\chapter{Ergebnisse}
\label{sec:ergebnisse}
%
\section{Klonierung}
\label{sec:erg_klonierung}
%
Sie \acs{SLIC}-Klonierung erfolgte wie in \ref{sec:slic} beschrieben. Die mittels \acs{PCR} synthetisierten \textit{Inserts} 
(vgl.~\ref{sec:inserts_slic}), sowie der linearisierte Vektor (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}) wurden zur Reinigung auf ein
Agarosegel aufgetragen (vgl. \ref{sec:agarose_gelelektrophorese}). Es ergab sich das in Abbildung \ref{abb:agarosegel_vektor_insert} gezeigte 
Auftrennungsmuster.
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
 \centering
 \includegraphics[keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/vektor_linear_text.png}
 % vektor_linear_text.png: 615x551 pixel, 300dpi, 5.21x4.67 cm, bb=0 0 148 132
 \caption{}
 \label{abb:linearisierter_vektor}
 \end{subfigure}
 %
 ~
 %
 \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
 \centering
 \includegraphics[keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/insert_pcr_text.png}
 % insert_pcr_text.png: 474x551 pixel, 300dpi, 4.01x4.67 cm, bb=0 0 114 132
 \caption{}
 \label{abb:}
\end{subfigure}
 \caption[Agarosegel zur Reinigung von Vektor und dem Insert]{Exemplarischer Ausschnitt aus dem Agarosegel zur Reinigung von 
                                                                                  linearisiertem Vektor (a) und dem Insert (b) zur SLIC-Klonierung.
                                                                                  Aufgetragen wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard und 
                                                                                  je \SI{20}{\micro\liter} Probe. Die erwarteten Größen sind \SI{5720}{\bp} (Vektor) 
                                                                                  und \SI{2691}{\bp} (Insert).}
 \label{abb:agarosegel_vektor_insert}
\end{figure}

Sowohl Vektor als auch Insert lagen innerhalb der erwarteten Größenordnung (\SI{5720}{\bp} bzw. \SI{2691}{\bp}), so dass beide wie in \ref{sec:slic}
beschrieben in den Ligationsansatz gegeben wurden. Zur Amplifikation des Vektors wurden dann \acs{E. coli} Zellen des Stamms XL1-Blue mit diesem transformiert 
(vgl. \ref{sec:transformation}) und auf Agarplatten angezogen. Mit einer Kolonie-PCR (vgl. \ref{sec:kolonie_pcr}) wurde überprüft, ob der untersuchte Klon
das korrekte Insert trägt. Das enstsprechende Gelbild ist in Abbildung \ref{abb:kolonie_pcr} dargestellt.
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/colony_pcr.png}
 % colony_pcr.png: 1586x1474 pixel, 300dpi, 13.43x12.48 cm, bb=0 0 381 354
 \caption[Agarosegel nach Kolonie-PCR]{Agarosegel nach Kolonie-PCR. Es wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard und je \SI{20}{\micro\liter} Probe aufgetragen.
 Untersucht wurden 24 Klone, von denen fünf (10, 13, 22, 23 und 24) ein Plasmid mit der korrekten Größe tragen.}
 \label{abb:kolonie_pcr}
\end{figure}

Von untersuchten 24 Klonen wiesen fünf ein Plasmid auf, welches ein Insert der erwarteten Größe von \SI{2691}{\bp} trägt. Die fünf positiven Klone
wurden in \SI{5}{\milli\liter} Kulturrörchen über Nacht angezogen und die Plasmid-DNA mit dem \textit{QIAprep Spin Miniprep Kit} nach Herstellerangaben extrahiert.
Proben der isolierten Plasmid-\acs{DNA} wurden zur Sequenzierung eingeschickt (StarSEQ GmbH, Mainz). Es konnte gezeigt werden, dass das aus Klon \#22 isolierte
Plasmid im für die \acs{PPDK} kodierenden Bereich keine Mutation trägt. Eine Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk ist in Abbildung \ref{abb:plasmidkarte}
aufgeführt.
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/pETEV-16b-ppdk.pdf}
 % pETEV-16b-ppdk.pdf: 611x480 pixel, 72dpi, 21.55x16.93 cm, bb=0 0 611 480
 \caption[Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk]{Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk. Der für die \acs{PPDK} kodierende Bereich liegt zwischen Position 5392 und 8022.
          \textit{Upstream} befinden sich die kodierenden Sequenzen für die \acs{TEV}-Schnittstelle und den Hexa-Histidin-Tag. Die Plasmidkarte wurde mit 
          \textit{PlasMapper} \citep{Dong2004} erstellt.}
 \label{abb:plasmidkarte}
\end{figure}

\section{Expressionsstudien}
\label{sec:Expressionsstudien}
Die Expressionsstudien (vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) zeigten eine deutliche Überexpression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} BL21 (DE3) bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius} und 
einer \acs{IPTG}-Konzentration von \SI{0,1}{\milli\Molar} (vgl. Abbildung \ref{abb:expressionsstudie}). Der direkte Vergleich zwischen den beiden verwendeten
Expressionsstämmen BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3) (Abbildung \ref{abb:expressionsstudie_klein}) zeigt eine deutlich stärkere Überexpression in BL21 (DE3) bei
gleichzeitig geringerer IPTG-Konzentration. Eine Expression über Nacht führte zu einer deutlich höheren Proteinausbeute im Vergleich zu einer Zellernte nach 
\SI{4}{\hour}. Die Identifizierung der \acs{PPDK} erfolgte durch einen Westernblot (vgl. \ref{sec:westernblot}).
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_gross.png}
 % Expressionsstudie_19042012_gross.png: 2480x1828 pixel, 300dpi, 21.00x15.48 cm, bb=0 0 595 439
 \caption[\acs{SDS}-\acs{PAGE} der Expressionsstudien]{\acs{SDS}-\acs{PAGE} der Expressionsstudien. Aufgetragen wurden Proben der beiden Expressionsstämme 
          BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3) bei Induktion mit unterschiedlicher \acs{IPTG}-Konzentration und einer Temperatur von jeweils \SI{30}{\celsius}. 
          Angegeben sind die Zeitpunkte der Probenentnahme vom Zeitpunkt der Induktion an. Der Größenbereich der \acs{PPDK} ist rot hervorgehoben.}
 \label{abb:expressionsstudie}
\end{figure}
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
  \centering
  \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_klein.png}
  % Expressionsstudie_19042012_klein.png: 2480x2894 pixel, 241dpi, 26.13x30.49 cm, bb=0 0 741 864
  \caption{}
  \label{abb:expressionsstudie_klein_sds}
 \end{subfigure}
% 
 ~
% 
  \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
  \centering
  \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_klein_blot.png}
  % Expressionsstudie_19042012_klein_blot.png: 2480x2894 pixel, 241dpi, 26.13x30.49 cm, bb=0 0 741 864
  \caption{}
  \label{abb:expressionsstudie_klein_blot}
 \end{subfigure}
 \caption[Vergleich der Expression in BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3)]{Vergleich der Expression in BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3). SDS-PAGE (a) und Westernblot (b). Aufgetragen wurden
         Expressionsproben nach \SI{0}{\hour} und \SI{4}{\hour} nach Induktion, sowie über Nacht. Verglichen wurden die Expressionsreihen mit dem jeweils besten
         Expressionsergebnis in BL21 (DE3) bzw. BL21 Gold (DE3). Die Induktion erfolgte mit \SI{0,1}{\milli\Molar} bzw. \SI{1}{\milli\Molar} IPTG.}
 \label{abb:expressionsstudie_klein}
\end{figure}

\section{Differentielle Zentrifugation}
\label{sec:ergebnisse_dz}

Im Rahmen der Expressionsstudien wurden Zellen von \acs{E. coli} BL21 (DE3) nach \SI{4}{\hour} bzw. nach einer Übernachtexpression geerntet, aufgeschlossen
und einer differentiellen Zentrifugation unterzogen (vgl. \ref{sec:differentielle_zentrifugation}). Die Proben wurden mittels eines Westernblots ausgewertet 
(Abbildung \ref{abb:dz}). Hierbei zeigte sich, dass der überwiegende Anteil der \acs{PPDK} in den Überstandsfraktionen lokalisiert und somit löslich ist.
Nur ein geringer Anteil befindet sich in den Pellets nach der Zentrifugation.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
  \centering
  \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/03052012_4h_2min.png}
  % 03052012_4h_2min.png: 2480x2254 pixel, 300dpi, 21.00x19.08 cm, bb=0 0 595 541
  \caption{}
  \label{abb:dz_4h}
 \end{subfigure}
 %
 ~
 %
 \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
  \centering
  \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/03052012_üN_2min.png}
  % 03052012_üN_2min.png: 2480x2141 pixel, 300dpi, 21.00x18.13 cm, bb=0 0 595 514
  \caption{}
  \label{abb:dz_on}
 \end{subfigure}
 \caption[Westernblots der differentiellen Zentrifugation]{Westernblots der differentiellen Zentrifugation. Die Zellen wurden nach \SI{4}{\hour} (a) bzw. nach 
          einer Übernachtexpression (b) geerntet. Aufgetragen wurden \SI{3}{\micro\liter} Marker (M), Probe nach Zellaufschluss (A), sowie Pellets (P) und Überstände (Ü) der 
          Zentrifugationsschritte (jeweils \SI{10}{\micro\liter}).}
 \label{abb:dz}
\end{figure}

\section{Native Reinigung der \acs{PPDK}}
\label{sec:ergebnisse_reinigung}

Die Reinigung der \acs{PPDK} erfolgte wie in \ref{sec:affinitaetschromatographie} beschrieben. Im Verlauf der Reinigung konnten vier Proteinfraktionen bei Elution
mit \SIlist{50;150;200;250}{\milli\Molar} Imidazol identifiziert werden (vgl. Abbildung \ref{abb:chromatogramm_aff}). In einer nachfolgend durchgeführten
\acs{SDS}-\acs{PAGE} mit Westernblot zeigte sich, dass drei Fraktionen (\SIlist{150;200;250}{\milli\Molar}) \acs{PPDK} in hoher Reinheit enthielten.
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=0.9\textwidth,keepaspectratio=true]{img/ergebnisse/aekta/20062012.eps}
 \caption[Chromatogramm der \acs{PPDK}-Reinigung mittels \acs{IMAC}]{Chromatogramm der \acs{PPDK}-Reinigung mittels \acs{IMAC}. Dargestellt sind die Absorption bei 
          \SI{280}{\nano\meter} (blau) und die Imidazolkonzentration (rot). Die gesammelten \acs{PPDK}-Fraktionen sind durch Pfeile markiert.}
 \label{abb:chromatogramm_aff}
\end{figure}
%
Die gesammelte PPDK-Fraktionen bei Elution mit \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol ließ sich bis auf \SI{37,54(134)}{\milli\gram\per\milli\liter} konzentrieren. 
In der Expression konnten aus \SI{2}{\liter} Kultur \SI{20}{\gram} Zellen geerntet werden. Da im Zuge der Reinigung \SI{4}{\gram} Zellen aufgeschlossen wurden, ergibt sich eine Ausbeute von etwa 
\SI{47}{\milli\gram\per\liter}~Kultur (vgl. Tabelle \ref{tab:ausbeute}).
%
\begin{table}[htb]
\centering
\caption[\acs{PPDK}-Konzentration und Ausbeute nach Reinigung]{\acs{PPDK}-Konzentration und Ausbeute nach Reinigung. Die Konzentrationen beziehen sich auf den erreichten 
Wert nach Einengen der fraglichen Fraktionen auf ein Volumen von \SI{500}{\micro\liter}.}
\label{tab:ausbeute}
 \begin{tabular}{lS[seperr,table-format=2.3(3)]S[seperr,table-format=2.3(3)]S[seperr,table-format=2.3(3)]}
  \toprule
   \textbf{Fraktion} & \multicolumn{1}{c}{\textbf{c(PPDK) [\si{\milli\gram\per\milli\liter}]}} & \multicolumn{1}{c}{\textbf{m(PPDK) [\si{\milli\gram}]}} & \multicolumn{1}{c}{$\frac{\textbf{m(PPDK)}}{\textbf{V(Kultur)}}$ \textbf{[\si{\milli\gram\per\liter}]}}\\
  \midrule
   1 (\SI{150}{\milli\Molar}) & 8,078(1812)  & 4,039(906)   & 10,098(2265)\\
   2 (\SI{200}{\milli\Molar}) & 48,935(2556) & 24,466(1278) & 61,165(3195)\\
   3 (\SI{250}{\milli\Molar}) & 37,536(1334) & 18,768(667)  & 46,920(1693)\\
  \bottomrule
 \end{tabular}
\end{table}
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
  \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
   \centering
   \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Reinigung_02072012.png}
   % Reinigung_02072012.png: 2480x2338 pixel, 300dpi, 21.00x19.80 cm, bb=0 0 595 561
   \caption{}
   \label{abb:reinigung_sds_a}
  \end{subfigure}
%
~
%
  \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
   \centering
   \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Reinigung_02072012_blot.png}
   % Reinigung_02072012.png: 2480x2338 pixel, 300dpi, 21.00x19.80 cm, bb=0 0 595 561
   \caption{}
   \label{abb:reinigung_sds_b}
  \end{subfigure}
  \caption[\acs{SDS}-\acs{PAGE} und Westernblot der nativen Reinigung]{\acs{SDS}-\acs{PAGE} (a) und Westernblot (b) der nativen Reinigung. Aufgetragen wurden \SI{3}{\micro\liter} Marker (M), \SI{1}{\micro\liter} 
           der Proben des Zelllysates (A), sowie der Zentrifugationen bei \SI{10000}{\xg} (10kÜ) bzw \SI{100000}{\xg} und \SI{10}{\micro\liter} des Durchflusses (D) und nachfolgenden Elutionsfraktionen. 
           Die \acs{PPDK}-Banden sind rot hervorgehoben (MW: \SI{98}{\kilo\dalton})}
  \label{abb:reinigung_sds}
\end{figure}
%
Zur Bestimmung der Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} wurden Proben aller drei Fraktionen mittels einer Größenausschlusschromatographie (vgl. \ref{sec:groessenausschluss}) analysiert.
Hierbei zeigte sich, dass lediglich die mit \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol eluierte Fraktion monodispers ist, während die mit \SIlist{150;200}{\milli\Molar} eluierten 
\acs{PPDK}-Fraktionen einen diversen Oligomerisierungsgrad aufwiesen (vgl. Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}).

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/aekta/11072012.eps}
 % 11072012.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=5 4 461 375
 \caption[Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie]{Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie. Die Kurvenverläufe wurden auf die jeweilige Konzentration normalisiert. Fraktion 3 zeigt ein monodisperses Profil, 
 während die \acs{PPDK} in den Fraktionen 1 und 2 in verschiedenen Oligomerisierungszuständen vorliegt. Vertikale Linien markieren die Position der \textit{Peaks}.}
 \label{abb:chromatogramm_gefi}
\end{figure}
\clearpage

\section{\acs{CD}-Spektroskopie}
\label{sec:ergebnisse_cd}
Das \acs{CD}-Spektrum wurde wie in \ref{sec:cd_spektroskopie} beschrieben aufgenommen. Abbildung \ref{abb:cd_spektrum} zeigt das Spektrum nach Abzug des Pufferspektrums. Deutlich zu erkennen ist
ein negativer Cotton-Effekt im Bereich um \SI{210}{\nano\meter}, welcher auf \textalpha-helikale Strukturen hindeutet.
Anhand des experimentellen Spektrums wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit den Programmen SELCON3 \citep{Sreerama1993}, CONTINLL \citep{Provencher1981}, CDSSTR \citep{Johnson1999} und K2D3 \citep{Louis-Jeune2011} durchgeführt.
Die daraus resultierenden, vorhergesagten Spektren sind ebenfalls in Abbildung \ref{abb:cd_spektrum} dargestellt. Alle verwendeten Algorithmen sagen das Spektrum qualitativ
korrekt vorher, die geringsten Abweichungen vom experimentellen Spektrum ergeben sich für CONTINLL und CDSSTR. Für die \acs{PPDK} werden in allen Fällen hohe \textalpha"=helikale
Strukturanteile vorhergesagt, im Fall von CONTINLL jedoch nur ein sehr geringer Anteil an \textbeta"=Strands (vgl. Tabelle \ref{tab:cd}). Die \textit{ab initio} Vorhersage mit SOPMA,
sowie die Ergebnisse von K2D3 und CDSSTR sind weitestgehend deckungsgleich mit den Strukturanteilen der PPDK aus \textit{Zea mays} (Tabelle \ref{tab:cd}).
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd/cd.eps}
 % cd.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=2 4 468 375
 \caption[\acs{CD}-Spektrum von gereinigter PPDK]{\acs{CD}-Spektrum von gereinigter PPDK. Die \acs{PPDK} lag in einer Konzentration von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter} in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat"=Puffer mit
          \SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat vor. Es wurden 15 Spektren mit einer Auflösung von \SI{1}{\nano\meter} akkumuliert. Im Bereich um \SI{210}{\nano\meter} zeigt sich ein negativer
          Cotton-Effekt, welcher charakteristisch für \textalpha-helikale Strukturanteile ist. Farbig dargestellt sind die mit unterschiedlichen Programmen vorhergesagten Spektren.}
 \label{abb:cd_spektrum}
\end{figure}

\begin{table}[htb]
 \caption[Vorhersage der Sekundärstrukturanteile]{Vorhersage der Sekundärstrukturanteile. Aufgeführt sind die vorhergesagten Strukturelemente anhand des \acs{CD}-Spektrums. Zum Vergleich dienen die Ergebnisse der sequenzbasierten \textit{ab initio} Vorhersage (SOPMA), 
          sowie die Sekundärstrukturanteile aus der Kristallstruktur der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBG).}
 \label{tab:cd}
 \begin{tabular}{lrrrr}
  \toprule
   \textbf{Algorithmus}     & \textbf{\textalpha-Helix [\si{\percent}]} & \textbf{\textbeta-Strand [\si{\percent}]} & \textbf{\textbeta-Turn [\si{\percent}]} & \textbf{Coil [\si{\percent}]} \\
  \midrule
   K2D3                     & 56                        & 18                           &                             &                               \\
   SELCON3                  & 56                        & 5                            & 17                          & 22                            \\
   CONTINLL                 & 68                        & 1                            & 14                          & 17                            \\
   CDSSTR                   & 51                        & 20                           & 15                          & 15                            \\
   \midrule
   SOPMA                    & 47                        & 17                           &  9                          & 27                            \\
   \midrule            
   PPDK (\textit{Zea mays}) & 47                        & 16                           &                             &                               \\
   \bottomrule
 \end{tabular}
\end{table}

\section{Aktivitätsassay}
\label{sec:ergebnisse_aktivitaetsassay}
Um die Aktivität der gereinigten PPDK zu quantifizieren, wurden zunächst die beiden Fraktionen mit der höchsten \acs{PPDK}-Konzentration -- Fraktion 2 und 
Fraktion 3 (\SIlist{200;250}{\milli\Molar} Imidazol) -- untersucht (vgl. \ref{sec:aktivitaetsassay}). Hierbei zeigte sich im Vergleich zur Negativkontrolle, 
dass in beiden Fraktionen eine Aktivität zu verzeichnen ist (siehe Abbildung \ref{abb:aktivitaet}). Da hinsichtlich zukünftiger Kristallisationsexperimente
in erster Linie die monodispers vorliegende Fraktion 3 von Interesse ist, wurde von dieser Fraktion eine vollständige Reaktionskinetik aufgenommen. Hierbei ergaben 
sich durch Anpassen einer Sättigungsfunktion durch nichtlineare Regression an die Michaelis"=Menten"=Gleichung \eqref{eq:mm} für \acs{ATP} und Pyruvat ein \ce{K_M} von 
\SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} bzw. \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar}, sowie ein \ce{V_{max}} von \SI[seperr]{0,095(5)}{\milli\Molar\per\minute} (ATP) 
\SI[seperr]{0,093(5)}{\milli\Molar\per\minute} (Pyruvat). Auffällig ist die bei höheren \acs{ATP}-Konzentrationen wieder abfallende Reaktionsgeschwindigkeit (vgl. Abbildung \ref{abb:kinetik}).
%
\begin{align}
 \label{eq:mm}
 v &= \frac{V_\text{max} \cdot [S]}{K_m + [S]}
\end{align}

Die Wechselzahl \ce{k_{cat}} wurde anhand von Gleichung \eqref{eq:kcat} aus \ce{V_{max}} und der PPDK-Konzentration von \SI[seperr]{0,38(2)}{\milli\Molar} mit 
\SI[seperr]{1,63(9)}{\per\second} bestimmt. Die spezifische Aktivität der \acs{PPDK} beträgt \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram} und konnte ebenfalls unter Berücksichtigung der 
Proteinkonzentration mittels Gleichung \ref{eq:spez_akt} berechnet werden.
%
\begin{align}
 \label{eq:kcat}
 k_\text{cat} &= \frac{V_\text{max}}{[E_0]}
\end{align}

Die katalytische Effizient {\ce{k_{cat}}/\ce{K_M}} beträgt \SI[seperr]{32,60(936)}{\milli\Molar\second} (ATP) bzw. 
\SI[seperr]{6,04(154)}{\milli\Molar\second} (Pyruvat). Eine Auflistung der kinetischen Parameter ist in Tabelle \ref{tab:kinetische_parameter} zu finden.
%
\begin{align}
 \label{eq:spez_akt}
 \text{spez. Aktivität \si{\Unit\per\milli\gram}} &= \frac{V_\text{max}~[\si{\micro\Molar\per\minute}] \cdot V(\text{Ansatz})~[\si{\liter}]}{m(\text{Protein})~[\si{\milli\gram}]}
\end{align}

\begin{table}[htb]
 \centering
 \caption[Kinetische Parameter der \acs{PPDK}]{Kinetische Parameter der \acs{PPDK}.}
 \label{tab:kinetische_parameter}
 \begin{tabular}{lS[seperr, table-format = 3.3(2)]s}
   \toprule
   \textbf{Parameter} & \textbf{Wert} & \textbf{Einheit}\\
   \midrule
   \ce{V_{max}}       & 0,093(5)   & \milli\Molar\per\minute  \\
   \ce{k_{cat}}       & 1,63(9)    & \per\second \\
   \midrule
   \ce{K_m} (ATP)     & 50(9)    & \micro\Molar \\
   \ce{K_m} (Pyruvat) & 270(44)  & \micro\Molar \\
   \midrule
   \ce{k_{cat}}/\ce{K_M} (ATP) & 32,60(936)& \milli\Molar\second \\
   \ce{k_{cat}}/\ce{K_M} (Pyruvat) & 6,04(154) & \milli\Molar\second \\
   \midrule
   spez. Aktivität   & 0,99(9) & \Unit\per\milli\gram \\
   \bottomrule
 \end{tabular}
\end{table}


\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/aktivitaet.eps}
 % aktivitaet.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=6 4 466 375
 \caption[Aktivität der gereinigten PPDK]{Aktivität der gereinigten PPDK. Die Absorption bei \SI{340}{\nano\meter} wurde über einen Zeitraum von \SI{80}{\second} 
          aufgenommen und auf die jeweilige PPDK-Konzentration, sowie das absolute Absorptionsmaximum normiert. Die Kontrolle enthielt anstelle der PPDK ein identisches
          Volumen Puffer. Die beiden PPDK-Fraktionen weisen eine deutliche Absorptionsabnahme auf, während die Absorption der Kontrolle nahezu unverändert bleibt.}
 \label{abb:aktivitaet}
\end{figure}

\begin{figure}[htb]
  \centering
  \begin{subfigure}[b]{0.45\textwidth}
   \centering
   \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/atp.eps}
   % atp.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=2 4 467 375
   \caption{}
   \label{abb:kinetik_atp}
  \end{subfigure}
  %
  ~
  %
  \begin{subfigure}[b]{0.45\textwidth}
   \centering
   \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/pyruvat.eps}
   % pyruvat.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=2 3 467 375
   \caption{}
   \label{abb:kinetik_pyruvat}
  \end{subfigure}
  \caption[Reaktionskinetik der \acs{PPDK}]{Reaktionskinetik der \acs{PPDK} mit \acs{ATP} (a) und Pyruvat (b) als Substrat. Der inhibierende Effekt von \acs{ATP} auf
   die im gekoppelten Enzymassay eingesetzte \acs{MDH} ist in (a) ersichtlich. Die Ordinatenachse ist der besseren Übersichtlichkeit wegen logarithmisch skaliert.}
  \label{abb:kinetik}
\end{figure}

\clearpage

\section{Homologiemodelle}
\label{sec:ergebnisse_homologemodell}
Die erzeugten Homologiemodelle (vgl. \ref{sec:erstellung_homologiemodell}) der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} zeigen eine gute Übereinstimmung mit
den zu Grunde liegenden Templat-Strukturen: \SI{0,708}{\angstrom} für das auf der Struktur aus \acs{C. symbiosum} und \SI{0,705}{\angstrom} für das auf der Struktur aus 
\textit{Zea mays} basierende Modell. Die Sequenzidentität zur zwischen \acs{F. trinervia} und \textit{Zea mays} beträgt \SI{79}{\percent}, zwischen \acs{F. trinervia} und 
\acs{C. symbiosum} \SI{55}{\percent}. Das jeweils beste Modell wurde anhand des zDOPE Wertes, sowie der Ergebnisse der PROCHECK-Analyse ausgewählt. Im Ramachandran-Plot
zeigt keines der beiden ausgewählten Modelle eine Kombination von ψ- und φ-Winkel, die nicht in einem der erlaubten Bereiche liegt (vgl. Abbildungen \ref{abb:ramachandran_Zm} 
und \ref{abb:ramachandran_Cs}).

Anhand der Modelle wurde eine Visualisierung des \textit{Domain-Swiveling} Mechanismus für die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} (Abbildung \ref{abb:overlay_homologiemodell}), sowie
der \acs{PEP}-Bindestelle (Abbildung \ref{abb:substratbindetasche}) erstellt. Es zeigt sich eine deutliche Torsion der zentralen Phospo-Histidindomäne und des katalytischen
His458.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/swiveling_domain2.png}
 % swiveling_domain2.png: 2480x976 pixel, 119dpi, 53.13x20.91 cm, bb=0 0 1506 593
 \caption[Homologiemodelle der \acs{PPDK}]{Homologiemodelle der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}. (A) zeigt die \acs{PEP} gebundene Konformation basierend auf der Struktur aus
 \textit{Zea mays}, (B) das auf \acs{C. symbiosum} basierende Modell. Beide Modelle stellen die jeweiligen Extremkonformationen des \textit{Swiveling-domain} Mechanismus dar. Das
 an der Übertragung der Phosphatgruppe beteiligte His458 ist als Stabmodell rot eingefärbt und durch einen schwarzen Pfeil markiert. Die einzelnen Domänen der \acs{PPDK} sind ebenfalls
 farblich hervorgehoben: Nukleotidbindedomäne (grün), Pyruvat/PEP-Bindedomäne (blau), Phosphohistidin-Domäne (gelb), Linker-Peptide (magenta und rot).}
 \label{abb:overlay_homologiemodell}
\end{figure}

In der Darstellung der modellierten Substratbindestelle sind die für die Koordination von \acs{PEP} wichtigen Reste Arg562, Arg619, Arg669, Glu748, Asp772 und
Asn771 sichtbar. Ebenfalls erkennbar ist das als Protonen-Donor fungierende Cys834. Die genannten Reste befinden sich in hoch konservierten Bereichen (siehe Abbildung \ref{abb:ma}).
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/substratbindung.png}
 % substratbindung.png: 2480x1681 pixel, 90dpi, 70.00x47.45 cm, bb=0 0 1984 1345
 \caption[Substratbindetasche für \acs{PEP}]{Substratbindetasche für \acs{PEP}. Die Ansicht zeigt die Bindestelle für \acs{PEP} im
  Homologiemodell der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}. Seitenketten in räumlicher Nähe zum Substrat sind als Linienmodell dargestellt und benannt. Die
  gestrichelten Linien zeigen mögliche polare Wechselwirkungen mit einer Länge von maximal \SI{3,5}{\angstrom} an.}
 \label{abb:substratbindetasche}
\end{figure}

