\chapter{Material und Methoden} \section{Material} \subsection{Geräte und Hilfsmittel} \label{sec:geraete_hilfsmittel} \begin{singlespace} \begin{longtable}{p{0.5\textwidth} p{0.45\textwidth}} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\ \midrule Analysen-/Präzisionswaagen & Sartorius, Göttingen\\ Autoklav & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\ Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\ \acs{CD}-Spektrometer J-715 & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\ Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus & GE Healthcare, Uppsala, SE \\ \acs{DNA}-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\ Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\ Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\ Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\ Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\ Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R & Eppendorf, Hamburg\\ Image Analyzer LAS-4000 mini & Fujifilm, Düsseldorf\\ Magnetrührer MR 3000/3001 & Heidolph, Schwabach\\ Microplate Reader Infinite 200 PRO & Tecan, Crailsheim \\ Mikrozentrifuge Minispin & Eppendorf, Hamburg\\ Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage & Millipore, Schwalbach\\ Minishaker MS 2 & IKA, Staufen\\ Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti & Beckman Coulter, Krefeld\\ Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwalbach\\ Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\ Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\ Zellaufschlusssystem 'One-Shot' & Constant Systems, Daventry, UK\\ \bottomrule \end{longtable} \subsection{Verbrauchsmaterialien} \label{sec:verbrauchsmaterialien} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\ \midrule Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\ Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25 & GE Healthcare, Uppsala, SE\\ Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\ \acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter} & GE-Healthcare, Freiburg\\ Mikrotiterplatten & Hartenstein, Würzburg\\ Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\ Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\ Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One,\newline Frickenhausen\\ Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter}) & Merck, Bruchsal\\ \bottomrule \end{tabularx} \subsection{Chemikalien} \label{sec:chemikalien} \begin{longtable}{p{0.35\textwidth} r p{0.36\textwidth}} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\ \midrule Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\ Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\ Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\ \ac{CBB} & 6104-58-1 & \\ Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\ \acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\ \acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\ Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\ Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\ Hefeextrakt & & Becton Dickinson, Heidelberg\\ Imidazol & 288-32-4 & AppliChem, Darmstadt\\ \acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\ Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\ Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\ Magnesiumsulfat-Heptahydrat & 10034-99-8 & \\ Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\ Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\ Natriumhydrogencarbonat & 144-55-8 & VWR, Darmstadt\\ Nickelsulfat & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\ Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\ Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\ \acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\ Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\ Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\ Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\ Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\ \acf{Tris} & 77-86-1 & VWR, Darmstadt\\ \bottomrule \end{longtable} \subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren} \label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\ \midrule \acs{BSA}-Standard (\SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter}) & Qiagen, Hilden\\ \acs{DNA} \SI{1}{\kb}/\SI{100}{\bp} Ladder & New England Biolabs, Frankfurt\\ PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained) & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\ \bottomrule \end{tabularx} \subsection{Antikörper} \label{sec:antikoerper} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\ \midrule Anti-His-\acs{HRP} & Carl Roth, Karlsruhe\\ \bottomrule \end{tabularx} \subsection{Kommerzielle Kits} \label{sec:komerzielle_kits} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\ \midrule illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Uppsala, SE\\ QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\ Roti-Quant$^\text{\textregistered}$ (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\ \bottomrule \end{tabularx} \subsection{Restriktionsenzyme} \label{sec:restriktionsenzyme} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Erkennungssequenz (5'~--~3')}\\ \midrule \textit{BamH}I & New England Biolabs, Frankfurt & CA/TATG\\ \textit{Nde}I & New England Biolabs, Frankfurt & G/GATCC\\ \bottomrule \end{tabularx} \subsection{Bakterienstämme} \label{sec:batrienstaemme} \begin{samepage} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\ \midrule BL21 (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm gal} \textlambda(DE3)\\ BL21 Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm} Tet$^\text{r}$ gal \textlambda(DE3) \textit{endA} Hte\\ XL1-Blue & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} \textit{recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac} [F' \textit{proAB lacI$^\text{q}$ Z\textDelta M15} Tn\textit{10} (Tet$^\text{r}$)]\\ \bottomrule \end{tabularx} \end{samepage} \subsection{Synthetische Oligonukleotide} \label{sec:synthetische_oligonukleotide} \begin{samepage} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.3\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Sequenz (5'~--~3')} \\ \midrule pETEV-16b-PPDK-for & \texttt{CATGAAAACCTGTATTTTCAGGGACATATG \newline ACCGCTAAAAAACGCGTGTT}\\ pETEV-16b-PPDK-rev & \texttt{TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAG \newline TTAAACAATCACTTGGGCGG}\\ \bottomrule \end{tabularx} \end{samepage} \subsection{Plasmide} \label{sec:plasmide} \begin{samepage} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X} \toprule \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Marker}\\ \midrule pET-16b & Novagen, Darmstadt & Ampicillinresistenz\\ \bottomrule \end{tabularx} \end{samepage} \subsection{Kulturmedien} \label{sec:kulturmedien} \begin{samepage} \begin{description} \item[\acs{2YT} (pH 7,5)] \hfill \\ \SI{1,6}{\percent} (w/v) Pepton\\ \SI{1}{\percent} (w/v) Hefeextrakt\\ \SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid \end{description} \end{samepage} \subsection{Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese} \label{sec:puffer_agarose_gelelektrophorese} \begin{samepage} \begin{description} \item[\ac{TAE}-Puffer (50x)] \hfill \\ \SI{100}{\milli\liter} \acs{EDTA} (\SI{0,5}{\Molar}, pH 8)\\ \SI{57,1}{\milli\liter} Essigsäure\\ \SI{242}{\gram} Tris\\ \SI{1}[ad~]{\liter} \ce{ddH2O} \end{description} \end{samepage} \subsection{Puffer für den Zellaufschluss} \label{sec:puffer_zellauschluss} \begin{samepage} \begin{description} \item[Aufschlusspuffer] \hfill \\ \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\ \SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\ \SI{10}{\milli\Molar} Imidazol\\ \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\ \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\ \SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\ \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF} \end{description} \end{samepage} \subsection{Puffer und Lösungen für die Reinigung} \label{sec:reinigungspuffer} \begin{samepage} \begin{description} \item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\ \SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat \end{description} \end{samepage} \begin{samepage} \begin{description} \item[Waschpuffer] \hfill \\ \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\ \SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\ \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\ \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\ \SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\ \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF} \end{description} \end{samepage} \begin{samepage} \begin{description} \item[Elutionspuffer] \hfill \\ \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\ \SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\ \SI{500}{\milli\Molar} Imidazol\\ \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\ \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\ \SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\ \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF} \end{description} \end{samepage} \begin{samepage} \begin{description} \item[Lagerungspuffer] \hfill \\ \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 8\\ \SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\ \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{EDTA}\\ \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\ \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF} \end{description} \end{samepage} \end{singlespace} \section{Molekularbiologische Methoden} \label{sec:methoden} \subsection{Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren} \label{sec:konzentrationsbestimmung_nukleinsaeuren} Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei: \begin{align} \text{OD}_{260} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA} \label{eq:dna_konz} \end{align} \SI{2}{\micro\liter} der Probe und des verwendeten Puffers werden hierbei auf einer NanoQuant- Platte im Mikroplatten-Lesegerät vermessen und die Konzentration aus der Differenz aus Probe und Puffer gemäß Gleichung \ref{eq:dna_konz} berechnet. \subsection{Isolierung von Plasmid-\acs{DNA}} \label{sec:isolierung_plasmid_dna} Die Isolierung von Plasmiden erfolgte aus \SI{5}{\milli\liter} Übernachtkulturen mit Hilfe des "`QIAprep$^\text{\textregistered}$ Spin Miniprep"'-Kits nach Herstellerangaben. Die isolierte Plasmid-\acs{DNA} wurde in \SI{10}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl} pH 8,5 bei bei \SI{-20}{\celsius} gelagert. \subsection{Restriktionsverdau von \acs{DNA}} \label{sec:restriktionsverdau_dna} \begin{samepage} Im Zuge der Klonierung wurde der Zielvektor pET-16b über die beiden Restriktionsenzyme \textit{BamH}I und \textit{Nde}I linearisiert. Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}{\celsius} über einen Zeitraum von \SI{2}{\hour}. \begin{description} \item[Ansatz Restriktionsverdau] \hfill \\ \SI{4}{\micro\gram} Vektor-DNA\\ \SI{3}{\micro\liter} NEBuffer 4 (New England Biolabs, Frankfurt)\\ \SI{10}{\Unit} \textit{BamH}I \\ \SI{10}{\Unit} \textit{Nde}I\\ ad \SI{25}{\micro\liter} \ce{ddH2O} \end{description} \end{samepage} \subsection{Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von \acs{DNA}} \label{sec:agarose_gelelektrophorese} Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe wurde die Agarose"=Gelelektrophorese eingesetzt. Hierbei wandern die durch das Phosphatrückrat negativ geladenen Nukleinsäuren im elektrischen Feld durch ein Agarose"=Gel zur Anode. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist hierbei abhängig von der Größe, es resultiert eine entsprechende Auftrennung im Gel. Eine \SI{1}{\percent}ige~(w/v) Lösung von Agarose in \ac{TAE}-Puffer wurde etwa \SI{1}{\centi\meter} hoch auf den Gelträger der Elektrophoresekammer gefüllt, mit Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von \SI{0,5}{\micro\gram\per\milli\liter} versetzt und durch Schwenken homogen verteilt. Das erstarrte Gel wurde anschließend mit \acs{TAE}-Puffer überschichtet und mit \SI{5}{\micro\liter} Marker, sowie den zu analysierenden Proben beladen. Die Laufzeit betrug bei \SI{150}{\volt} \SIrange{30}{45}{\minute}. Die Dokumentation der \acs{DNA}"=Banden erfolgte fotografisch im \acs{UV}"=Transilluminator. \subsection{Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen} \label{sec:extraktion_dna_agarosegel} Die Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen erfolgte mit dem "`illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"' nach Herstellerangaben. \subsection{\acl{PCR}} \label{sec:pcr} Mit Hilfe der \ac{PCR} konnen Nukleinsäurefragmente gezielt vervielfältigt werden. Die Spezifität der Reaktion ist hierbei durch die Auswahl der eingesetzten Primer gegeben. Eine PCR gliedert sich grundsätzlich in drei aufeinanderfolgende Phasen: Während der Denaturierung bei \SI{95}{\celsius} wird der Doppelstrang in die beiden Einzelstränge aufgespalten. Das Annealing bei \SIrange{50}{60}{\celsius} führt zur Anlagerung der Primer an die komplementären Sequenzabschnitte der Einzelstränge des Templates. Die exakte Temperatur ist hierbei von den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer abhängig. Während der Elongationsphase erfolgt die Synthese neuer Komplementärstränge ausgehend von den Primern durch eine DNA-Polymerase. Durch eine mehrfache Wiederholung kann die Ziel-DNA in kurzer Zeit exponentiell vervielfacht werden. \subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}} \label{sec:inserts_slic} \begin{samepage} Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl. \ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz. \begin{description} \item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\ \SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\ \SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\ \SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\ \SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\ \SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (\SI{1}{\Unit\per\micro\liter}, peqlab, Erlangen) \\ \SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\ \SI{50}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O} \end{description} \end{samepage} Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur des zum \acs{PPDK}-kodierenden Bereich homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs. \begin{table}[hbt] \centering \caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}} \begin{tabular}{ccc} \toprule \textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit [\si{\minute}]} & \textbf{Zyklen}\\ \midrule 95 & 5 & \multirow{4}{*}{10} \\ 95 & 1 & \\ 46 & 1 & \\ 72 & 5 & \\ \midrule 95 & 1 & \multirow{3}{*}{20} \\ 65 & 1 & \\ 72 & 5 & \\ \midrule 95 & 10 & 1 \\ \bottomrule \end{tabular} \label{tab:slic_cycler} \end{table} \subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}} Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden zufällig ausgewählte Kolonien mittels einer Kolonie-PCR untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \ce{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \acs{2YT}-Medium verwendet. \begin{description} \item[Kolonie-PCR-Ansatz] \hfill \\ \SI{1}{\micro\liter} T7-Pro-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\ \SI{1}{\micro\liter} T7-Ter-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\ \SI{2,5}{\micro\liter} 10x~Thermo-Pol-Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\ \SI{0,5}{\Unit} Taq-Polymerase (\SI{5}{\Unit\per\micro\liter}, New England Biolabs, Frankfurt)\\ \SI{0,25}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar})\\ \SI{25}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O} \end{description} Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt. \begin{table}[hbt] \centering \caption[Cyclerprogramm Kolonie-\acs{PCR}]{Cyclerprogramm für die Kolonie-\acs{PCR}} \begin{tabular}{ccc} \toprule \textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit} & \textbf{Zyklen}\\ \midrule 95 & \SI{5}{\minute} & \multirow{4}{*}{30} \\ 95 & \SI{30}{\second} & \\ 48 & \SI{30}{\second} & \\ 72 & \SI{40}[\SI{2}{\minute}~]{\second} & \\ \midrule 72 & \SI{5}{\minute} & 1 \\ \bottomrule \end{tabular} \label{tab:kolonie_pcr_cycler} \end{table} \subsection{\acf{SLIC}} \label{sec:slic} Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren, welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren. Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl. \ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl. \ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt. Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut: \begin{description} \item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\ x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~≡~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\ \SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\ \SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\ \SI{1}{\Unit} T4-\acs{DNA}-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\ ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{ddH2O} \end{description} Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von \SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt. In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert-\acs{DNA} (\SI{2691}{\bp}) im zweifachen molaren Verhältnis eingesetzt: \begin{description} \item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\ x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} ≡~\SI{150}{\nano\gram}\\ y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} ≡~\SI{141}{\nano\gram}\\ \SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\ ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{ddH2O} \end{description} Der Ansatz wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{37}{\celsius} inkubiert. \SI{5}{\micro\liter} der Ansätze wurden für die Transformation von \acs{E. coli} XL1-Blue eingesetzt. \section{Mikrobiologische Methoden} \label{sec:mikrobiologische_methoden} \subsection{Transformation in \acs{E. coli}} \label{sec:transformation} Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation. \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetenter Zellen wurden auf Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-\acs{DNA} versetzt. Anschließend wurden die Zellen für \SI{15}{\minute} auf Eis inkubiert. Es folgte ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} von \SI{90}{\second} Dauer. Nach einer erneuten Inkubation auf Eis für \SI{2}{\minute} und der Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} \acs{2YT}-Medium wurden die Zellen für \SI{1}{\hour} unter leichtem Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert. Der \SI{150}{\micro\liter} des Ansatzes wurde anschließend auf \acs{2YT}"=Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert. \subsection{Stammhaltung} \label{sec:stammhaltung} Die Stammhaltung erfolgte in \SI{20}{\percent}igen Glycerinkulturen bei \SI{-80}{\celsius}. Hierfür wurden \SI{800}{\micro\liter} einer Übernachtkultur (vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren. \subsection{Heterologe Expression in \acs{E. coli}} \label{sec:expression_ecoli} Die Transformation kompetenter Zellen erfolgte wie in \ref{sec:transformation} beschrieben. Die Anzucht erfolgte in \acs{2YT}-Medium mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin. \subsubsection{Expressionsstudien} \label{sec:expression_ecoli_studien} Die optimalen Bedingungen zur heterologen Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} wurden durch Expressionsstudien evaluiert, bei denen unterschiedliche Konzentrationen von \ac{IPTG} zur Induktion verwendet wurden. Es kamen hierbei die \acs{E. coli}"=Stämme BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3) zum Einsatz. Von den Agarplatten (vgl. \ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt. Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer \acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar}, \SI{0,5}{\milli\Molar} und \SI{1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}. Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Vier Stunden nach der Induktion bzw. am nächsten Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet. \subsubsection{Präparative Expression} \label{sec:praeparative_expression} Die heterologe Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} erfolgte mit den in den Expressionsstudien als besonders geeignet explorierten Bedingungen. Als Expressionsstamm kam \acs{E. coli} BL21 (DE3) zum Einsatz. Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{100}{\milli\liter} Volumen in unschikanierten \SI{250}{\milli\liter}-Kolben angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt. Hierfür wurden \SI{2}{\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{500}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer \acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}. Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet. Die Zellpellets wurden in \SI{4}{\gram}-Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für weitere Versuche bei \SI{-80}{\celsius} gelagert. \section{Präparative Methoden} \label{sec:praeparative_methoden} \subsection{Zellaufschluss} \label{sec:zellaufschluss} Ein Aliquot eingefrorener Zellen (siehe \ref{sec:praeparative_expression}) wurde bei Raumtemperatur mit \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer, sowie einer Spatelspitze DNAse I (Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt und durch Vortexen resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch Hochdruckdispersion bei einem Druck von \SI{1,35}{\kilo\bar} und einer Temperatur von \SI{15}{\celsius}. \subsection{Proteinaufreinigung durch Affinitätschromatographie} \label{sec:affinitaetschromatographie} Proteine, die mit einem Poly-Histidin-Tag markiert sind, lassen sich über eine \acf{IMAC} aus einem Proteingemisch isolieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden HisTrap$^\text{\textregistered}$ HP-Säulen mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} eingesetzt. Als Säulenmaterial dient quervernetzte Agarose an welche \acf{IDA} immobilisiert ist. \ce{Ni2+}-Ionen werden von \acs{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion Poly-Histidin-markierter Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni2+}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über die Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses kompetitiv aus der Bindung mit \ce{Ni2+} zu verdrängen. Die wie in \ref{sec:zellaufschluss} beschrieben aufgeschlossenen Zellen wurden zunächst bei \SI{10000}{\xg} und \SI{15}{\celsius} für \SI{30}{\minute} zentrifugiert um Zelltrümmer und \textit{Inclusion-Bodies} zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{100000}{\xg} und \SI{15}{\celsius} ulrazentrifugiert um lediglich lösliche Proteine im Überstand zu halten und Membranfragmente zu präzipitieren. Die mit \ce{Ni2+} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \ce{ddH20} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende \ce{Ni2+} von der Säule zu eluieren und die Bildung von amorphem Nickel bei der nachfolgenden Benutzung der Puffer mit reduzierend wirksamen \acs{DTT} zu minimieren. Die Säule wurde mit Waschpuffer äquilibriert und das Zelllysat mit einer Flussrate von \SI{1,5}{\milli\liter\per\minute} auf die Säule geladen. Im Anschluss Unspezifisch bindende Proteine wurde mit \SI{20}{\CV} Waschpuffer + \SI{50}{\milli\Molar} Imidazol von der Säule gelöst. Die Elution der \acs{PPDK} erfolgte dann mit je \SI{10}{\CV} Waschpuffer + \SI{150}{\milli\Molar}, \SI{200}{\milli\Molar} und \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Es wurden Fraktionen mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} gesammelt und ggf. vereinigt. Zur Detektion der Proteinfraktionen wurde die Absorption bei \SI{280}{\nano\meter} verfolgt. Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt und neu mit \ce{Ni2+} beladen. \subsection{Konzentrierung} \label{sec:konzentrierung} \subsection{Entsalzung} \label{sec:entsalzung} \section{Analytische Methoden} \label{sec:analytische_methoden} \subsection{Differentielle Zentrifugation} \label{sec:differentielle_zentrifugation} \subsection{Größenauschlusschromatographie} \label{sec:groessenausschluss} \subsection{SDS-\acl{PAGE}} \label{sec:sds_page} \subsection{Konzentrationsbestimmung von Proteinen} \label{sec:konzentrationsbestimmung_proteine} \subsection{\acl{CD}-Spektroskopie} \label{sec:cd_spektroskopie} \section{Bioinformatische Methoden} \label{sec:bioinformatische_methoden}