\chapter{Diskussion}
\section{Expression und Reinigung der \acs{PPDK}}
Die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} konnte erfolgreich in \acs{E. coli} BL21 (DE3) exprimiert werden. Sowohl in einer vierstündigen Expression, als auch in einer Expression über Nacht zeigten sich in der differentiellen Zentrifugation nur geringe unlösliche Anteile, gemessen an der Gesamtmenge Protein (vgl. \ref{sec:ergebnisse_dz}). Dies spricht dafür, dass nur in geringem Maße \textit{Inclusion Bodies} gebildet wurden und legt die Vermutung nahe, das der lösliche Proteinanteil nativ gefaltet ist.

Dies konnte durch die \acs{CD}-Spektroskopie gestützt werden. Es konnten Sekundärstrukturanteile nachgewiesen werden, welche sich mit Sequenz basierten \textit{ab initio} Vorhersagen, sowie bekannten Strukturdaten decken (vgl. Tabelle \ref{tab:cd}). In einem letzten Schritt konnte die tatsächlich funktionelle Faltung der rekombinanten \acs{PPDK} in einem Aktivitätstest gezeigt werden.

Im Rahmen der Reinigung konnten mit steigender Imidazolkonzentration insgesamt drei Fraktionen \acs{PPDK} gewonnen werden, die eine jeweils hohe Reinheit aufweisen (vgl. \ref{abb:reinigung_sds}) und sich durch ihre Dispersität unterscheiden (siehe Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}). Der Oligomerisierungsgrad beeinflusst offenbar die Bindungsaffinität der \acs{PPDK} an die Säule, 
was zu einem unterschiedlichen Elutionsverhalten führt. Ursächlich könnte eine zunehmende Maskierung des Hexa-Histidin-Tags in den Oligomeren sein. Eine zuverlässige Größenzuordnung konnte in der Größenausschluschromatographie aufgrund der sehr eng zusammen liegenden Elutionsvolumina nicht vorgenommen werden. Es konnte aber gezeigt werden, dass die bei \SI{250}{\milli\Molar} gewonnene Fraktion monodispers vorliegt und sich somit gut für zukünftige Kristallisationsexperimente eignet.

In Bezug auf den Oligomerisierungsgrad der \acs{PPDK} können auf Grund der Instabilität der eingesetzten Eichproteine im verwendeten Reinigungspuffer keine gesicherten Aussagen getroffen werden. Die mit \SI{200}{\milli\Molar} Imidazol eluierte Fraktion 2 weist jedoch eine recht geringe spezifische Aktivität im Vergleich zur mit \SI{250}{\milli\Molar} eluierten Fraktion 3 auf (Tabelle \ref{tab:aktivitaet}). Aus dem Chromatogramm (Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}) wird ersichtlich, dass bei Fraktion 2 der \textit{Peak} bei einem Elutionsvolumen von etwa \SI{1,7}{\milli\liter} im Vergleich zu Fraktion 3 deutlich niedriger und ein zusätzlicher \textit{Peak} bei etwa \SI{1,97}{\milli\liter} zu erkennen ist. Bei letzterem könnte es sich demnach um die inaktive monomere Form handeln, der \textit{Peak} bei \SI{1,68}{\milli\liter} könnte somit die aktive tetramere Form darstellen. Das Ausschlussvolumen der Säule wurde mit \SI{1,2}{\milli\liter} bestimmt, so dass es sich bei dem in Fraktion 1 sichtbaren \textit{Peak} bei \SI{1,28}{\milli\liter} um Aggregate handeln könnte.

Die Proteinausbeute liegt -- betrachtet man nur die monodispers gereinigte Fraktion -- bei etwa \SI{47}{\milli\gram\per\liter} Kulturmedium. Aus der Literatur ist für die heterologe Expression der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} in \acs{E. coli} eine Ausbeute von \SI{5}{\milli\gram\per\liter} Kultur bekannt \citep{Chastain1997}. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielte Ausbeute ist mit \SI{47}{\milli\gram\per\liter} für die monodisperse Fraktion bzw. \SI{118}{\milli\gram\per\liter} für die Summe aller \acs{PPDK}"=Fraktionen um den Faktor 10 bis 20 höher. Dies kann durch die Verwendung Codon optimierter \acs{DNA} erklärt werden, welche zu einer höheren Translationsrate und somit Expressionsrate führt. Zu beachten ist hierbei allerdings die erhöhte Gefahr einer Fehlfaltung des Proteins durch die höhere Translationsgeschwindigkeit \citep{Komar1999,Cortazzo2002}. Die damit einhergehende Bildung von \textit{Inclusion bodies} konnte aber nicht beobachtet werden (vgl. Abbildung \ref{abb:dz}). Ebenfalls gegen eine Fehlfaltung spricht die Ausbildung von Sekundärstrukturen (vgl. \ref{sec:ergebnisse_cd}) und die beobachtete Aktivität (vgl.~\ref{sec:ergebnisse_aktivitaetsassay}) der heterolog exprimierten \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}.\pagebreak

Der in der Literatur beschriebene Effekt der ausgeprägten Kältelabilität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Burnell1990}, welcher zum Zerfall der funktionellen Tetramere in Monomere führt, ließe sich unter Umständen zur Erhöhung der effektiv nutzbaren Ausbeute einsetzen. Die Vereinigung aller gereinigter PPDK-Fraktionen und eine anschließende Kältebehandlung sollte zu einer einheitlichen Population von PPDK-Monomeren führen.

\section{Aktivität der gereinigten PPDK}
Die spezifische Aktivität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} liegt mit \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram} in der \acs{PEP}-bildenden Richtung in der Größenordnung von Literaturwerten für \textit{Zea mays} \citep{Hatch1975}. In ähnlicher Weise stimmen auch die bestimmten \ce{K_m}-Werte für ATP \SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} und Pyruvat \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar} mit Literaturwerten von \textit{Zea mays} und \textit{F. brownii} überein \citep{Hatch1975,Ohta1997}, die ebenfalls im zwei- bis dreistelligen mikromolaren Bereich liegen. Ein Vergleich der experimentellen Daten mit Literaturwerten ist in Tabelle \ref{tab:literatur} aufgeführt. Auffällig ist hierbei, dass die \ce{K_m}"=Werte der heterolog exprimierten \acs{PPDK}s jeweils deutlich unterhalb der nativ isolierten liegen. Dies ist vermutlich auf fehlende Regulationsmechanismen -- beispielsweise die lichtinduzierte Phosphorylierung durch das \ac{PDRP} (siehe \ref{sec:c4_ppdk}) -- bei der heterolog exprimierten \acs{PPDK} zurückzuführen.

\ce{V_{max}} wurde im Rahmen der nichtlinearen Regression für \acs{ATP} und Pyruvat bestimmt. Unter Berücksichtigung der Standardabweichung sind die beiden Werte 
-- \SI[seperr]{0,095(5)}{\milli\Molar\per\minute} (ATP) und \SI[seperr]{0,093(5)}{\milli\Molar\per\minute} (Pyruvat) -- als identisch anzusehen. Dies entspricht der
Erwartung, da die maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung in beiden Fällen identisch sein sollte.
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\begin{table}[H]
 \centering
 \begin{threeparttable}
 \caption[Vergleich der kinetischen Parameter mit Literaturwerten]{Vergleich der kinetischen Parameter mit Literaturwerten der PPDK aus \textit{F. bidentis}, \textit{F. brownii} und \textit{Zea mays}.
          Die Literaturwerte beziehen sich jeweils auf die \acs{PEP}-bildende Reaktion. Ohne Klammern sind die \ce{K_m}"=Werte der heterolog in \acs{E. coli} exprimierten \acs{PPDK} angegeben, in Klammern die der nativ isolierten.}
 \label{tab:literatur}
 
 \begin{tabular}{llll}
  \toprule
  \multirow{2}{*}{\textbf{Spezies}} & \multicolumn{2}{c}{\textbf{\ce{K_m} [\si{\micro\Molar}]}} & \multirow{2}{*}{\textbf{spez. Aktivität [\si{\Unit\per\milli\gram}]}} \\
                                    & \textbf{ATP} & \textbf{Pyruvat} & \\
  \midrule
  \acs{F. trinervia}   & \num[seperr]{50(9)}  & \num[seperr]{270(44)} & \num[seperr]{ 0,99(9)}          \\
  \midrule
  \textit{F. bidentis} & 49 (25)\tnote{2}     & 59 (73)\tnote{2}      &                  \\
  \textit{F. brownii}  & 50 (88)\tnote{2}     & 32 (67)\tnote{2}      &                  \\
  \textit{Zea mays}    & 47 (95)\tnote{2}     & 65 (158)\tnote{2}     & 1,2\tnote{1}     \\
                       &                      & (178)\tnote{3}        &                  \\
  \bottomrule
 \end{tabular}
 \begin{tablenotes}
  \item[1] \citet{Hatch1975}
  \item[2] \citet{Ohta1997}
  \item[3] \citet{Chastain2011}
 \end{tablenotes}

\end{threeparttable}
\end{table}

Der beobachtete Abfall der gemessenen Reaktionsgeschwindigkeit bei einer \acs{ATP}-Konzentration von \SI{2,5}{\milli\Molar} (Abbildung \ref{abb:kinetik}) ist auf
die inhibitorische Wirkung von \acs{ATP}, \acs{ADP} und \acs{AMP} auf die als letzte Stufe des gekoppelten Enzymassays eingesetzte \acs{MDH} zurückzuführen \citep{Harris}. Bei einer \acs{ATP}-Konzentration 
von \SI{2,5}{\milli\Molar} ist nicht mehr die Pyruvat-Bildung durch die \acs{PPDK}, sondern die Umsetzung des Oxalacetats durch die \acs{MDH} der geschwindigkeitsbestimmende Schritt.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Aktivität der rekombinant aus \acs{E. coli} gewonnenen \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} in etwa vergleichbar mit anderen bekannten rekombinant hergestellten \citep{Ohta1997,Chastain2011}, oder nativ isolierten \citep{Hatch1975,Ohta1997} PPDKs ist.

\section{Homologiemodelle}
Die erstellten Homologiemodelle weisen nach einer Analyse mit PROCHECK keine auffälligen Anomalien auf, so dass die Modelle als hinreichend korrekt angesehen werden können. Hierauf deuten auch die zDOPE"=Werte von -0,92803 für das auf \textit{Zea mays} bzw. -0,92815 für das auf \acs{C. symbiosum} basierende Modell hin. Bei Betrachtung der DOPE"=Werte je Position im Alignment (vgl. Abbildung \ref{abb:dope}) zeigt sich, dass die Profile der Modelle und der entsprechenden Template qualitativ ähnlich sind. Es fallen allerdings Verschiebungen mit zunehmender Position im Alignment auf, welche auf einen Versatz des Alignments hindeuten können. Dies ist allerdings unwahrscheinlich, da insbesondere im C-terminalen Bereich innerhalb der \acs{PEP}/Pyruvat"=Bindedomäne (ab Position 517) hoch konservierte Sequenzabschnitte mit bekannter Funktionalität -- beispielsweise in Bezug auf die Substratbindung -- zu finden sind. Diese konservierten Abschnitte sind korrekt aligniert (vgl. Abbildung \ref{abb:ma}), weisen aber im DOPE"=Profil dennoch einen Versatz auf (Abbildung \ref{abb:dope}).

Da die \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} zudem eine hohe Sequenzidentität von \SI{79}{\percent} zur \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} aufweist, bietet das hierauf basierende
Modell eine gute Annäherung an die tatsächliche dreidimensionale Struktur der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}, insbesondere in Hinblick auf die räumliche Ausrichtung
der Seitenketten in der \acs{PEP}-Bindetasche. In Kombination mit der Identifikation hoch konservierter Sequenzabschnitte können einige für die \acs{PEP}-Bindung und
Umsetzung wichtige Reste identifiziert werden \citep{Nakanishi2005}: Arg562, Arg619, Arg669, Glu748, Asp772 und Asn771, sowie Cys834, welches als Protonen-Donor fungiert (Abbildung \ref{abb:substratbindetasche}).
Durch gezielte Mutation dieser Reste kann in zukünftigen Experimenten ihr Einfluss auf die Aktivität und Stabilität der \acs{PPDK} untersucht werden.
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\section{Ausblick}
Die im Rahmen dieser Arbeit gereinigte \acs{PPDK} liegt in hoher Konzentration, monodispers und hoher Reinheit vor, so dass sie in Kristallisationsexperimente eingesetzt werden kann. Eine erfolgreiche Kristallisation ist dann notwendig für die Strukturaufklärung mittels Röntgenkristallographie. Zusätzlich können anhand der erstellten Homologiemodelle \textit{in silico} Analysen durchgeführt werden. Beispielsweise kann nach Bindetaschen für Effektoren gesucht werden, welche das \textit{Domain-Swiveling} in distinkten Zwischenstadien halten. Sobald Kristallisationsbedingungen für die wildtypische Form etabliert sind, können diese für die Co-Kristallisation mit den gefundenen Effektoren adaptiert werden. Letztere können darüber hinaus direkt mit Hilfe des etablierten Aktivitätstests auf ihren Einfluss auf die \acs{PPDK}-Aktivität hin untersucht werden. Aus den resultierenden Strukturdaten ließen sich dann intermediäre Konformationen ableiten, die zu einem genaueren Verständnis der Funktionalität der \acs{PPDK} führen können. Mittels einer Netzwerkanalyse ließen sich zusätzlich Regionen innerhalb der \acs{PPDK} identifizieren, welche für die Flexibilität der zentralen Phospho"=Histidin"=Domäne verantwortlich sind. Hier bietet sich ein weiterer Ansatzpunkt um beispielsweise über \textit{Cross-Linking} Zwischenkonformationen zu stabilieren.

Ein weiterer interessanter Aspekt ist die genauere Untersuchung der Kältelabilität der \acs{PPDK}. Die für die Kältetoleranz bestimmter \acs{PPDK} Spezies verantwortlichen Aminosäurereste sind bekannt und für die Wirkungsweise wurden hydrophobe Wechselwirkungen, sowie eine gesteigerten Affinität zum im Tetramer zentral komplexierten \ce{Mg^{2+}}-Ion postuliert \citep{Ohta1997}. Gelöste Kristallstrukturen, auch von Mutanten, welche die zur Kältetoleranz führenden Punktmutationen tragen, könnten diese Vermutungen bestätigen oder erweitern.