETEV-16b-ppdk}
\label{abb:pair_align}
\end{texshade}
\clearpage
@ -28,6 +29,10 @@
\shadingmode{similar}
\threshold[80]{50}
\feature{top}{1}{1..380}{box[Green,Green]:Nukleotid-Bindedomäne[Black]}{}
\feature{top}{1}{381..516}{box[Yellow,Yellow]:Phosphohistidin-Domäne[Black]}{}
\feature{top}{1}{517..871}{box[Blue,Blue]:PEP/Pyruvat-Bindedomäne[White]}{}
\nameseq{1}{F. trinervia}
\nameseq{2}{F. brownii}
\nameseq{3}{Zea mays}
@ -45,7 +50,7 @@
\hidenumbering
\defconsensus{{$\bullet$}}{{$\bullet$}}{{$\bullet$}}
\showconsensus[ColdHot]{bottom}
\nameconsensus{conservation}
\nameconsensus{Konservierung}
% \showlegend
\showcaption{Multiples Alignment der Aminosäuresequenzen der \acs{PPDK}s aus \acs{F. trinervia}, \acs{F. brownii}, \textit{Zea mays} und
\acs{C. symbiosum}. Sequenzidentitäten sind farbkodiert dargestellt: \SI{100}{\percent} Identität (violett), \SI{75}{\percent} (blau) und
@ -60,19 +65,29 @@
\section{Evalutation der Homologiemodelle}
\begin{figure}[htb]
\centering
\includegraphics[height=0.5\textheight,keepaspectratio=true]{./img/anhang/FtPPDK_Zm.eps}
\includegraphics[height=0.65\textheight,keepaspectratio=true]{./img/anhang/FtPPDK_Zm.eps}
% FtPPDK_Zm.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=0 -1 474 638
\caption{Ramachandran-Plot des von \textit{Zea mays} abgeleiteten Homologiemodells}
\label{abb:ramachandran_Zm}
\end{figure}
\begin{figure}[htb]
\centering
\includegraphics[height=0.5\textheight,keepaspectratio=true]{./img/anhang/FtPPDK_Cs.eps}
\includegraphics[height=0.65\textheight,keepaspectratio=true]{./img/anhang/FtPPDK_Cs.eps}
% FtPPDK_Cs.svg: 765x990 pixel, 72dpi, 26.99x34.92 cm, bb=0 0 765 990
\caption{Ramachandran-Plot des von \acs{C. symbiosum} abgeleiteten Homologiemodells}
\label{abb:ramachandran_Cs}
\end{figure}
\chapter{Danksagung}
Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Dr. Georg Groth für das mir entgegengebrachte Vertrauen, die interessante und fordernde Fragestellung, sowie die Denkanstöße zur richtigen Zeit. Herrn Prof. Dr. Holger Gohlke gilt mein Dank für die Übernahme des Zweitgutachtens und die Betreuung meines Forschungspraktikums. Ohne die Fertigkeiten, die mir während dieses Praktikums vermittelt wurden, wäre die Erstellung der Homologiemodelle weitaus schwieriger gewesen.
Darüberhinaus danke ich der gesamten Arbeitsgruppe für jegliche erbrachte Unterstützung, den freundlichen Umgang miteinander und insbesondere Mareike dafür, dass wir wieder einmal eine Abschlussarbeit "`im Tandem"' absolvieren konnten.
Ich danke Benni, Mel und Daniel dafür, dass sie mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite gestanden haben. Es gibt wirklich keine Frage, die nicht einer von Euch beantworten kann. Danke! Mel gilt mein besonderer Dank, da sie einmal mehr -- in Ermangelung einer eigenen S2"=Einweisung -- die CD-Spektren für mich aufgenommen hat.
Ohne Christian und Judith wäre der Aktivitätstest in dieser Form nicht möglich gewesen. Danke Christian, dass ich Deine Vorräte an PEPCase plündern durfte.
Zu guter letzt möchte ich auch Patricia danken, ohne die sicherlich unsere Chemikalienbestände dauerhaft leer wären. Danke auch, dass ich mir immer mal wieder etwas von Dir ausborgen durfte, von der Pipette bis zum Puffer. Danke Euch allen!
\chapter{Erklärung}
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Masterarbeit selbstständig verfasst und keine anderen, als die angegebenen Quellen und

73
inc/diskussion.tex
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@ -1,37 +1,30 @@
\chapter{Diskussion}
\section{Expression und Reinigung der \acs{PPDK}}
Die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} konnte erfolgreich in \acs{E. coli} BL21 (DE3) exprimiert werden. Sowohl in einer vierstündigen Expression,
als auch in einer Expression über Nacht zeigten sich in der differentiellen Zentrifugation nur geringe unlösliche Anteile, gemessen an der
Gesamtmenge Protein (vgl. \ref{sec:ergebnisse_dz}). Dies spricht dafür, dass nur in geringem Maße \textit{Inclusion Bodies} gebildet wurden und legt die
Vermutung nahe, das der lösliche Proteinanteil nativ gefaltet ist.
Die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} konnte erfolgreich in \acs{E. coli} BL21 (DE3) exprimiert werden. Sowohl in einer vierstündigen Expression, als auch in einer Expression über Nacht zeigten sich in der differentiellen Zentrifugation nur geringe unlösliche Anteile, gemessen an der Gesamtmenge Protein (vgl. \ref{sec:ergebnisse_dz}). Dies spricht dafür, dass nur in geringem Maße \textit{Inclusion Bodies} gebildet wurden und legt die Vermutung nahe, das der lösliche Proteinanteil nativ gefaltet ist.
Dies konnte durch die \acs{CD}-Spektroskopie gestützt werden. Es konnten Sekundärstrukturanteile nachgewiesen werden, welche sich mit
Sequenz basierten \textit{ab initio} Vorhersagen, sowie bekannten Strukturdaten decken (vgl. Tabelle \ref{tab:cd}). In einem letzten Schritt konnte die tatsächlich funktionelle
Faltung der rekombinanten \acs{PPDK} in einem Aktivitätsassay gezeigt werden.
Dies konnte durch die \acs{CD}-Spektroskopie gestützt werden. Es konnten Sekundärstrukturanteile nachgewiesen werden, welche sich mit Sequenz basierten \textit{ab initio} Vorhersagen, sowie bekannten Strukturdaten decken (vgl. Tabelle \ref{tab:cd}). In einem letzten Schritt konnte die tatsächlich funktionelle Faltung der rekombinanten \acs{PPDK} in einem Aktivitätstest gezeigt werden.
Im Rahmen der Reinigung konnten mit steigender Imidazolkonzentration insgesamt drei Fraktionen \acs{PPDK} gewonnen werden, die eine jeweils hohe Reinheit aufweisen (vgl. \ref{abb:reinigung_sds} und sich
durch ihre Dispersität unterscheiden (siehe Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}). Der Oligomerisierungsgrad beeinflusst offenbar die Bindungsaffinität der \acs{PPDK} an die Säule,
was zu einem unterschiedlichen Elutionsverhalten führt. Ursächlich könnte eine zunehmende Maskierung des Hexa-Histidin-Tags in den Oligomeren sein. Eine zuverlässige Größenzuordnung
konnte in der Größenausschluschromatographie aufgrund der sehr eng zusammen liegenden Elutionsvolumina nicht vorgenommen werden. Es konnte aber gezeigt werden, dass
die bei \SI{250}{\milli\Molar} gewonnene Fraktion monodispers vorliegt und sich somit gut für zukünftige Kristallisationsexperimente eignet.
Im Rahmen der Reinigung konnten mit steigender Imidazolkonzentration insgesamt drei Fraktionen \acs{PPDK} gewonnen werden, die eine jeweils hohe Reinheit aufweisen (vgl. \ref{abb:reinigung_sds}) und sich durch ihre Dispersität unterscheiden (siehe Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}). Der Oligomerisierungsgrad beeinflusst offenbar die Bindungsaffinität der \acs{PPDK} an die Säule,
was zu einem unterschiedlichen Elutionsverhalten führt. Ursächlich könnte eine zunehmende Maskierung des Hexa-Histidin-Tags in den Oligomeren sein. Eine zuverlässige Größenzuordnung konnte in der Größenausschluschromatographie aufgrund der sehr eng zusammen liegenden Elutionsvolumina nicht vorgenommen werden. Es konnte aber gezeigt werden, dass die bei \SI{250}{\milli\Molar} gewonnene Fraktion monodispers vorliegt und sich somit gut für zukünftige Kristallisationsexperimente eignet.
Die Proteinausbeute liegt -- betrachtet man nur die monodispers gereinigte Fraktion -- bei etwa \SI{47}{\milli\gram\per\liter} Kulturmedium und ist somit als
hoch einzuschätzen. Der in der Literatur beschriebene Effekt der ausgeprägten Kältelabilität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Burnell1990},
welcher zum Zerfall der funktionellen Tetramere in Monomere führt, ließe sich unter Umständen zur Erhöhung der effektiv nutzbaren Ausbeute einsetzen. Durch eine
Vereinigung aller gereinigter PPDK-Fraktionen und anschließender Kältebehandlung sollte zu einer einheitlichen Population der PPDK-Monomere führen. Die Ausbeute
beträgt dann etwa \SI{118}{\milli\gram\per\liter} Kultur.
In Bezug auf den Oligomerisierungsgrad der \acs{PPDK} können auf Grund der Instabilität der eingesetzten Eichproteine im verwendeten Reinigungspuffer keine gesicherten Aussagen getroffen werden. Die mit \SI{200}{\milli\Molar} Imidazol eluierte Fraktion 2 weist jedoch eine recht geringe spezifische Aktivität im Vergleich zur mit \SI{250}{\milli\Molar} eluierten Fraktion 3 auf (Tabelle \ref{tab:aktivitaet}). Aus dem Chromatogramm (Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}) wird ersichtlich, dass bei Fraktion 2 der \textit{Peak} bei einem Elutionsvolumen von etwa \SI{1,7}{\milli\liter} im Vergleich zu Fraktion 3 deutlich niedriger und ein zusätzlicher \textit{Peak} bei etwa \SI{1,97}{\milli\liter} zu erkennen ist. Bei letzterem könnte es sich demnach um die inaktive monomere Form handeln, der \textit{Peak} bei \SI{1,68}{\milli\liter} könnte somit die aktive tetramere Form darstellen. Das Ausschlussvolumen der Säule wurde mit \SI{1,2}{\milli\liter} bestimmt, so dass es sich bei dem in Fraktion 1 sichtbaren \textit{Peak} bei \SI{1,28}{\milli\liter} um Aggregate handeln könnte.
Die Proteinausbeute liegt -- betrachtet man nur die monodispers gereinigte Fraktion -- bei etwa \SI{47}{\milli\gram\per\liter} Kulturmedium. Aus der Literatur ist für die heterologe Expression der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} in \acs{E. coli} eine Ausbeute von \SI{5}{\milli\gram\per\liter} Kultur bekannt \citep{Chastain1997}. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielte Ausbeute ist mit \SI{47}{\milli\gram\per\liter} für die monodisperse Fraktion bzw. \SI{118}{\milli\gram\per\liter} für die Summe aller \acs{PPDK}"=Fraktionen um den Faktor 10 bis 20 höher. Dies kann durch die Verwendung Codon optimierter \acs{DNA} erklärt werden, welche zu einer höheren Translationsrate und somit Expressionsrate führt. Zu beachten ist hierbei allerdings die erhöhte Gefahr einer Fehlfaltung des Proteins durch die höhere Translationsgeschwindigkeit \citep{Komar1999,Cortazzo2002}. Die damit einhergehende Bildung von \textit{Inclusion bodies} konnte aber nicht beobachtet werden (vgl. Abbildung \ref{abb:dz}). Ebenfalls gegen eine Fehlfaltung spricht die Ausbildung von Sekundärstrukturen (vgl. \ref{sec:ergebnisse_cd}) und die beobachtete Aktivität (vgl.~\ref{sec:ergebnisse_aktivitaetsassay}) der heterolog exprimierten \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}.\pagebreak
Der in der Literatur beschriebene Effekt der ausgeprägten Kältelabilität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Burnell1990}, welcher zum Zerfall der funktionellen Tetramere in Monomere führt, ließe sich unter Umständen zur Erhöhung der effektiv nutzbaren Ausbeute einsetzen. Die Vereinigung aller gereinigter PPDK-Fraktionen und eine anschließende Kältebehandlung sollte zu einer einheitlichen Population von PPDK-Monomeren führen.
\section{Aktivität der gereinigten PPDK}
Die spezifische Aktivität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} liegt mit \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram} in der \acs{PEP}-bildenden Richtung in der Größenordnung
von Literaturwerten für \textit{Zea mays} \citep{Hatch1975}. In ähnlicher Weise stimmen auch die bestimmten \ce{K_m}-Werte für ATP \SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} und
Pyruvat \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar} mit bekannten Literaturwerten von \textit{Zea mays} und \textit{F. brownii} überein \citep{Hatch1975,Ohta1997}, die ebenfalls
im zwei- bis dreistelligen mikromolaren Bereich liegen. Ein Vergleich der experimentellen Daten mit Literaturwerten ist in Tabelle \ref{tab:literatur} aufgeführt.
Die spezifische Aktivität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} liegt mit \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram} in der \acs{PEP}-bildenden Richtung in der Größenordnung von Literaturwerten für \textit{Zea mays} \citep{Hatch1975}. In ähnlicher Weise stimmen auch die bestimmten \ce{K_m}-Werte für ATP \SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} und Pyruvat \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar} mit Literaturwerten von \textit{Zea mays} und \textit{F. brownii} überein \citep{Hatch1975,Ohta1997}, die ebenfalls im zwei- bis dreistelligen mikromolaren Bereich liegen. Ein Vergleich der experimentellen Daten mit Literaturwerten ist in Tabelle \ref{tab:literatur} aufgeführt. Auffällig ist hierbei, dass die \ce{K_m}"=Werte der heterolog exprimierten \acs{PPDK}s jeweils deutlich unterhalb der nativ isolierten liegen. Dies ist vermutlich auf fehlende Regulationsmechanismen -- beispielsweise die lichtinduzierte Phosphorylierung durch das \ac{PDRP} (siehe \ref{sec:c4_ppdk}) -- bei der heterolog exprimierten \acs{PPDK} zurückzuführen.
\ce{V_{max}} wurde im Rahmen der nichtlinearen Regression für \acs{ATP} und Pyruvat bestimmt. Unter Berücksichtigung der Standardabweichung sind die beiden Werte
-- \SI[seperr]{0,095(5)}{\milli\Molar\per\minute} (ATP) und \SI[seperr]{0,093(5)}{\milli\Molar\per\minute} (Pyruvat) -- als identisch anzusehen. Dies entspricht der
Erwartung, da die maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung in beiden Fällen identisch sein sollte.
%
\begin{table}[htb]
\begin{table}[H]
\centering
\begin{threeparttable}
\caption[Vergleich der kinetischen Parameter mit Literaturwerten]{Vergleich der kinetischen Parameter mit Literaturwerten der PPDK aus \textit{F. bidentis}, \textit{F. brownii} und \textit{Zea mays}.
Die Literaturwerte beziehen sich jeweils auf die \acs{PEP}-bildende Reaktion.}
Die Literaturwerte beziehen sich jeweils auf die \acs{PEP}-bildende Reaktion. Ohne Klammern sind die \ce{K_m}"=Werte der heterolog in \acs{E. coli} exprimierten \acs{PPDK} angegeben, in Klammern die der nativ isolierten.}
\label{tab:literatur}
\begin{tabular}{llll}
@ -41,43 +34,39 @@ im zwei- bis dreistelligen mikromolaren Bereich liegen. Ein Vergleich der experi
\midrule
\acs{F. trinervia} & \num[seperr]{50(9)} & \num[seperr]{270(44)} & \num[seperr]{ 0,99(9)} \\
\midrule
\textit{F. bidentis} & 25\tnote{2} & 73\tnote{2} & \\
\textit{F. brownii} & 88\tnote{2} & 67\tnote{2} & \\
\textit{Zea mays} & 95\tnote{2} & 158\tnote{2} & 1,2\tnote{1} \\
\textit{F. bidentis} & 49 (25)\tnote{2} & 59 (73)\tnote{2} & \\
\textit{F. brownii} & 50 (88)\tnote{2} & 32 (67)\tnote{2} & \\
\textit{Zea mays} & 47 (95)\tnote{2} & 65 (158)\tnote{2} & 1,2\tnote{1} \\
& & (178)\tnote{3} & \\
\bottomrule
\end{tabular}
\begin{tablenotes}
\item[1] \citet{Hatch1975}
\item[2] \citet{Ohta1997}
\item[3] \citet{Chastain2011}
\end{tablenotes}
\end{threeparttable}
\end{table}
\ce{V_{max}} wurde im Rahmen der nichtlinearen Regression für \acs{ATP} und Pyruvat bestimmt. Unter Berücksichtigung der Standardabweichung sind die beiden Werte
-- \SI[seperr]{0,095(5)}{\milli\Molar\per\minute} (ATP) und \SI[seperr]{0,093(5)}{\milli\Molar\per\minute} (Pyruvat) -- als identisch anzusehen. Dies entspricht der
Erwartung, da die maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung in beiden Fällen identisch sein sollte.
Der beobachtete Abfalls der gemessenen Reaktionsgeschwindigkeit bei einer \acs{ATP}-Konzentration von \SI{2,5}{\milli\Molar} (Abbildung \ref{abb:kinetik_atp}) ist auf
Der beobachtete Abfall der gemessenen Reaktionsgeschwindigkeit bei einer \acs{ATP}-Konzentration von \SI{2,5}{\milli\Molar} (Abbildung \ref{abb:kinetik}) ist auf
die inhibitorische Wirkung von \acs{ATP}, \acs{ADP} und \acs{AMP} auf die als letzte Stufe des gekoppelten Enzymassays eingesetzte \acs{MDH} zurückzuführen \citep{Harris}. Bei einer \acs{ATP}-Konzentration
von \SI{2,5}{\milli\Molar} ist nicht mehr die Pyruvat-Bildung durch die \acs{PPDK}, sondern die Umsetzung des Oxalacetats durch die \acs{MDH} der geschwindigkeitsbestimmende Schritt.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Aktivität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} in etwa vergleichbar mit anderen bekannten PPDKs ist.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Aktivität der rekombinant aus \acs{E. coli} gewonnenen \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} in etwa vergleichbar mit anderen bekannten rekombinant hergestellten \citep{Ohta1997,Chastain2011}, oder nativ isolierten \citep{Hatch1975,Ohta1997} PPDKs ist.
\section{Homologiemodelle}
Die erstellten Homologiemodelle weisen nach einer Analyse mit PROCHECK keine auffälligen Anomalien auf, so dass die Modelle als hinreichend korrekt angesehen werden können.
Die erstellten Homologiemodelle weisen nach einer Analyse mit PROCHECK keine auffälligen Anomalien auf, so dass die Modelle als hinreichend korrekt angesehen werden können. Hierauf deuten auch die zDOPE"=Werte von -0,92803 für das auf \textit{Zea mays} bzw. -0,92815 für das auf \acs{C. symbiosum} basierende Modell hin. Bei Betrachtung der DOPE"=Werte je Position im Alignment (vgl. Abbildung \ref{abb:dope}) zeigt sich, dass die Profile der Modelle und der entsprechenden Template qualitativ ähnlich sind. Es fallen allerdings Verschiebungen mit zunehmender Position im Alignment auf, welche auf einen Versatz des Alignments hindeuten können. Dies ist allerdings unwahrscheinlich, da insbesondere im C-terminalen Bereich innerhalb der \acs{PEP}/Pyruvat"=Bindedomäne (ab Position 517) hoch konservierte Sequenzabschnitte mit bekannter Funktionalität -- beispielsweise in Bezug auf die Substratbindung -- zu finden sind. Diese konservierten Abschnitte sind korrekt aligniert (vgl. Abbildung \ref{abb:ma}), weisen aber im DOPE"=Profil dennoch einen Versatz auf (Abbildung \ref{abb:dope}).
Da die \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} zudem eine hohe Sequenzidentität von \SI{79}{\percent} zur \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} aufweist, bietet das hierauf basierende
Modell eine gute Annäherung an die tatsächliche dreidimensionale Struktur der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}, insbesondere in Hinblick auf die räumliche Ausrichtung
der Seitenketten in der \acs{PEP}-Bindetasche. In Kombination mit der Identifikation hoch konservierter Sequenzabschnitte können einige für die \acs{PEP}-Bindung und
Umsetzung wichtige Reste identifiziert werden \citep{Nakanishi2005}: Arg562, Arg619, Arg669, Glu748, Asp772 und Asn771, sowie Cys834, welches als Protonen-Donor fungiert (Abbildung \ref{abb:substratbindetasche}).
Durch gezielte Mutation dieser Reste kann in zukünftigen Experimenten ihr Einfluss auf die Aktivität und Stabilität der \acs{PPDK} untersucht werden.
%
\clearpage
%
\section{Ausblick}
Die im Rahmen dieser Arbeit gereinigte \acs{PPDK} liegt in hoher Konzentration, monodispers und hoher Reinheit vor, so dass sie in Kristallisationsexperimente eingesetzt
werden kann. Eine erfolgreiche Kristallisation ist dann notwendig für die Strukturaufklärung mittels Röntgenkristallographie. Zusätzlich können anhand der erstellten
Homologiemodelle \textit{in silico} Analysen durchgeführt werden. Beispielsweise kann nach Bindetaschen für Effektoren gesucht werden, welche das \textit{Domain-Swiveling}
in distinkten Zwischenstadien halten. Sobald Kristallisationsbedingungen für die wildtypische Form etabliert sind, können diese für die Co-Kristallisation mit den gefundenen
Effektoren adaptiert werden. Letztere können darüber hinaus direkt mit Hilfe des etablierten Aktivitätsassays auf ihren Einfluss auf die \acs{PPDK}-Aktivität hin untersucht werden.
Aus den resultierenden Strukturdaten ließen sich dann intermediäre Konformationen ableiten, die zu einem genaueren Verständnis der Funktionalität
der \acs{PPDK} führen können. Mittels einer Netzwerkanalyse ließen sich zusätzlich Regionen innerhalb der \acs{PPDK} identifizieren, welche für die Flexibilität der zentralen
Phospho"=Histidin"=Domäne verantwortlich sind. Hier bietet sich ein weiterer Ansatzpunkt um beispielsweise über \textit{Cross-Linking} Zwischenkonformationen zu stabilieren.
Die im Rahmen dieser Arbeit gereinigte \acs{PPDK} liegt in hoher Konzentration, monodispers und hoher Reinheit vor, so dass sie in Kristallisationsexperimente eingesetzt werden kann. Eine erfolgreiche Kristallisation ist dann notwendig für die Strukturaufklärung mittels Röntgenkristallographie. Zusätzlich können anhand der erstellten Homologiemodelle \textit{in silico} Analysen durchgeführt werden. Beispielsweise kann nach Bindetaschen für Effektoren gesucht werden, welche das \textit{Domain-Swiveling} in distinkten Zwischenstadien halten. Sobald Kristallisationsbedingungen für die wildtypische Form etabliert sind, können diese für die Co-Kristallisation mit den gefundenen Effektoren adaptiert werden. Letztere können darüber hinaus direkt mit Hilfe des etablierten Aktivitätstests auf ihren Einfluss auf die \acs{PPDK}-Aktivität hin untersucht werden. Aus den resultierenden Strukturdaten ließen sich dann intermediäre Konformationen ableiten, die zu einem genaueren Verständnis der Funktionalität der \acs{PPDK} führen können. Mittels einer Netzwerkanalyse ließen sich zusätzlich Regionen innerhalb der \acs{PPDK} identifizieren, welche für die Flexibilität der zentralen Phospho"=Histidin"=Domäne verantwortlich sind. Hier bietet sich ein weiterer Ansatzpunkt um beispielsweise über \textit{Cross-Linking} Zwischenkonformationen zu stabilieren.
Ein weiterer interessanter Aspekt ist die genauere Untersuchung der Kältelabilität der \acs{PPDK}. Die für die Kältetoleranz bestimmter \acs{PPDK} Spezies verantwortlichen Aminosäurereste sind bekannt und für die Wirkungsweise wurden hydrophobe Wechselwirkungen, sowie eine gesteigerten Affinität zum im Tetramer zentral komplexierten \ce{Mg^{2+}}-Ion postuliert \citep{Ohta1997}. Gelöste Kristallstrukturen, auch von Mutanten, welche die zur Kältetoleranz führenden Punktmutationen tragen, könnten diese Vermutungen bestätigen oder erweitern.

44
inc/einleitung.tex
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@ -4,40 +4,42 @@ Die \acl{PPDK} (PPDK, EC 2.7.9.1) gehört zur Enzymklasse der Phosphotransferase
\ce{\text{Pyruvat} + \text{ATP} + \text{Pi} <=> \text{PEP} + \text{AMP} + \text{PPi}}
\end{equation*}
Erstmals beschrieben wurde die \acs{PPDK} von \citet{Slack1968,Reeves1968} in tropischen Gräsern und der parasitären Amöbe
\textit{Entamoeba histolytica} \citep{Chastain2011}. Strukturdaten der \acs{PPDK} sind verfügbar aus \textit{Clostridium symbiosum} \citep{Herzberg1996}, \textit{Zea mays} \citep{Nakanishi2005} und \textit{Trypanosomas brucei} \citep{Cosenza2002}.
\textit{Entamoeba histolytica} \citep{Chastain2011}. Strukturdaten der \acs{PPDK} sind verfügbar aus \textit{Clostridium symbiosum} (\SI{1,94}{\angstrom}; \citet{Herzberg1996}), \textit{Zea mays} (\SI{2,3}{\angstrom}; \citet{Nakanishi2005}) und \textit{Trypanosomas brucei} (\SI{3,0}{\angstrom}; \citet{Cosenza2002}).
\section{Strukturelle Funktionalität der \acs{PPDK}}
Die \acs{PPDK} kann in drei Domänen unterteilt werden:
Die \acs{PPDK} kann auf Grund von Sequenzhomologien, sowie funktionellen Überlegungen und Strukturdaten in drei Domänen unterteilt werden:
\begin{enumerate}
\item \acs{PEP}/Pyruvat-Bindedomäne
\item Nukleotid-Bindedomäne
\item Zentrale Phosphohistidin-Domäne
\item Nukleotid-Bindedomäne (AS 1-380)
\item Zentrale Phosphohistidin-Domäne (AS 381-516)
\item \acs{PEP}/Pyruvat-Bindedomäne (AS 517-871)
\end{enumerate}
Innerhalb der N-terminalen Nukleotid-Bindedomäne formen 240 Reste eine so genannte \textit{\acs{ATP} grasp}, während 340 Reste innerhalb der C-terminalen \acs{PEP}/Pyruvat"=Bindedomäne ein \textit{TIM barrel}-Motiv bilden. Die Nukleotid"=Bindedomäne wurde über Sequenzhomologien zu bekannten \acs{ATP}"=bindenden Proteinen identifiziert, die \acs{PEP}/Pyruvat"=Bindedomäne über kristallographische Strukturdaten in Anwesenheit von des Substratanalogons Phosphonopyruvate \citep{Herzberg2002}.
\begin{figure}[H]
\centering
\includegraphics[height=0.7\textheight,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/ppdk_1vbh.png}
% ppdk_1vbh.png: 2480x4004 pixel, 300dpi, 21.00x33.90 cm, bb=0 0 595 961
\caption[Struktur der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays}]{Struktur der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBH). Farblich abgesetzt sind die Nukleotid-Bindedomäne (grün), \acs{PEP}/Pyruvat-Bindedomäne (blau) mit dem Substra \acs{PEP} und einem \ce{Mg2+}-Ion, die Phosphohistidin-Domäne (gelb), sowie die Linker-Peptide(rot). Der katalytische Rest His458 ist durch einen Pfeil hervorgehoben. Die Überlagerung (grau) zeigt die \acs{PPDK} aus \acs{C. symbiosum} (PDB: 1KBL). Das katalytische His455 ist ebenfalls durch einen Pfeil markiert. Es zeigt sich die Torsionsbewegung der zentralen Phosphohistidindomäne.}
\caption[Struktur der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays}]{Struktur der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBH). Farblich abgesetzt sind die Nukleotid-Bindedomäne (grün), \acs{PEP}/Pyruvat-Bindedomäne (blau) mit dem Substrat \acs{PEP} und einem \ce{Mg^{2+}}-Ion, die Phosphohistidin-Domäne (gelb), sowie die Linker-Peptide (rot). Der katalytische Rest His458 ist durch einen Pfeil hervorgehoben. Die Überlagerung (grau) zeigt die \acs{PPDK} aus \acs{C. symbiosum} (PDB: 1KBL). Das katalytische His455 ist ebenfalls durch einen Pfeil markiert. Es zeigen sich zwei unterschiedliche Konformationen der zentralen Phosphohistidindomäne.}
\label{abb:swivel_domain}
\end{figure}
Verknüpft sind die genannten Domänen über flexible Linker-Peptide. Der Abstand zwischen der Nukleotid-Bindedomäne und der \acs{PEP}/Pyruvat-Bindedomäne beträgt etwa \SI{50}{\angstrom}, so dass eine direkte Interaktion der Substrate mit dem katalytisch
aktiven Histidinrest in der zentralen Phosphohistidin-Domäne nicht möglich ist. Daher wurde ein so genannter \textit{Domain-Swiveling}-Mechanismus vorgeschlagen, der eine Torsionsbewegung der Phosphohistidin-Domäne postuliert, wodurch die Übertragung der Phosphatgruppen ermöglicht wird \citep{Herzberg1996,Nakanishi2005}. Das Ausmaß dieser Domänenbewegung ist bei Überlagerung der \acs{PEP}-gebundenen Struktur aus \textit{Zea mays} und der ungebundenen Struktur aus \acs{C. symbiosum} (Abbildung \ref{abb:swivel_domain}).
Verknüpft sind die genannten Domänen über flexible Linker-Peptide. Der Abstand zwischen der Nukleotid-Bindedomäne und der \acs{PEP}/Pyruvat-Bindedomäne beträgt etwa \SI{45}{\angstrom}, so dass eine direkte Interaktion der Substrate mit dem katalytisch
aktiven Histidinrest in der zentralen Phosphohistidin-Domäne nicht möglich ist. Daher wurde ein so genannter \textit{Domain-Swiveling}-Mechanismus vorgeschlagen, der eine Torsionsbewegung der Phosphohistidin-Domäne postuliert, wodurch die Übertragung der Phosphatgruppen ermöglicht wird \citep{Herzberg1996,Nakanishi2005}. Das Ausmaß dieser Domänenbewegung ist bei Überlagerung der \acs{PEP}-gebundenen Struktur aus \textit{Zea mays} und der ungebundenen Struktur aus \acs{C. symbiosum} (Abbildung \ref{abb:swivel_domain}) erkennbar.
\section{Funktion in $\text{C}_\text{4}$-Pflanzen}
\label{sec:c4_ppdk}
Am besten untersucht ist die Funktion der \acs{PPDK} in \ce{C_4}"=Pflanzen. In \ce{C_3}-Pflanzen limitiert die Oxygenase-Aktivität der \ac{RuBisCO} die Effizienz
der Photosynthese bei warmen Umgebungstemperaturen oder bei Wasserstress. Bei den genannten Bedingungen werden die Spaltöffnungen der Blätter geschlossen um
den Wasserverlust durch Verdunstung zu minimieren. Durch das Schließen der Spaltöffnungen wird aber auch die Diffusion von \ce{CO2} in das Blatt vermindert. Die resultierende Absenkung der \ce{CO2}-Konzentration in den photosynthetisch aktiven Zellen führt zu einer Begünstigung der zur \ce{CO2}-Fixierung konkurrierenden Oxygenaseaktivität der \ac{RuBisCO} \citep{Sharkey1989,Cornic2000,Lawlor2002}. Durch die Fixierung von \ce{O2} statt \ce{CO2} wird entsteht als Zwischenprodukt 2-Phosphoglycolat, welches nicht im Calvin-Zyklus verstoffwechselt werden kann und unter zusätzlichem Energieverbrauch über die Photorespiration in 3-Phosphoglycerat umgesetzt wird.
der Photosynthese bei warmen Umgebungstemperaturen oder Wasserstress. Die genannten Bedingungen führen zum Schließen der Spaltöffnungen in den Blättern, um den Wasserverlust durch Verdunstung zu minimieren. Durch das Schließen der Spaltöffnungen wird aber auch die Diffusion von \ce{CO2} in das Blatt vermindert. Die resultierende Absenkung der \ce{CO2}-Konzentration in den photosynthetisch aktiven Zellen führt zu einer Begünstigung der zur \ce{CO2}-Fixierung konkurrierenden Oxygenaseaktivität der \ac{RuBisCO} \citep{Sharkey1989,Cornic2000,Lawlor2002}. Durch die Fixierung von \ce{O2} statt \ce{CO2} wird entsteht als Zwischenprodukt 2-Phosphoglycolat, welches nicht im Calvin-Zyklus verstoffwechselt werden kann und unter zusätzlichem Energieverbrauch über die Photorespiration in 3-Phosphoglycerat umgesetzt wird.
Die \ce{C_4}"=Kohlenstofffixierung umgeht dieses Problem durch eine räumliche Trennung von \ce{CO2}-Fixierung und Calvin-Zyklus. Hierdurch kann \ce{CO2} konzentriert werden, was der \acs{RuBisCO} eine \ce{CO2} reiche Umgebung zur Verfügung stellt. Hierdurch wird die Oxygenaseaktivität stark reduziert.
Die \ce{C_4}"=Kohlenstofffixierung umgeht dieses Problem durch eine räumliche Trennung von \ce{CO2}-Fixierung und Calvin-Zyklus. Hierdurch kann \ce{CO2} konzentriert werden, was der \acs{RuBisCO} eine \ce{CO2} reiche Umgebung zur Verfügung stellt und die Oxygenaseaktivität stark reduziert.
Die \acs{PPDK} ist hierbei im Stroma der Chloroplasten der Mesophyllzellen lokalisiert und katalysiert dort die Regeneration des primären \ce{CO2}-Akzeptors \ac{PEP} \citep{Hatch2002}.
\begin{figure}[H]
\centering
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/C4_photosynthesis_NADP-ME_type.eps}
% C4_photosynthesis_NADP-ME_type.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=0 -1 713 233
\caption[\ce{C_4}"-Kohlenstofffixierung]{\ce{C_4}"-Kohlenstofffixierung nach dem NADP-\acs{ME} Mechanismus. Dargestellt sind eine Mesophyllzelle (links) und eine Bündelscheidezelle (rechts), sowie die Chloroplasten (grün). \ce{CO2} wird auf \ac{PEP} übertragen, welches in Malat umgewandelt und in die Bündelscheidezelle transportiert wird. Dort wird \ce{CO2} abgespalten und das entstandene Pyruvat zurück in die Chloroplasten der Mesophyllzelle transportiert, wo \ac{PEP} durch die \acs{PPDK} aus Pyruvat regeneriert wird. \citep{Raghavendra2011}}
\caption[\ce{C_4}"=Kohlenstofffixierung]{\ce{C_4}"-Kohlenstofffixierung nach dem NADP-\acs{ME} Mechanismus. Dargestellt sind eine Mesophyllzelle (links) und eine Bündelscheidezelle (rechts), sowie die Chloroplasten (grün). \ce{CO2} wird auf \ac{PEP} übertragen, welches in Malat umgewandelt und in die Bündelscheidezelle transportiert wird. Dort wird \ce{CO2} abgespalten und das entstandene Pyruvat zurück in die Chloroplasten der Mesophyllzelle transportiert, wo \ac{PEP} durch die \acs{PPDK} aus Pyruvat regeneriert wird. \citep{Raghavendra2011}}
\label{abb:c4_cycle}
\end{figure}
@ -57,12 +59,12 @@ Abbildung \ref{abb:c4_cycle} illustriert die \ce{C_4}"=Kohlenstofffixierung mit
\label{abb:aktivierung_ppdk}
\end{figure}
Die Regulation der \acs{PPDK} erfolgt lichtabhängig durch das \ac{PDRP} über die Phosphorylierung eines Threonin-Restes (vgl. Abbildung \ref{abb:aktivierung_ppdk}) im aktiven Zentrum \citep{Burnell1985,Burnell2006,Chastain2011}.
Die Regulation der \acs{PPDK} erfolgt lichtabhängig durch das \ac{PDRP} über die Phosphorylierung eines Threonin-Restes (vgl. Abbildung \ref{abb:aktivierung_ppdk}) im aktiven Zentrum \citep{Burnell1985,Chastain2003,Burnell2006,Chastain2011}.
\section{Funktion in $\text{C}_\text{3}$-Pflanzen}
Über die Funktion der \acs{PPDK} in \ce{C_3}-Pflanzen liegen weitaus weniger gesicherte Erkenntnisse vor. Die \acs{PPDK} kann ubiquitär in Geweben aus \ce{C_3}-Pflanzen nachgewiesen werden, liegt dort aber meist nur in sehr geringen Konzentrationen vor \citep{Chastain2003}. Dies erschwert die biochemische Charakterisierung von \acs{PPDK}s aus \ce{C_3}-Pflanzen \textit{in vivo}, da die Umsetzung der Substrate, sowie die Produktbildung nicht zuverlässig verfolgt werden können. Zudem wird der Substratumsatz durch konkurrierende Reaktionen der Pyruvat-Kinase und \acs{PEP}-Carboxykinase maskiert \citep{Chastain2011}. \textit{Knock-out} Linien von \textit{Arabidopsis thaliana} zeigen keinen veränderten Phänotyp, so dass auch hierüber eine Aussage über die Funktion der \acs{PPDK} in \ce{C_3}-Pflanzen nicht möglich ist \citep{Chastain2011}.
Über die Funktion der \acs{PPDK} in \ce{C_3}-Pflanzen liegen weitaus weniger gesicherte Erkenntnisse vor. Die \acs{PPDK} kann ubiquitär in Geweben aus \ce{C_3}-Pflanzen nachgewiesen werden, liegt dort aber meist nur in sehr geringen Konzentrationen vor \citep{Chastain2003}. Dies erschwert die biochemische Charakterisierung von \acs{PPDK}s aus \ce{C_3}-Pflanzen \textit{in vivo}, da die Umsetzung der Substrate, sowie die Produktbildung nicht zuverlässig verfolgt werden können. Zudem wird der Substratumsatz durch konkurrierende Reaktionen der Pyruvat-Kinase und \acs{PEP}-Carboxykinase maskiert \citep{Chastain2011}. \textit{Knock-out} Linien von \textit{Arabidopsis thaliana} zeigen keinen veränderten Phänotyp, so dass auch hierüber keine Aussage über die Funktion der \acs{PPDK} in \ce{C_3}-Pflanzen möglich ist \citep{Chastain2011}.
Untersuchungen an Mais-Samen, in denen die \acs{PPDK} in hohem Maße im Cytoplasma des Endosperms exprimiert wird legen allerdings eine Funktion als ergänzendes Enzym der Glykolyse nahe \citep{Kang2005,Hennen-Bierwagen2009}. Es wurde postuliert, dass die \acs{PPDK} durch die von ihr katalysierte, frei reversible Reaktion den Kohlenstofffluss zwischen verschiedenen Biosynthesewegen
Untersuchungen an Mais-Samen, in denen die \acs{PPDK} in hohem Maße im Cytoplasma des Endosperms exprimiert wird, legen allerdings eine Funktion als ergänzendes Enzym der Glykolyse nahe \citep{Kang2005,Hennen-Bierwagen2009}. Es wurde postuliert, dass die \acs{PPDK} durch die von ihr katalysierte, frei reversible Reaktion den Kohlenstofffluss zwischen verschiedenen Biosynthesewegen
ausgleicht \citep{Hennen-Bierwagen2009} und \acs{ATP} in hypoxischen Bereichen des Endosperms zur Verfügung stellt \citep{Chastain2006}.
\section{Funktion in nicht-pflanzlichen Organismen}
@ -74,17 +76,17 @@ Reaktion erlaubt sowohl die Synthese von \acs{ATP}, als auch die Bildung von \ac
\centering
\includegraphics[width=0.6\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/ppdk_glycolysis.eps}
% ppdk_glycolysis.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=0 -1 536 475
\caption[Einfluss der \acs{PPDK} auf die glykolytische ATP-Ausbeute]{Einfluss der \acs{PPDK} auf die glykolytische ATP-Ausbeute. Durch das Zusammenspiel zwischen \ac{AK} und \ac{PPDK} können im Vergleich zur konventionellen Glykolyse drei zusätzliche Moleküle \acs{ATP} je Glukosemolekül gewonnen werden.}
\caption[Einfluss der \acs{PPDK} auf die glykolytische ATP-Ausbeute]{Einfluss der \acs{PPDK} auf die glykolytische ATP-Ausbeute. Durch das Zusammenspiel zwischen \ac{AK} und \ac{PPDK} können im Vergleich zur konventionellen Glykolyse drei zusätzliche Moleküle \acs{ATP} je Glukosemolekül gewonnen werden (nach \citet{Chastain2011}).}
\label{abb:glykolyse}
\end{figure}
%
Durch synergetische Effekte zwischen \acl{AK} und \ac{PPDK} kann die \acs{ATP}-Ausbeute von drei Molekülen \acs{ATP} je Molekül Glukose auf fünf Moleküle \acs{ATP} erhöht werden (Abbildung \ref{abb:glykolyse}). Hierbei kann die Bindungsenergie von Pyrophosphat durch die \acs{PPDK} zum Aufbau von \acs{ATP} aus \acs{AMP} genutzt werden \citep{Huang2008}. Die Reaktion läuft dabei in die Pyruvat-formende Richtung ab.
Durch synergetische Effekte zwischen \acl{AK} und \ac{PPDK} kann die \acs{ATP}-Ausbeute in der Glykolyse von drei Molekülen \acs{ATP} je Molekül Glukose auf fünf Moleküle \acs{ATP} erhöht werden (Abbildung \ref{abb:glykolyse}). Hierbei kann die Bindungsenergie von Pyrophosphat durch die \acs{PPDK} zum Aufbau von \acs{ATP} aus \acs{AMP} genutzt werden \citep{Huang2008}. Die Reaktion läuft dabei in die Pyruvat-formende Richtung ab.
\section{Kälteinaktivierung}
\label{sec:kaelte}
Eine besondere Eigenschaft der \acs{PPDK} ist die Kälteinaktivierung. Die funktionelle Form ist ein Tetramer, welches bei Temperaturen unterhalb von \SI{10}{\celsius} in inaktive Di- und Monomere zerfällt \citep{Slack1968,Shirahashi1978,Burnell1990}.
Bei der experimentellen Arbeit mit der \acs{PPDK} ergibt sich hieraus die Problematik, dass alle Arbeitsschritte bei Raumtemperatur
durchgeführt werden müssen, was aber die Anfälligkeit für die Degradierung durch im Zelllysat enthaltene Proteasen erhöht. Durch Erwärmen auf \SI{30}{\celsius} ist allerdings eine weitgehende Reaktivierung zu erreichen \citep{Burnell1985}.
durchgeführt werden müssen, was aber die Anfälligkeit für die Degradierung durch im Zelllysat enthaltene Proteasen erhöht. Durch Erwärmen auf \SI{30}{\celsius} ist allerdings eine weitgehende Reaktivierung zu erreichen \citep{Burnell1985, Ashton1990}.
Die Kältesensitivität ist zwischen verschiedenen Spezies unterschiedlich stark ausgeprägt. Innerhalb der Gattung \textit{Flaveria} weist die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} die höchste Sensitivität auf (vgl. Abbildung \ref{abb:cold_lability}): Nach einer \SI{30}{\minute} Inkubation bei \SI{0}{\celsius} konnte eine Restaktivität von lediglich \SI{10}{\percent} beobachtet werden. Die \acs{PPDK} aus \acs{F. brownii} wies nach der Kältebehandlung eine Restaktivität von \SI{80}{\percent} auf \citep{Burnell1990}.
%
@ -96,11 +98,11 @@ Die Kältesensitivität ist zwischen verschiedenen Spezies unterschiedlich stark
\label{abb:cold_lability}
\end{figure}
%
Durch Sequenzanalysen konnten gezeigt werden, dass nur wenige Aminosäurereste die Kältesensitivität stark beeinflussen \citep{Ohta1997}. Darüberhinaus kann durch Zusatz von Glycerin und reduzierenden Agenzien wie \acs{DTT} die Aktivität zu einem Großteil erhalten bleiben \citep{Shirahashi1978}.
Durch Sequenzanalyse und die Generierung chimärer \acs{PPDK}s konnten gezeigt werden, dass nur drei Aminosäurereste die Kältesensitivität stark beeinflussen. Es handelt sich hierbei um Pro790, Leu806 und Val873 in der \acs{PPDK} aus \textit{F. brownii} (\citet{Ohta1997}; vgl. auch Abbildung \ref{abb:ma}). \citet{Ohta1997} postulieren eine erhöhte Affinität der \acs{PPDK}"=Monomere zum zentralen \ce{Mg^{2+}}-Ion, sowie stärkere hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Monomeren als Ursache der beobachteten Kältetoleranz durch die oben genannten Reste. Erstere Annahme wird dadurch gestützt, dass \acs{PPDK}s, welche diese Reste aufweisen gleichzeitig toleranter gegenüber einer Inaktivierung durch chelatierende Substanzen wie \acs{EDTA} sind \citep{Ohta1997}. Darüberhinaus kann durch Zusatz von Glycerin und reduzierenden Agenzien wie \acs{DTT} die Aktivität zu einem Großteil erhalten bleiben \citep{Shirahashi1978}.
\section{Zielsetzung}
Die \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} wurde bereits heterolog in \acs{E. coli} exprimiert \citep{Chastain1996,Nakanishi2003} und gereinigt. Ebenfalls etabliert ist ein photometrischer Aktivitätsassay über die \acs{PEP}-Carboxylase und die Malatdehydrogenase \citep{Jenkins1985,Salahas1990}.
Die \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} wurde bereits heterolog in \acs{E. coli} exprimiert \citep{Chastain1996,Nakanishi2003} und gereinigt. Ebenfalls etabliert ist ein photometrischer Aktivitätstest über die \acs{PEP}-Carboxylase und die Malatdehydrogenase \citep{Jenkins1985,Salahas1990}.
Auf diesen Ergebnissen aufbauend war es Ziel dieser Arbeit, ein Expressions- und Reinigungsprotokoll für die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} zu etablieren, sowie nachzuweisen, dass das gereinigte Enzym funktionell gefalten ist. Darüber hinaus sollten Homologiemodelle erstellt werden, um im Vorfeld zukünftiger Experimente die Identifikation funktionell und strukturell bedeutender Reste zu ermöglichen.

214
inc/ergebnisse.tex
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@ -4,10 +4,7 @@
\section{Klonierung}
\label{sec:erg_klonierung}
%
Sie \acs{SLIC}-Klonierung erfolgte wie in \ref{sec:slic} beschrieben. Die mittels \acs{PCR} synthetisierten \textit{Inserts}
(vgl.~\ref{sec:inserts_slic}), sowie der linearisierte Vektor (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}) wurden zur Reinigung auf ein
Agarosegel aufgetragen (vgl. \ref{sec:agarose_gelelektrophorese}). Es ergab sich das in Abbildung \ref{abb:agarosegel_vektor_insert} gezeigte
Auftrennungsmuster.
Sie \acs{SLIC}-Klonierung erfolgte wie in \ref{sec:slic} beschrieben. Zur Erhöhung der Translationsgeschwindigkeit und somit der Expressionsrate lag die für die \acs{PPDK} kodierende \acs{DNA} Sequenz Codon optimiert für \acs{E. coli} vor \citep{Ikemura1981}. Die mittels \acs{PCR} synthetisierten \textit{Inserts} (vgl.~\ref{sec:inserts_slic}), sowie der linearisierte Vektor (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}) wurden zur Reinigung auf ein Agarosegel aufgetragen (vgl. \ref{sec:agarose_gelelektrophorese}). Es ergab sich das in Abbildung \ref{abb:agarosegel_vektor_insert} gezeigte Auftrennungsmuster.
%
\begin{figure}[htb]
\centering
@ -30,8 +27,8 @@ Auftrennungsmuster.
\end{subfigure}
\caption[Agarosegel zur Reinigung von Vektor und dem Insert]{Exemplarischer Ausschnitt aus dem Agarosegel zur Reinigung von
linearisiertem Vektor (a) und dem Insert (b) zur SLIC-Klonierung.
Aufgetragen wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard und
je \SI{20}{\micro\liter} Probe. Die erwarteten Größen sind \SI{5720}{\bp} (Vektor)
Aufgetragen wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard (M) und
je \SI{20}{\micro\liter} Probe (V bzw. I). Die erwarteten Größen sind \SI{5720}{\bp} (Vektor)
und \SI{2691}{\bp} (Insert).}
\label{abb:agarosegel_vektor_insert}
\end{figure}
@ -45,7 +42,7 @@ das korrekte Insert trägt. Das enstsprechende Gelbild ist in Abbildung \ref{abb
\centering
\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/colony_pcr.png}
% colony_pcr.png: 1586x1474 pixel, 300dpi, 13.43x12.48 cm, bb=0 0 381 354
\caption[Agarosegel nach Kolonie-PCR]{Agarosegel nach Kolonie-PCR. Es wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard und je \SI{20}{\micro\liter} Probe aufgetragen.
\caption[Agarosegel nach Kolonie-PCR]{Agarosegel nach Kolonie-PCR. Es wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard (M) und je \SI{20}{\micro\liter} Probe aufgetragen.
Untersucht wurden 24 Klone, von denen fünf (10, 13, 22, 23 und 24) ein Plasmid mit der korrekten Größe tragen.}
\label{abb:kolonie_pcr}
\end{figure}
@ -58,7 +55,7 @@ aufgeführt.
%
\begin{figure}[htb]
\centering
\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/pETEV-16b-ppdk.pdf}
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/pETEV-16b-ppdk.pdf}
% pETEV-16b-ppdk.pdf: 611x480 pixel, 72dpi, 21.55x16.93 cm, bb=0 0 611 480
\caption[Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk]{Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk. Der für die \acs{PPDK} kodierende Bereich liegt zwischen Position 5392 und 8022.
\textit{Upstream} befinden sich die kodierenden Sequenzen für die \acs{TEV}-Schnittstelle und den Hexa-Histidin-Tag. Die Plasmidkarte wurde mit
@ -66,6 +63,7 @@ aufgeführt.
\label{abb:plasmidkarte}
\end{figure}
\clearpage
\section{Expressionsstudien}
\label{sec:Expressionsstudien}
Die Expressionsstudien (vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) zeigten eine deutliche Überexpression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} BL21 (DE3) bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius} und
@ -84,9 +82,9 @@ gleichzeitig geringerer IPTG-Konzentration. Eine Expression über Nacht führte
\label{abb:expressionsstudie}
\end{figure}
%
\begin{figure}[htb]
\begin{figure}[H]
\centering
\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
\begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
\centering
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_klein.png}
% Expressionsstudie_19042012_klein.png: 2480x2894 pixel, 241dpi, 26.13x30.49 cm, bb=0 0 741 864
@ -96,7 +94,7 @@ gleichzeitig geringerer IPTG-Konzentration. Eine Expression über Nacht führte
%
~
%
\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
\begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
\centering
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_klein_blot.png}
% Expressionsstudie_19042012_klein_blot.png: 2480x2894 pixel, 241dpi, 26.13x30.49 cm, bb=0 0 741 864
@ -108,6 +106,7 @@ gleichzeitig geringerer IPTG-Konzentration. Eine Expression über Nacht führte
Expressionsergebnis in BL21 (DE3) bzw. BL21 Gold (DE3). Die Induktion erfolgte mit \SI{0,1}{\milli\Molar} bzw. \SI{1}{\milli\Molar} IPTG.}
\label{abb:expressionsstudie_klein}
\end{figure}
\clearpage
\section{Differentielle Zentrifugation}
\label{sec:ergebnisse_dz}
@ -117,9 +116,9 @@ und einer differentiellen Zentrifugation unterzogen (vgl. \ref{sec:differentiell
(Abbildung \ref{abb:dz}). Hierbei zeigte sich, dass der überwiegende Anteil der \acs{PPDK} in den Überstandsfraktionen lokalisiert und somit löslich ist.
Nur ein geringer Anteil befindet sich in den Pellets nach der Zentrifugation.
\begin{figure}[htb]
\begin{figure}[H]
\centering
\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
\begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
\centering
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/03052012_4h_2min.png}
% 03052012_4h_2min.png: 2480x2254 pixel, 300dpi, 21.00x19.08 cm, bb=0 0 595 541
@ -129,7 +128,7 @@ Nur ein geringer Anteil befindet sich in den Pellets nach der Zentrifugation.
%
~
%
\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
\begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
\centering
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/03052012_üN_2min.png}
% 03052012_üN_2min.png: 2480x2141 pixel, 300dpi, 21.00x18.13 cm, bb=0 0 595 514
@ -141,27 +140,24 @@ Nur ein geringer Anteil befindet sich in den Pellets nach der Zentrifugation.
Zentrifugationsschritte (jeweils \SI{10}{\micro\liter}).}
\label{abb:dz}
\end{figure}
\clearpage
\section{Native Reinigung der \acs{PPDK}}
\label{sec:ergebnisse_reinigung}
Die Reinigung der \acs{PPDK} erfolgte wie in \ref{sec:affinitaetschromatographie} beschrieben. Im Verlauf der Reinigung konnten vier Proteinfraktionen bei Elution
mit \SIlist{50;150;200;250}{\milli\Molar} Imidazol identifiziert werden (vgl. Abbildung \ref{abb:chromatogramm_aff}). In einer nachfolgend durchgeführten
\acs{SDS}-\acs{PAGE} mit Westernblot zeigte sich, dass drei Fraktionen (\SIlist{150;200;250}{\milli\Molar}) \acs{PPDK} in hoher Reinheit enthielten.
\acs{SDS}-\acs{PAGE} mit Westernblot zeigte sich, dass drei Fraktionen (\SIlist{150;200;250}{\milli\Molar}) \acs{PPDK} in hoher Reinheit enthielten (Abbildung \ref{abb:reinigung_sds}).
%
\begin{figure}[htb]
\begin{figure}[H]
\centering
\includegraphics[width=0.9\textwidth,keepaspectratio=true]{img/ergebnisse/aekta/20062012.eps}
\caption[Chromatogramm der \acs{PPDK}-Reinigung mittels \acs{IMAC}]{Chromatogramm der \acs{PPDK}-Reinigung mittels \acs{IMAC}. Dargestellt sind die Absorption bei
\SI{280}{\nano\meter} (blau) und die Imidazolkonzentration (rot). Die gesammelten \acs{PPDK}-Fraktionen sind durch Pfeile markiert.}
\SI{280}{\nano\meter} (schwarz) und die Imidazolkonzentration (rot). Die gesammelten \acs{PPDK}-Fraktionen sind durch Pfeile markiert.}
\label{abb:chromatogramm_aff}
\end{figure}
%
Die gesammelte PPDK-Fraktionen bei Elution mit \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol ließ sich bis auf \SI{37,54(134)}{\milli\gram\per\milli\liter} konzentrieren.
In der Expression konnten aus \SI{2}{\liter} Kultur \SI{20}{\gram} Zellen geerntet werden. Da im Zuge der Reinigung \SI{4}{\gram} Zellen aufgeschlossen wurden, ergibt sich eine Ausbeute von etwa
\SI{47}{\milli\gram\per\liter}~Kultur (vgl. Tabelle \ref{tab:ausbeute}).
%
\begin{table}[htb]
\begin{table}[H]
\centering
\caption[\acs{PPDK}-Konzentration und Ausbeute nach Reinigung]{\acs{PPDK}-Konzentration und Ausbeute nach Reinigung. Die Konzentrationen beziehen sich auf den erreichten
Wert nach Einengen der fraglichen Fraktionen auf ein Volumen von \SI{500}{\micro\liter}.}
@ -177,9 +173,13 @@ Wert nach Einengen der fraglichen Fraktionen auf ein Volumen von \SI{500}{\micro
\end{tabular}
\end{table}
%
\begin{figure}[htb]
Die gesammelte PPDK-Fraktionen bei Elution mit \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol ließ sich bis auf \SI[seperr]{37,54(134)}{\milli\gram\per\milli\liter} konzentrieren.
In der Expression konnten aus \SI{2}{\liter} Kultur \SI{20}{\gram} Zellen geerntet werden. Da im Zuge der Reinigung \SI{4}{\gram} Zellen aufgeschlossen wurden, ergibt sich eine Ausbeute von etwa
\SI{47}{\milli\gram\per\liter}~Kultur (vgl. Tabelle \ref{tab:ausbeute}).
\begin{figure}[H]
\centering
\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
\begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
\centering
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Reinigung_02072012.png}
% Reinigung_02072012.png: 2480x2338 pixel, 300dpi, 21.00x19.80 cm, bb=0 0 595 561
@ -189,7 +189,7 @@ Wert nach Einengen der fraglichen Fraktionen auf ein Volumen von \SI{500}{\micro
%
~
%
\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
\begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
\centering
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Reinigung_02072012_blot.png}
% Reinigung_02072012.png: 2480x2338 pixel, 300dpi, 21.00x19.80 cm, bb=0 0 595 561
@ -198,44 +198,43 @@ Wert nach Einengen der fraglichen Fraktionen auf ein Volumen von \SI{500}{\micro
\end{subfigure}
\caption[\acs{SDS}-\acs{PAGE} und Westernblot der nativen Reinigung]{\acs{SDS}-\acs{PAGE} (a) und Westernblot (b) der nativen Reinigung. Aufgetragen wurden \SI{3}{\micro\liter} Marker (M), \SI{1}{\micro\liter}
der Proben des Zelllysates (A), sowie der Zentrifugationen bei \SI{10000}{\xg} (10kÜ) bzw \SI{100000}{\xg} und \SI{10}{\micro\liter} des Durchflusses (D) und nachfolgenden Elutionsfraktionen.
Die \acs{PPDK}-Banden sind rot hervorgehoben (MW: \SI{98}{\kilo\dalton})}
Die \acs{PPDK}-Banden sind rot hervorgehoben (MW: \SI{98}{\kilo\dalton}). Beim Westernblot wurden Anti"=His"=HRP"=Antikörper in einer Verdünnung von 1:10000 verwendet.}
\label{abb:reinigung_sds}
\end{figure}
%
\begin{figure}[H]
\centering
\includegraphics[width=0.87\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/aekta/11072012.eps}
% 11072012.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=5 4 461 375
\caption[Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie]{Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie. Die Kurvenverläufe wurden auf die jeweilige Konzentration normalisiert. Fraktion 3 zeigt ein monodisperses Profil,
während die \acs{PPDK} in den Fraktionen 1 und 2 in verschiedenen Oligomerisierungszuständen vorliegt. Vertikale Linien markieren die Position der \textit{Peaks}. Es wurde eine Superdex 200 5/150 GL"=Säule mit einem Volumen von \SI{3}{\milli\liter} eingesetzt.}
\label{abb:chromatogramm_gefi}
\end{figure}
%
Zur Bestimmung der Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} wurden Proben aller drei Fraktionen mittels einer Größenausschlusschromatographie (vgl. \ref{sec:groessenausschluss}) analysiert.
Hierbei zeigte sich, dass lediglich die mit \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol eluierte Fraktion monodispers ist, während die mit \SIlist{150;200}{\milli\Molar} eluierten
\acs{PPDK}-Fraktionen einen diversen Oligomerisierungsgrad aufwiesen (vgl. Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}).
\begin{figure}[htb]
\centering
\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/aekta/11072012.eps}
% 11072012.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=5 4 461 375
\caption[Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie]{Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie. Die Kurvenverläufe wurden auf die jeweilige Konzentration normalisiert. Fraktion 3 zeigt ein monodisperses Profil,
während die \acs{PPDK} in den Fraktionen 1 und 2 in verschiedenen Oligomerisierungszuständen vorliegt. Vertikale Linien markieren die Position der \textit{Peaks}.}
\label{abb:chromatogramm_gefi}
\end{figure}
\clearpage
\acs{PPDK}-Fraktionen in multiplen Oligomerisierungsgraden vorlagen (vgl. Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}). Da einige der eingesetzten Eichproteine im verwendeten Puffer nicht stabil waren, konnte eine zuverlässige Größenzuordnung nicht vorgenommen werden. Somit können lediglich die \acs{PPDK}-Eluate untereinander verglichen werden. Deutlich zu erkennen sind aber insgesamt drei distinkte \textit{Peaks} bei einem Elutionsvolumen von \SIlist{1,28;1,68;1,97}{\milli\liter}. Das Ausschlussvolumen der Säule beträgt \SI{1,2}{\milli\liter}.
\section{\acs{CD}-Spektroskopie}
\label{sec:ergebnisse_cd}
Das \acs{CD}-Spektrum wurde wie in \ref{sec:cd_spektroskopie} beschrieben aufgenommen. Abbildung \ref{abb:cd_spektrum} zeigt das Spektrum nach Abzug des Pufferspektrums. Deutlich zu erkennen ist
Das \acs{CD}-Spektrum wurde wie in \ref{sec:cd_spektroskopie} beschrieben aufgenommen. Abbildung \ref{abb:cd_spektrum} zeigt das Spektrum nach Pufferkorrektur. Deutlich zu erkennen ist
ein negativer Cotton-Effekt im Bereich um \SI{210}{\nano\meter}, welcher auf \textalpha-helikale Strukturen hindeutet.
Anhand des experimentellen Spektrums wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit den Programmen SELCON3 \citep{Sreerama1993}, CONTINLL \citep{Provencher1981}, CDSSTR \citep{Johnson1999} und K2D3 \citep{Louis-Jeune2011} durchgeführt.
Die daraus resultierenden, vorhergesagten Spektren sind ebenfalls in Abbildung \ref{abb:cd_spektrum} dargestellt. Alle verwendeten Algorithmen sagen das Spektrum qualitativ
korrekt vorher, die geringsten Abweichungen vom experimentellen Spektrum ergeben sich für CONTINLL und CDSSTR. Für die \acs{PPDK} werden in allen Fällen hohe \textalpha"=helikale
Strukturanteile vorhergesagt, im Fall von CONTINLL jedoch nur ein sehr geringer Anteil an \textbeta"=Strands (vgl. Tabelle \ref{tab:cd}). Die \textit{ab initio} Vorhersage mit SOPMA,
sowie die Ergebnisse von K2D3 und CDSSTR sind weitestgehend deckungsgleich mit den Strukturanteilen der PPDK aus \textit{Zea mays} (Tabelle \ref{tab:cd}).
\begin{figure}[htb]
%
\begin{figure}[H]
\centering
\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd/cd.eps}
\includegraphics[width=0.9\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd/cd.eps}
% cd.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=2 4 468 375
\caption[\acs{CD}-Spektrum von gereinigter PPDK]{\acs{CD}-Spektrum von gereinigter PPDK. Die \acs{PPDK} lag in einer Konzentration von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter} in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat"=Puffer mit
\SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat vor. Es wurden 15 Spektren mit einer Auflösung von \SI{1}{\nano\meter} akkumuliert. Im Bereich um \SI{210}{\nano\meter} zeigt sich ein negativer
Cotton-Effekt, welcher charakteristisch für \textalpha-helikale Strukturanteile ist. Farbig dargestellt sind die mit unterschiedlichen Programmen vorhergesagten Spektren.}
\label{abb:cd_spektrum}
\end{figure}
\begin{table}[htb]
%
\clearpage
Die daraus resultierenden, vorhergesagten Spektren sind ebenfalls in Abbildung \ref{abb:cd_spektrum} dargestellt. Alle verwendeten Algorithmen sagen das Spektrum qualitativ korrekt vorher, die geringsten Abweichungen vom experimentellen Spektrum ergeben sich für CONTINLL und CDSSTR, wobei ersteres allerdings die geringste Übereinstimmung mit den Sekundärstrukturanteilen aus der \textit{ab initio} Vorhersage und den Strukturdaten aus \textit{Zea mays} zeigt. Für die \acs{PPDK} werden in allen Fällen hohe \textalpha"=helikale Strukturanteile vorhergesagt, im Fall von CONTINLL jedoch nur ein sehr geringer Anteil an \textbeta"=Strands (vgl. Tabelle \ref{tab:cd}). Die \textit{ab initio} Vorhersage mit SOPMA, sowie die Ergebnisse von K2D3 und CDSSTR sind weitestgehend deckungsgleich mit den Strukturanteilen der PPDK aus \textit{Zea mays} (Tabelle \ref{tab:cd}).
%
\begin{table}[H]
\caption[Vorhersage der Sekundärstrukturanteile]{Vorhersage der Sekundärstrukturanteile. Aufgeführt sind die vorhergesagten Strukturelemente anhand des \acs{CD}-Spektrums. Zum Vergleich dienen die Ergebnisse der sequenzbasierten \textit{ab initio} Vorhersage (SOPMA),
sowie die Sekundärstrukturanteile aus der Kristallstruktur der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBG).}
\label{tab:cd}
@ -254,12 +253,38 @@ sowie die Ergebnisse von K2D3 und CDSSTR sind weitestgehend deckungsgleich mit d
\bottomrule
\end{tabular}
\end{table}
\clearpage
\section{Aktivitätsassay}
\section{Aktivitätstest}
\label{sec:ergebnisse_aktivitaetsassay}
Um die Aktivität der gereinigten PPDK zu quantifizieren, wurden zunächst die beiden Fraktionen mit der höchsten \acs{PPDK}-Konzentration -- Fraktion 2 und
Fraktion 3 (\SIlist{200;250}{\milli\Molar} Imidazol) -- untersucht (vgl. \ref{sec:aktivitaetsassay}). Hierbei zeigte sich im Vergleich zur Negativkontrolle,
dass in beiden Fraktionen eine Aktivität zu verzeichnen ist (siehe Abbildung \ref{abb:aktivitaet}). Da hinsichtlich zukünftiger Kristallisationsexperimente
Um die Aktivität der gereinigten PPDK zu quantifizieren, wurden zunächst die beiden Fraktionen mit der höchsten \acs{PPDK}-Konzentration -- Fraktion~2 und Fraktion~3 (\SIlist{200;250}{\milli\Molar} Imidazol) -- untersucht (vgl. \ref{sec:aktivitaetsassay}). Hierbei zeigte sich im Vergleich zur Negativkontrolle,
dass in beiden Fraktionen eine Aktivität zu verzeichnen ist (siehe Tabelle \ref{tab:aktivitaet}).
\begin{table}[H]
\centering
\caption[Aktivität der gereinigten PPDK-Fraktionen]{Aktivität der gereinigten PPDK-Fraktionen 2 und 3. Die Absorption bei \SI{340}{\nano\meter} wurde über einen Zeitraum von \SI{80}{\second} in Dreifachbestimmung aufgenommen. Anschließend wurde eine Tangente an die Messpunkte gelegt um die Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen. Der Vergleich der Negativkontrolle mit den beiden vermessenen Fraktionen zeigt eine deutliche Aktivität.}
\label{tab:aktivitaet}
\begin{tabular}{cS[seperr,table-format = 1.4(2)]S[seperr,table-format = 1.2(2)]}
\toprule
\textbf{Fraktion} & \textbf{Aktivität [\si{\micro\mole\per\minute}]} &\textbf{spez. Aktivität [\si{\Unit\per\milli\gram}]}\\
\midrule
Negativkontrolle & 0,0005(1) & \\
2 (\SI{200}{\milli\Molar} Imidazol) & 0,065(24) & 0,31(12) \\
3 (\SI{250}{\milli\Molar} Imidazol) & 0,037(6) & 0,99(9) \\
\bottomrule
\end{tabular}
\end{table}
% \begin{figure}[H]
% \centering
% \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/aktivitaet.eps}
% % aktivitaet.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=6 4 466 375
% \caption[Aktivität der gereinigten PPDK]{Aktivität der gereinigten PPDK. Die Absorption bei \SI{340}{\nano\meter} wurde über einen Zeitraum von \SI{80}{\second}
% aufgenommen und auf die jeweilige PPDK-Konzentration, sowie das absolute Absorptionsmaximum normiert. Die Kontrolle enthielt anstelle der PPDK ein identisches
% Volumen Puffer. Die beiden PPDK-Fraktionen weisen eine deutliche Absorptionsabnahme auf, während die Absorption der Kontrolle nahezu unverändert bleibt.}
% \label{abb:aktivitaet}
% \end{figure}
Da hinsichtlich zukünftiger Kristallisationsexperimente
in erster Linie die monodispers vorliegende Fraktion 3 von Interesse ist, wurde von dieser Fraktion eine vollständige Reaktionskinetik aufgenommen. Hierbei ergaben
sich durch Anpassen einer Sättigungsfunktion durch nichtlineare Regression an die Michaelis"=Menten"=Gleichung \eqref{eq:mm} für \acs{ATP} und Pyruvat ein \ce{K_M} von
\SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} bzw. \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar}, sowie ein \ce{V_{max}} von \SI[seperr]{0,095(5)}{\milli\Molar\per\minute} (ATP)
@ -269,7 +294,15 @@ sich durch Anpassen einer Sättigungsfunktion durch nichtlineare Regression an d
\label{eq:mm}
v &= \frac{V_\text{max} \cdot [S]}{K_m + [S]}
\end{align}
%
\begin{figure}[H]
\centering
\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/kinetik_combined.eps}
\caption[Reaktionskinetik der \acs{PPDK}]{Reaktionskinetik der \acs{PPDK} mit \acs{ATP} (A) und Pyruvat (B) als Substrat. Der inhibierende Effekt von \acs{ATP} auf die im gekoppelten Enzymassay eingesetzte \acs{MDH} ist in (A) ersichtlich. Die Ordinatenachse ist der besseren Übersichtlichkeit wegen logarithmisch skaliert.}
\label{abb:kinetik}
\end{figure}
%
\begin{samepage}
Die Wechselzahl \ce{k_{cat}} wurde anhand von Gleichung \eqref{eq:kcat} aus \ce{V_{max}} und der PPDK-Konzentration von \SI[seperr]{0,38(2)}{\milli\Molar} mit
\SI[seperr]{1,63(9)}{\per\second} bestimmt. Die spezifische Aktivität der \acs{PPDK} beträgt \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram} und konnte ebenfalls unter Berücksichtigung der
Proteinkonzentration mittels Gleichung \ref{eq:spez_akt} berechnet werden.
@ -278,13 +311,13 @@ Proteinkonzentration mittels Gleichung \ref{eq:spez_akt} berechnet werden.
\label{eq:kcat}
k_\text{cat} &= \frac{V_\text{max}}{[E_0]}
\end{align}
\end{samepage}
Die katalytische Effizient {\ce{k_{cat}}/\ce{K_M}} beträgt \SI[seperr]{32,60(936)}{\milli\Molar\second} (ATP) bzw.
\SI[seperr]{6,04(154)}{\milli\Molar\second} (Pyruvat). Eine Auflistung der kinetischen Parameter ist in Tabelle \ref{tab:kinetische_parameter} zu finden.
Die katalytische Effizienz {\ce{k_{cat}}/\ce{K_M}} beträgt \SI[seperr]{32,60(936)}{\per\second\per\milli\Molar} (ATP) bzw.\\ \SI[seperr]{6,04(154)}{\per\second\per\milli\Molar} (Pyruvat). Eine Auflistung der kinetischen Parameter ist in Tabelle \ref{tab:kinetische_parameter} zu finden.
%
\begin{align}
\label{eq:spez_akt}
\text{spez. Aktivität \si{\Unit\per\milli\gram}} &= \frac{V_\text{max}~[\si{\micro\Molar\per\minute}] \cdot V(\text{Ansatz})~[\si{\liter}]}{m(\text{Protein})~[\si{\milli\gram}]}
\text{spez. Aktivität [\si{\Unit\per\milli\gram}]} &= \frac{V_\text{max}~[\si{\micro\Molar\per\minute}] \cdot V(\text{Ansatz})~[\si{\liter}]}{m(\text{Protein})~[\si{\milli\gram}]}
\end{align}
\begin{table}[htb]
@ -301,80 +334,51 @@ Die katalytische Effizient {\ce{k_{cat}}/\ce{K_M}} beträgt \SI[seperr]{32,60(93
\ce{K_m} (ATP) & 50(9) & \micro\Molar \\
\ce{K_m} (Pyruvat) & 270(44) & \micro\Molar \\
\midrule
\ce{k_{cat}}/\ce{K_M} (ATP) & 32,60(936)& \milli\Molar\second \\
\ce{k_{cat}}/\ce{K_M} (Pyruvat) & 6,04(154) & \milli\Molar\second \\
\ce{k_{cat}}/\ce{K_M} (ATP) & 32,60(936)& \per\second\per\milli\Molar \\
\ce{k_{cat}}/\ce{K_M} (Pyruvat) & 6,04(154) & \per\second\per\milli\Molar \\
\midrule
spez. Aktivität & 0,99(9) & \Unit\per\milli\gram \\
\bottomrule
\end{tabular}
\end{table}
\begin{figure}[htb]
\centering
\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/aktivitaet.eps}
% aktivitaet.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=6 4 466 375
\caption[Aktivität der gereinigten PPDK]{Aktivität der gereinigten PPDK. Die Absorption bei \SI{340}{\nano\meter} wurde über einen Zeitraum von \SI{80}{\second}
aufgenommen und auf die jeweilige PPDK-Konzentration, sowie das absolute Absorptionsmaximum normiert. Die Kontrolle enthielt anstelle der PPDK ein identisches
Volumen Puffer. Die beiden PPDK-Fraktionen weisen eine deutliche Absorptionsabnahme auf, während die Absorption der Kontrolle nahezu unverändert bleibt.}
\label{abb:aktivitaet}
\end{figure}
\begin{figure}[htb]
\centering
\begin{subfigure}[b]{0.45\textwidth}
\centering
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/atp.eps}
% atp.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=2 4 467 375
\caption{}
\label{abb:kinetik_atp}
\end{subfigure}
%
~
%
\begin{subfigure}[b]{0.45\textwidth}
\centering
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/pyruvat.eps}
% pyruvat.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=2 3 467 375
\caption{}
\label{abb:kinetik_pyruvat}
\end{subfigure}
\caption[Reaktionskinetik der \acs{PPDK}]{Reaktionskinetik der \acs{PPDK} mit \acs{ATP} (a) und Pyruvat (b) als Substrat. Der inhibierende Effekt von \acs{ATP} auf
die im gekoppelten Enzymassay eingesetzte \acs{MDH} ist in (a) ersichtlich. Die Ordinatenachse ist der besseren Übersichtlichkeit wegen logarithmisch skaliert.}
\label{abb:kinetik}
\end{figure}
\clearpage
\section{Homologiemodelle}
\label{sec:ergebnisse_homologemodell}
Die erzeugten Homologiemodelle (vgl. \ref{sec:erstellung_homologiemodell}) der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} zeigen eine gute Übereinstimmung mit
den zu Grunde liegenden Templat-Strukturen: \SI{0,708}{\angstrom} für das auf der Struktur aus \acs{C. symbiosum} und \SI{0,705}{\angstrom} für das auf der Struktur aus
\textit{Zea mays} basierende Modell. Die Sequenzidentität zur zwischen \acs{F. trinervia} und \textit{Zea mays} beträgt \SI{79}{\percent}, zwischen \acs{F. trinervia} und
\acs{C. symbiosum} \SI{55}{\percent}. Das jeweils beste Modell wurde anhand des zDOPE Wertes, sowie der Ergebnisse der PROCHECK-Analyse ausgewählt. Im Ramachandran-Plot
zeigt keines der beiden ausgewählten Modelle eine Kombination von ψ- und φ-Winkel, die nicht in einem der erlaubten Bereiche liegt (vgl. Abbildungen \ref{abb:ramachandran_Zm}
Die erzeugten Homologiemodelle (vgl. \ref{sec:erstellung_homologiemodell}) der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} zeigen eine gute Übereinstimmung mit den zu Grunde liegenden Templat-Strukturen: Es ergab sich ein \acs{RMSD} von \SI{0,708}{\angstrom} für das auf der Struktur aus \acs{C. symbiosum} und \SI{0,705}{\angstrom} für das auf der Struktur aus \textit{Zea mays} basierende Modell. Die Sequenzidentität zur zwischen \acs{F. trinervia} und \textit{Zea mays} beträgt \SI{79}{\percent}, zwischen \acs{F. trinervia} und \acs{C. symbiosum} \SI{55}{\percent}. Das jeweils beste Modell wurde anhand des zDOPE Wertes \citep{Shen2006,Pieper2011}, sowie der Ergebnisse der PROCHECK-Analyse ausgewählt. Der \ac{DOPE} Wert stellt ein statistisch ermitteltes Potential dar, welches die paarweisen atomaren Abstände innerhalb eines Modells im Vergleich zu einer definierten Menge bekannter Proteinstrukturen beurteilt.
In der normalisierten Variante (zDOPE) stehen Werte gleich oder kleiner als -1,0 für ein sehr exaktes Modell, bei dem sich mehr als \SI{80}{\percent} der \ce{C_α}"=Atome innerhalb eines Abstands von \SI{3,5}{\angstrom} zu ihrer korrekten Position befinden \citep{Lasker2012}. Der zDOPE für das auf \textit{Zea mays} basierende Modell beträgt -0,92803, für das auf \acs{C. symbiosum} basierende Modell -0,92815. Da das Templat Strukturen aufweisen kann, welche nicht in der verwendeten Vergleichsmenge bekannter Strukturen vorhanden ist, kann der zDOPE-Wert hierdurch fälschlich erhöht werden. Daher können die DOPE-Werte je Aminosäurerest für das Templat und das Homologiemodell verglichen werden. Eine vergleichende Darstellung der DOPE-Profile der im Rahmen dieser Arbeit generierten Modelle findet sich in Abbildung \ref{abb:dope}. Die Profile weisen einen qualitativ ähnlichen Verlauf auf, was für die Korrektheit der erstellen Modelle spricht. Allerdings zeigt sich in beiden Fällen ein zunehmender Versatz der Kurvenverläufe, was auf eine Verschiebung des Alignments in den entsprechenden Sequenzabschnitten hindeuten kann.
%
\begin{figure}[H]
\centering
\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/DOPE_combined.eps}
\caption[\acs{DOPE}-Profile der Homologiemodelle und ihrer Template]{\acs{DOPE}-Profile der von \textit{Zea mays} (A) bzw \acs{C. symbiosum} (B) abgeleiteten Homologiemodelle und ihrer Template je Position im Alignment. Der Verlauf ist in beiden Fällen für das Modell und das Templat ähnlich, was auf eine gute Qualität der Homologiemodelle schließen lässt. Allerdings zeigen sich Verschiebungen der Profile um einige Reste, was auf einen Versatz des Alignments hindeuten kann.}
\label{abb:dope}
\end{figure}
%
Im Ramachandran-Plot zeigt keines der beiden ausgewählten Modelle eine Kombination von ψ- und φ-Winkel, die nicht in einem der erlaubten Bereiche liegt (vgl. Abbildungen \ref{abb:ramachandran_Zm}
und \ref{abb:ramachandran_Cs}).
Anhand der Modelle wurde eine Visualisierung des \textit{Domain-Swiveling} Mechanismus für die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} (Abbildung \ref{abb:overlay_homologiemodell}), sowie
der \acs{PEP}-Bindestelle (Abbildung \ref{abb:substratbindetasche}) erstellt. Es zeigt sich eine deutliche Torsion der zentralen Phospo-Histidindomäne und des katalytischen
His458.
der \acs{PEP}-Bindestelle (Abbildung \ref{abb:substratbindetasche}) erstellt. Es zeigt sich eine deutliche Torsion der zentralen Phospo-Histidindomäne und des katalytischen His458.
%
\begin{figure}[htb]
\centering
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/swiveling_domain2.png}
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/swiveling_domain3.png}
% swiveling_domain2.png: 2480x976 pixel, 119dpi, 53.13x20.91 cm, bb=0 0 1506 593
\caption[Homologiemodelle der \acs{PPDK}]{Homologiemodelle der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}. (A) zeigt die \acs{PEP} gebundene Konformation basierend auf der Struktur aus
\textit{Zea mays}, (B) das auf \acs{C. symbiosum} basierende Modell. Beide Modelle stellen die jeweiligen Extremkonformationen des \textit{Swiveling-domain} Mechanismus dar. Das
an der Übertragung der Phosphatgruppe beteiligte His458 ist als Stabmodell rot eingefärbt und durch einen schwarzen Pfeil markiert. Die einzelnen Domänen der \acs{PPDK} sind ebenfalls
farblich hervorgehoben: Nukleotidbindedomäne (grün), Pyruvat/PEP-Bindedomäne (blau), Phosphohistidin-Domäne (gelb), Linker-Peptide (magenta und rot).}
\caption[Homologiemodelle der \acs{PPDK}]{Homologiemodelle der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}. Es zeigt die \acs{PEP} gebundene Konformation basierend auf der Struktur aus
\textit{Zea mays}, sowie das auf \acs{C. symbiosum} basierende Modell (transparent, grau). Beide Modelle stellen die jeweiligen Extremkonformationen des \textit{Swiveling-domain} Mechanismus dar. Das
an der Übertragung der Phosphatgruppe beteiligte His458 ist als Stabmodell rot eingefärbt und durch einen Stern markiert. Die einzelnen Domänen der \acs{PPDK} sind farblich hervorgehoben: Nukleotidbindedomäne (grün), Pyruvat/PEP-Bindedomäne (blau), Phosphohistidin-Domäne (gelb), Linker-Peptide (magenta und rot).}
\label{abb:overlay_homologiemodell}
\end{figure}
In der Darstellung der modellierten Substratbindestelle sind die für die Koordination von \acs{PEP} wichtigen Reste Arg562, Arg619, Arg669, Glu748, Asp772 und
Asn771 sichtbar. Ebenfalls erkennbar ist das als Protonen-Donor fungierende Cys834. Die genannten Reste befinden sich in hoch konservierten Bereichen (siehe Abbildung \ref{abb:ma}).
Asn771 sichtbar. Ebenfalls erkennbar ist das Cys834, welches als Protonendonor/"=akzeptor zusammen mit Ser767 an der Enolisierung des Pyruvats beteiligt ist \citep{Yankie1995}. Die genannten Reste befinden sich in hoch konservierten Bereichen (Abbildung \ref{abb:ma}).
%
\begin{figure}[htb]
\centering
\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/substratbindung.png}
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/substratbindung.png}
% substratbindung.png: 2480x1681 pixel, 90dpi, 70.00x47.45 cm, bb=0 0 1984 1345
\caption[Substratbindetasche für \acs{PEP}]{Substratbindetasche für \acs{PEP}. Die Ansicht zeigt die Bindestelle für \acs{PEP} im
Homologiemodell der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}. Seitenketten in räumlicher Nähe zum Substrat sind als Linienmodell dargestellt und benannt. Die

98
inc/material.tex
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@ -61,7 +61,7 @@
Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
\ac{CBB} & 6104-58-1 & \\
\ac{CBB} & 6104-58-1 & Serva, Heidelberg\\
Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
@ -72,7 +72,7 @@
\acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\
Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\
Magnesiumsulfat-Heptahydrat & 10034-99-8 & \\
Magnesiumsulfat-Heptahydrat & 10034-99-8 & Sigma-Aldrich, München\\
Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\
Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\
Natriumhydrogencarbonat & 144-55-8 & VWR, Darmstadt\\
@ -324,7 +324,7 @@
\SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat
\end{description}
\subsection{Puffer für den Aktivitätsassay}
\subsection{Puffer für den Aktivitätstest}
\label{sec:puffer_aktivitaetsassay}
\begin{samepage}
\begin{description}
@ -349,7 +349,7 @@
\subsection{Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren}
\label{sec:konzentrationsbestimmung_nukleinsaeuren}
Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
Nukleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
\begin{align}
@ -406,7 +406,7 @@ nach Herstellerangaben.
\subsection{\acl{PCR}}
\label{sec:pcr}
Mit Hilfe der \ac{PCR} konnen Nukleinsäurefragmente gezielt
Mit Hilfe der \ac{PCR} können Nukleinsäurefragmente gezielt
vervielfältigt werden. Die Spezifität der Reaktion ist hierbei durch die Auswahl der
eingesetzten Primer gegeben.
Eine PCR gliedert sich grundsätzlich in drei aufeinanderfolgende Phasen: Während
@ -421,10 +421,10 @@ vervielfacht werden.
\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
\label{sec:inserts_slic}
\begin{samepage}
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl.~\ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz. Diese
wurden so gewählt, dass jeweils \SI{30}{\bp} zum Zielvektor und \SI{20}{\bp} zum Zielgen homolog sind.
wurden so gewählt, dass jeweils \SI{30}{\bp} zum Zielvektor und \SI{20}{\bp} zum Zielgen homolog waren.
\begin{samepage}
\begin{description}
\item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\
\SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
@ -436,11 +436,7 @@ wurden so gewählt, dass jeweils \SI{30}{\bp} zum Zielvektor und \SI{20}{\bp} zu
\SI{50}[ad~]{\micro\liter} \acs{ddH2O}
\end{description}
\end{samepage}
Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
des zum \acs{PPDK}-kodierenden Bereich homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.
%
\begin{table}[hbt]
\centering
\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
@ -462,6 +458,11 @@ zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs
\end{tabular}
\label{tab:slic_cycler}
\end{table}
%
Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
des zum \acs{PPDK}-kodierenden Bereich homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.
\subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}}
\label{sec:kolonie_pcr}
@ -470,6 +471,7 @@ untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \acs{ddH2O} in einem \
vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht
und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \acs{2YT}-Medium verwendet.
%
\begin{samepage}
\begin{description}
\item[Kolonie-PCR-Ansatz] \hfill \\
\SI{1}{\micro\liter} T7-Pro-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
@ -479,6 +481,7 @@ und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \
\SI{0,25}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar})\\
\SI{25}[ad~]{\micro\liter} \acs{ddH2O}
\end{description}
\end{samepage}
%
Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt.
@ -566,7 +569,7 @@ Die optimalen Bedingungen zur heterologen Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. c
unterschiedliche Konzentrationen von \ac{IPTG} zur Induktion verwendet wurden. Es kamen hierbei die \acs{E. coli}"=Stämme BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3)
zum Einsatz.
Von den Agarplatten (vgl.~\ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
Von den Agarplatten (vgl.~\ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
\SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt.
Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
@ -581,7 +584,7 @@ wurden die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute}
Die heterologe Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} erfolgte mit den in den Expressionsstudien als besonders geeignet explorierten Bedingungen.
Als Expressionsstamm kam \acs{E. coli} BL21 (DE3) zum Einsatz.
Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{100}{\milli\liter} Volumen in unschikanierten \SI{250}{\milli\liter}-Kolben angesetzt. Die
Von den Agarplatten wurden Vorkulturen mit einem Volumen von \SI{100}{\milli\liter} in unschikanierten \SI{250}{\milli\liter}-Kolben angesetzt. Die
Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der
Hauptkulturen eingesetzt.
@ -596,7 +599,7 @@ in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für weitere Versuche bei \SI{-80}{\
\section{Präparative Methoden}
\label{sec:praeparative_methoden}
Aufgrund der Kältelabilität der \acs{PPDK}, welche bei der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} besonder ausgeprägt ist \citep{Burnell1990}, wurden alle
Aufgrund der Kältelabilität der \acs{PPDK} (vgl. \ref{sec:kaelte}), welche bei der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} besonder ausgeprägt ist \citep{Burnell1990}, wurden alle
Schritte des Zellaufschlusses und der Reinigung -- wenn nicht abweichend angegeben -- bei Raumtemperatur durchgeführt.
\subsection{Zellaufschluss}
@ -609,25 +612,24 @@ bei einem Druck von \SI{1,35}{\kilo\bar} und einer Temperatur von \SI{15}{\celsi
\label{sec:affinitaetschromatographie}
Proteine, die mit einem Poly-Histidin-Tag markiert sind, lassen sich über eine \acf{IMAC} aus
einem Proteingemisch isolieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden HisTrap$^\text{\textregistered}$ HP-Säulen mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter}
eingesetzt. Als Säulenmaterial dient quervernetzte Agarose an welche \acf{IDA} immobilisiert ist. \ce{Ni2+}-Ionen werden von \acs{IDA} dreifach koordinativ
komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion Poly-Histidin-markierter Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni2+}-Ionen zur
eingesetzt. Als Säulenmaterial dient quervernetzte Agarose an welche \acf{IDA} immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \acs{IDA} dreifach koordinativ
komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion Poly-Histidin-markierter Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur
Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über die Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu
Histidin in der Lage ist, dieses kompetitiv aus der Bindung mit \ce{Ni2+} zu verdrängen. Das nachfolgend beschriebene Reinigungsprotokoll wurde nach \citet{Nakanishi2003,Chastain1996}
Histidin in der Lage ist, dieses kompetitiv aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen. Das nachfolgend beschriebene Reinigungsprotokoll wurde nach \citet{Nakanishi2003,Chastain1996}
adaptiert.
Die wie in \ref{sec:zellaufschluss} beschrieben aufgeschlossenen Zellen wurden zunächst bei \SI{10000}{\xg} und \SI{15}{\celsius} für \SI{30}{\minute}
zentrifugiert um Zelltrümmer und \textit{Inclusion-Bodies} zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{100000}{\xg} und \SI{15}{\celsius}
ulrazentrifugiert um lediglich lösliche Proteine im Überstand zu halten und Membranfragmente zu präzipitieren.
Die mit \ce{Ni2+} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \acs{ddH2O} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende
\ce{Ni2+} von der Säule zu eluieren und die Bildung von amorphem Nickel bei der nachfolgenden Benutzung der Puffer mit reduzierend wirksamen \acs{DTT}
Die mit \ce{Ni^{2+}} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \acs{ddH2O} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende
\ce{Ni^{2+}} von der Säule zu eluieren und die Bildung von amorphem Nickel bei der nachfolgenden Benutzung der Puffer mit reduzierend wirksamen \acs{DTT}
zu minimieren.
Die Säule wurde mit Waschpuffer äquilibriert und das Zelllysat mit einer Flussrate von \SI{1,5}{\milli\liter\per\minute} auf die Säule geladen. Im Anschluss
Unspezifisch bindende Proteine wurde mit \SI{20}{\CV} Waschpuffer + \SI{50}{\milli\Molar} Imidazol von der Säule gelöst. Die Elution der \acs{PPDK} erfolgte dann mit je \SI{10}{\CV} Waschpuffer + \SI{150}{\milli\Molar}, \SI{200}{\milli\Molar} und \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Es wurden Fraktionen
Die Säule wurde mit Waschpuffer äquilibriert und das Zelllysat mit einer Flussrate von \SI{1,5}{\milli\liter\per\minute} auf die Säule geladen. Unspezifisch bindende Proteine wurden im Anschluss mit \SI{20}{\CV} Waschpuffer + \SI{50}{\milli\Molar} Imidazol von der Säule gelöst. Die Elution der \acs{PPDK} erfolgte dann mit je \SI{10}{\CV} Waschpuffer + \SI{150}{\milli\Molar}, \SI{200}{\milli\Molar} und \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Es wurden Fraktionen
mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} gesammelt und ggf. vereinigt. Zur Detektion der Proteinfraktionen wurde die Absorption bei \SI{280}{\nano\meter} verfolgt.
Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt und neu mit \ce{Ni2+} beladen.
Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt und neu mit \ce{Ni^{2+}} beladen.
\subsection{Konzentrierung von Proteinlösungen}
\label{sec:konzentrierung}
@ -658,13 +660,9 @@ Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v)
\subsection{Differentielle Zentrifugation}
\label{sec:differentielle_zentrifugation}
Nach dem Zellaufschluss (vgl.~\ref{sec:zellaufschluss}) wurde eine Probe von \SI{10}{\micro\liter} aus dem Homogenisat als Kontrolle entnommen.
Anschließend wurde das Homogenisat bei \SI{2000}{\xg} für \SI{15}{\minute} bei \SI{15}{\celsius} zentrifugiert. Das resultierende Pellet
wurde im gleichen Volumen Aufschlusspuffer unter Zusatz von \SI{0,1}{\percent} (w/v) \acs{SDS} bei Raumtemperatur und unter Rühren rückgelöst.
Nach dem Zellaufschluss (vgl.~\ref{sec:zellaufschluss}) wurde eine Probe von \SI{10}{\micro\liter} aus dem Zelllysat als Kontrolle entnommen. Anschließend wurde das Zelllysat bei \SI{2000}{\xg} für \SI{15}{\minute} bei \SI{15}{\celsius} zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde im gleichen Volumen Aufschlusspuffer unter Zusatz von \SI{0,1}{\percent} (w/v) \acs{SDS} bei Raumtemperatur und unter Rühren rückgelöst.
Es wurden jeweils vom Überstand, als auch vom resuspendierten Pellet weitere Proben von \SI{10}{\micro\liter} Volumen entnommen. Diese
wurden mit \SI{25}{\micro\liter} \acs{SDS}-Probenpuffer und \SI{65}{\micro\liter} \acs{ddH2O} versetzt. Alle weiteren Zentrifugationsschritte
erfolgten hierzu analog und sind in Tabelle \ref{tab:differentielle_zentrifugation} aufgeführt.
Sowohl vom Überstand, als auch vom resuspendierten Pellet wurden jeweils weitere Proben von \SI{10}{\micro\liter} Volumen entnommen. Diese wurden mit \SI{25}{\micro\liter} \acs{SDS}-Probenpuffer und \SI{65}{\micro\liter} \acs{ddH2O} versetzt. Alle weiteren Zentrifugationsschritte erfolgten hierzu analog und sind in Tabelle \ref{tab:differentielle_zentrifugation} aufgeführt.
%
\begin{table}[htb]
\centering
@ -699,7 +697,7 @@ Detektion erfolgte durch Absorptionsmessung bei \SI{280}{\nano\meter}. Eluiert w
\subsection{SDS-\acl{PAGE}}
\label{sec:sds_page}
Die Proteinproben wurden auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen und dort nach ihrer Masse aufgetrennt
\citep{Laemmli1970}. Durch die Zugabe von \ac{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einr negativen
\citep{Laemmli1970}. Durch die Zugabe von \ac{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einer negativen
Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Somit ist die Wanderungsgeschwindigkeit
im elektrischen Feld allein von der Proteinmasse abhängig. Vor dem Auftragen auf das Geld wurden alle Proben mit
4\texttimes-Probenpuffer versetzt. Expressionsproben wurden darüber hinaus für \SI{10}{\minute} auf \SI{95}{\celsius} erhitzt.
@ -743,7 +741,7 @@ Pipettierschema für drei kleine Gele (\SI{9}{\centi\meter}~\texttimes~\SI{10}{\
%
Um die Größenzuordnung der Proteinbanden zu gewährleisten, wurden die in \ref{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren} genannten
Standards eingesetzt. Bei kleinen Gelen wurde nach dem Beladen für \SI{1}{\hour} eine Stromstärke von \SI{35}{\milli\ampere} je Gel angelegt.
Größe Gele liefen über Nacht bei \SI{50}{\milli\ampere}.
Große Gele liefen über Nacht bei \SI{50}{\milli\ampere}.
\subsection{Kolloidale Coomassie-Färbung}
\label{sec:faerbung_coomassie}
@ -760,27 +758,27 @@ Waschen mit \acs{ddH2O} erreicht werden.
Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteine auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das
Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.
Bei Gelen, welche für einen Westernblot vorgesehen waren, kam ein gefärbter Proteingrößenstandard zum Einsatz. Das Gel wurde für etwa
\SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die benötigten Filterpapiere, sowie die Nitrozellulosemembran wurden ebenfalls kurz in
Transferpuffer getränkt.
Es wurde ein gefärbter Proteingrößenstandard bei Gelen verwendet, welche für einen Westernblot vorgesehen waren. Das Gel wurde für etwa
\SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die Nitrozellulosemembran und, sowie die Filterpapiere wurden ebemfalls
kurz mit Transferpuffer getränkt.
Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolgt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen
Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von
\SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.
Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in \acs{TBS} auf einem
Rotationsschüttler inkubiert. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute} an.
Rotationsschüttler inkubiert. Im Anschluss erfolgten zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute}.
Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-\acs{HRP}-Antikörper im Verhältnis 1:10000
enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten
zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper ließ sich über die gekoppelte
Meerrettich-Peroxidase (\acs{HRP}) mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. die \acs{HRP} oxidiert in Anwesenheit von
wiederum zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper konnte dann über die gekoppelte
Meerrettich-Peroxidase (\acs{HRP}) mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. Die \acs{HRP} oxidiert in Anwesenheit von
Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es zu einer Lichtemission kommt.
Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor
(LAS 4000 mini, Fujifilm) eingesetzt.
Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor (LAS 4000 mini, Fujifilm) eingesetzt.
%
\clearpage
%
\subsection{Konzentrationsbestimmung von Proteinen}
\label{sec:konzentrationsbestimmung_proteine}
Die Konzentration von Proteinen wurde nach \citet{Bradford1976} bestimmt. Hierzu wurde in einer Mikrotiterplatte \SI{50}{\micro\liter} einer
@ -808,13 +806,13 @@ empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{Greenfield2007}. Die Me
von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und
Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.
\subsection{Aktivitätsassay}
\subsection{Aktivitätstest}
\label{sec:aktivitaetsassay}
Um die Aktivität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmten, wurde ein Aktivitätsassay \citep{Salahas1990} durchgeführt. Hierbei wurde \ac{PEP}-Bildung
in einem gekoppelten Enzymassay über den \acs{NADH}"=Verbrauch verfolgt. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist in diesem Fall die Umsetzung
Um die Aktivität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmten, wurde ein Aktivitätstest \citep{Salahas1990} durchgeführt. Hierbei wurde die \ac{PEP}-Bildung
in einem gekoppelten Enzymtest über den \acs{NADH}"=Verbrauch verfolgt. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist in diesem Fall die Umsetzung
von Pyruvat, anorganischem Phosphat und \acs{ATP} zu \acl{PEP}, \acs{AMP} und Pyrophosphat \eqref{eq:aktivitaet_1}. Nachfolgend wird \acl{PEP} durch
die \acl{PEPCase} über eine \textbeta-Carboxylierung mit Hydrogencarbonat zu Oxalacetat umgesetzt \eqref{eq:aktivitaet_2}. Letzteres wird durch eine
NAD-abhängige Malatdehydrogenase zu Malat reduziert \eqref{eq:aktivitaet_3}.
NAD-abhängige Malatdehydrogenase zu Malat reduziert \eqref{eq:aktivitaet_3}. Die Reaktionsabfolge entspricht somit einem Teil des Reaktionszyklus zur \ce{CO2}"=Fixierung in \ce{C_4}"=Pflanzen (vgl. \ref{sec:c4_ppdk}).
%
\begin{align}
\cee{
@ -828,11 +826,11 @@ NAD-abhängige Malatdehydrogenase zu Malat reduziert \eqref{eq:aktivitaet_3}.
\end{align}
%
Der \acs{NADH}-Verbrauch kann photometrisch über die Abnahme der \acs{NADH}"=spezifischen Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} verfolgt werden. Da der
Verbrauch eines \acs{NADH}-Moleküls gleichbedeutend ist mit der Bildung eines \acl{PEP}-Moleküls durch die \acs{PPDK}, kann aus dem Verbrauch an
\acs{NADH} direkt auf die Bildungsrate von \acl{PEP} und somit auf die Aktivität der \acs{PPDK} geschlossen werden.
Verbrauch eines \acs{NADH}"=Moleküls gleichbedeutend ist mit der Bildung eines \ac{PEP}-Moleküls durch die \acs{PPDK}, kann aus dem Verbrauch an
\acs{NADH} direkt auf die Bildungsrate von \ac{PEP} und somit auf die Aktivität der \acs{PPDK} geschlossen werden.
Der Reaktionsansatz nach \citet{Salahas1990} (vgl.~\ref{sec:puffer_aktivitaetsassay}) wurde mit \SI{0,5}{\micro\liter} gereinigtem und entsalztem
\acs{PPDK}-Konzentrat versetzt. Die \acs{PPDK}-Lösung wurde zuvor für \SI{30}{\minute} bei \SI{30}{\celsius} inkubiert, um eine möglichst vollständige
Der Reaktionsansatz nach \citet{Salahas1990} wurde mit \SI{0,5}{\micro\liter} gereinigtem und entsalztem
\acs{PPDK}-Konzentrat versetzt (vgl.~\ref{sec:puffer_aktivitaetsassay}). Die \acs{PPDK}-Lösung wurde zuvor für \SI{30}{\minute} bei \SI{30}{\celsius} inkubiert, um eine möglichst vollständige
Aktivierung zu erreichen \citep{Ashton1990}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{2,5}{\milli\liter} einer \SI{100}{\milli\Molar} \acs{ATP}-Lösung
(Endkonzentration: \SI{1,25}{\milli\Molar}) gestartet und die Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} über einen Zeitraum von \SI{3}{\minute} bei \SI{30}{\celsius}
aufgezeichnet.
@ -874,6 +872,6 @@ Extremkonformationen des putativen \textit{Domain-swiveling}-Mechanismus.
Jeweils fünf Homologiemodelle wurden mit dem Programm \textit{Modeller} \citep{Sali1993a} aus den jeweiligen Templaten und der Primärstruktur der
\acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Rosche1990} generiert. Im Falle des von \textit{Zea mays} abgeleiteten Modells wurde als Vorlage die Pyruvat gebundene Struktur
verwendet (PDB: 1VBH). Lücken in der dreidimensionalen Struktur wurden anhand der ungebundenen Struktur (PDB: 1VBG) ergänzt. Um die Substratbindetasche möglichst
exakt zu nachzubilden, wurde das in der Kristallstruktur 1VBH vorhandene \acs{PEP}-Molekül, sowie das \ce{Mg2+}-Ion beim Modellieren berücksichtigt.
exakt zu nachzubilden, wurde das in der Kristallstruktur 1VBH vorhandene \acs{PEP}-Molekül, sowie das \ce{Mg^{2+}}-Ion beim Modellieren berücksichtigt.
Die Evaluation der erstellten Modelle erfolgte mit dem Programmpaket \textit{PROCHECK} \citep{Laskowski1993,Laskowski1996}.

12
inc/zusammenfassung.tex
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@ -1 +1,13 @@
\addchap{Zusammenfassung}
\acresetall
Ziel dieser Arbeit war es, die heterologe Expression der \ac{PPDK} aus \ac{F. trinervia} in \ac{E. coli}, sowie ein Reinigungsprotokoll zu etablieren und die Funktionalität über einen Aktivitätstest nachzuweisen.
Hierfür wurde Codon optimierte \acs{DNA} des für die \acs{PPDK} kodierenden Genabschnitts in einen aus pET-16b abgeleiteten Expressionsvektor kloniert. Mit diesem wurde der \ac{E. coli}"=Stamm BL21 (DE3) transformiert und die \acs{PPDK} in diesem exprimiert. Die heterolog exprimierte \acs{PPDK} wurde im Anschluss über einen Histidin-Tag affinitätschromatographisch
gereinigt. Es wurden hierbei hohe Ausbeuten von bis zu \SI{118}{\milli\gram\per\liter} Kulturmedium erzielt.
Die Funktionalität des gereinigten Proteins wurde mittels einer \ac{CD}-Spektroskopie in Kombination mit einem Aktivitätstest überprüft, beim dem Pyruvat, \acs{ATP} und anorganisches Phosphat zu \ac{PEP}, \acs{AMP} und Pyrophosphat umgesetzt werden.
Auf diese Weise wurden für die heterolog exprimierte \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} ein \ce{K_m} von \SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} (ATP) bzw. \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar} (Pyruvat), sowie eine spezifische Aktivität von \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram} bestimmt.
Durch eine Größenausschlusschromatographie konnte gezeigt werden, dass bestimmte Fraktionen der der gereinigten \acs{PPDK} monodispers vorliegen und sich somit für Kristallisationsexperimente eignen.
Zusammenfassend konnte die \ac{PPDK} aus \ac{F. trinervia} erfolgreich in \ac{E. coli} exprimiert und zu einem hohen Grad gereinigt werden. Die gereinigte \ac{PPDK} zeigte eine Aktivität, was auf eine funktionelle und somit wahrscheinlich native Faltung hindeutet.