Material und Methoden - mal wieder

inc/abkuerzungen.tex

@@ -3,7 +3,9 @@
  \setlength{\itemsep}{-\parsep}
  \acro{2YT}{\textit{2x Yeast extract and Tryptone} (engl.)}
  \acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
+ \acro{AMP}{Adenosinmonophosphat}
  \acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
+ \acro{ATP}{Adenosintriphosphat}
  \acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
  \acro{CBB}[CBB-G250]{Coomassie-Brilliant-Blau G-250}
  \acro{CD}{Circulardichroismus}
@@ -16,15 +18,25 @@
  \acro{EDTA}{Ethylendiamintetraessigsäure}
  \acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}}
  \acro{F. trinervia}[\textit{F. trinervia}]{\textit{Flaveria trinervia}}
+ %\acro{HCl}[\ce{HCl}]{Salzsäure}
  \acro{HRP}{Meerrettich-Peroxidase, engl. \textit{horseradish peroxidase}}
  \acro{IDA}{Iminodiessigsäure}
  \acro{IMAC}{Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie}
  \acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
+ %\acro{K2HPO4}[\ce{K2HPO4}]{Dikaliumhydrogenphosphat}
+ %\acro{KH2PO4}[\ce{KH2PO4}]{Kaliumdihydrogenphosphat}
+ %\acro{MgCl2}[\ce{MgCl2}]{Magnesiumchlorid}
+ %\acro{MgSO4}[\ce{MgSO4}]{Magnesiumsulfat}
+ \acro{NADH}{Nicotinamidadenindinukleotid}
+ \acro{NAD-MDH}{NAD-abhängige Malatdehydrogenase}
+ %\acro{NaHCO3}[\ce{NaHCO3}]{Natriumhydrogencarbonat}
  \acro{NaN3}[\ce{NaN3}]{Natriumazid}
  \acro{OD}{Optische Dichte}
  \acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.)}
  \acro{PAGE}{Polyacrylamidgelelektrophorese}
  \acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion}
+ \acro{PEP}{Phosphoenolpyruvat}
+ \acro{PEPCase}{Phosphoenolpyruvat-Carboxylase}
  \acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
  \acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
  \acro{rcf}{\textit{relative centrifugal force} (engl.)}

inc/material.tex

@@ -321,6 +321,25 @@
    \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat pH 7,9\\
    \SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat
  \end{description}
+ 
+\subsection{Puffer für den Aktivitätsassay}
+\label{sec:puffer_aktivitaetsassay}
+\begin{samepage}
+ \begin{description}
+  \item[Reaktionspuffer] \hfill \\
+   \SI{100}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl} pH 8\\
+   \SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
+   \SI{2,5}{\milli\Molar} Kaliumdihydrogenphosphat\\
+   \SI{5}{\milli\Molar} Natriumhydrogencarbonat\\
+   \SI{0,1}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
+   \SI{5}{\milli\Molar} \acs{DTT}\\
+   \textbf{frisch dazugegeben:}\\
+   \SI{0,2}{\milli\Molar} \acs{NADH}\\
+   \SI{1,25}{\milli\Molar} \acs{ATP}\\
+   \SI{0,8}{\Unit} \ac{PEPCase}\\
+   \SI{2}{\Unit} \ac{NAD-MDH}
+ \end{description}
+\end{samepage}
 
 \end{singlespace}
 \section{Molekularbiologische Methoden}
@@ -774,8 +793,42 @@ Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.
 
 \subsection{Aktivitätsassay}
 \label{sec:aktivitaetsassay}
+Um die Aktivität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmten, wurde ein Aktivitätsassay \citep{Salahas1990} durchgeführt. Hierbei wurde \ac{PEP}-Bildung
+in einem gekoppelten Enzymassay über den \acs{NADH}-Verbrauch verfolgt. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist in diesem Fall die Umsetzung
+von Pyruvat, anorganischem Phosphat und \acs{ATP} zu \acl{PEP}, \acs{AMP} und Pyrophosphat \eqref{eq:aktivitaet_1}. Nachfolgend wird \acl{PEP} durch
+die \acl{PEPCase} über eine \textbeta-Carboxylierung mit Hydrogencarbonat zu Oxalacetat umgesetzt \eqref{eq:aktivitaet_2}. Letzteres wird durch eine
+NAD-abhängige Malatdehydrogenase zu Malat reduziert \eqref{eq:aktivitaet_3}.
+%
+ \begin{align}
+  \cee{
+       \label{eq:aktivitaet_1}
+       \text{Pyruvat} + ATP + P_i <=>[PPDK] PEP + AMP + PPi\\
+       \label{eq:aktivitaet_2}
+       PEP + HCO3- ->[PEPCase] \text{Oxalacetat} + Pi \\
+       \label{eq:aktivitaet_3}
+       \text{Oxalacetat} + NADH <=>[NAD-MDH] \text{Malat} + NAD
+      }
+ \end{align}
+%
+Der \acs{NADH}-Verbrauch kann photometrisch über die Abnahme der \acs{NADH}-spezifischen Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} verfolgt werden. Da der
+Verbrauch eines \acs{NADH}-Moleküls gleichbedeutend ist mit der Bildung eines \acl{PEP}-Moleküls durch die \acs{PPDK}, kann aus dem Verbrauch an
+\acs{NADH} direkt auf die Bildungsrate von \acl{PEP} und somit auf die Aktivität der \acs{PPDK} geschlossen werden.
 
+Der Reaktionsansatz nach \citet{Salahas1990} (vgl. \ref{sec:puffer_aktivitaetsassay}) wurde mit \SI{0,5}{\micro\liter} gereinigtem und entsalztem 
+\acs{PPDK}-Konzentrat versetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{2,5}{\milli\liter} einer \SI{100}{\milli\Molar} \acs{ATP}-Lösung 
+(Endkonzentration: \SI{1,25}{\milli\Molar}) gestartet und die Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} über einen Zeitraum von \SI{3}{\minute} aufgezeichnet.
 
+Der Verbrauch an \acs{NADH} kann über das Lambert-Beer'sche Gesetz in Gleichung \eqref{eq:lambert_beer} aus der gemessenen Extinktion mit Hilfe des molaren Extinktionskoeffizienten für NADH 
+$\epsilon_{340} = \SI{6,3e3}{\per\Molar\per\centi\meter}$ \citep{McComb1976} und der Schichtdicke berechnet werden.
+%
+\begin{samepage}
+ \begin{align}
+  \label{eq:lambert_beer}
+  E = \epsilon \cdot c \cdot d
+  \intertext{$\epsilon$: molarer Extinktionskoeffizient \newline $c$: Konzentration \newline $d$: Schichtdicke}\nonumber
+ \end{align}
+\end{samepage}
+%
 \section{Bioinformatische Methoden}
 \label{sec:bioinformatische_methoden}