\chapter{Material und Methoden}
\section{Material}
\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
\label{sec:geraete_hilfsmittel}
 \begin{singlespace}
 \begin{longtable}{p{0.5\textwidth} p{0.45\textwidth}}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  Analysen-/Präzisionswaagen                               & Sartorius, Göttingen\\
  Autoklav                                                 & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
  Automatische Pipetten                                    & Gilson, Bad Camberg\\
  \acs{CD}-Spektrometer J-715                              & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
  Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus            & GE Healthcare, Uppsala, SE \\
  \acs{DNA}-Gelkammersystem PerfectBlue                    & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
  Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry'                    & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
  Gelsysteme für große Gele                                & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
  Inkubationsschüttler INNOVA 44R                          & New Brunswick, Nürtigen\\
  Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP                            & Beckman Coulter, Krefeld\\
  Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R                          & Eppendorf, Hamburg\\
  Image Analyzer LAS-4000 mini                             & Fujifilm, Düsseldorf\\
  Magnetrührer MR 3000/3001                                & Heidolph, Schwabach\\
  Microplate Reader Infinite 200 PRO                       & Tecan, Crailsheim \\
  Mikrozentrifuge Minispin                                 & Eppendorf, Hamburg\\
  Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage                      & Millipore, Schwalbach\\
  Minishaker MS 2                                          & IKA, Staufen\\
  Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti                   & Beckman Coulter, Krefeld\\
  Taumelschüttler Polymax 1040                             & Heidolph, Schwalbach\\
  Thermomixer compact/comfort                              & Eppendorf, Hamburg\\
  Ultrazentrifuge Optima L-80 XP                           & Beckman Coulter, Krefeld\\
  Zellaufschlusssystem 'One-Shot'                          & Constant Systems, Daventry, UK\\
  \bottomrule
 \end{longtable}
 
\subsection{Verbrauchsmaterialien}
\label{sec:verbrauchsmaterialien}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  Chromatographiepapier 3MM Chr                                   & Whatman, Maidstone, UK\\
  Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25                            & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
  Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter}  & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
  Filter für Ultrazentrifugation "`Amicon Ultra"'                 & Millipore, Schwalbach\\
  \acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter}                & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
  Mikrotiterplatten                                               & Hartenstein, Würzburg\\
  Petrischalen                                                    & Hartenstein, Würzburg\\
  Pipettenspitzen                                                 & Brand, Wertheim\\
  Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One,\newline Frickenhausen\\
  Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter})                  & Merck, Bruchsal\\
  \bottomrule
 \end{tabularx}
 
\subsection{Chemikalien}
\label{sec:chemikalien}
  \begin{longtable}{p{0.35\textwidth} r p{0.36\textwidth}}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  Agar                                                               &            & Becton Dickinson, Heidelberg\\
  Ampicillin-Natriumsalz                                             & 69-52-3    & AppliChem, Darmstadt\\
  Bromphenolblau                                                     & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
  \ac{CBB}                                                           & 6104-58-1  & \\
  Dikaliumhydrogenphosphat                                           & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
  \acf{DTT}                                                          & 3483-12-3  & Sigma-Aldrich, München\\
  \acf{EDTA}                                                         & 60-00-4    & AppliChem, Darmstadt\\
  Ethanol                                                            & 64-17-5    & VWR, Darmstadt\\
  Glycerin                                                           & 56-81-5    & Carl Roth, Karlsruhe\\
  Hefeextrakt                                                        &            & Becton Dickinson, Heidelberg\\
  Imidazol                                                           & 288-32-4   & AppliChem, Darmstadt\\
  \acf{IPTG}                                                         & 367-93-1   & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
  Kaliumdihydrogenphosphat                                           & 7778-77-0  & Grüssing, Filsum\\
  Magnesiumchlorid                                                   & 7791-18-6  & VWR, Darmstadt\\
  Magnesiumsulfat-Heptahydrat                                        & 10034-99-8 & \\
  Natriumchlorid                                                     & 7647-14-5  & VWR, Damrstadt\\
  Natriumdodecylsulfat (SDS)                                         & 151-21-3   & Serva, Heidelberg\\
  Natriumhydrogencarbonat                                            & 144-55-8   & VWR, Darmstadt\\
  Nickelsulfat                                                       & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
  Pepton                                                             &            & Becton Dickinson, Heidelberg\\
  Phosphorsäure                                                      & 7664-38-2  & Grüssing, Filsum\\
  \acf{PMSF}                                                         & 329-98-6   & Merck, Bruchsal\\
  Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20)                & 9005-64-5  & Sigma-Aldrich, München\\
  Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30                        &            & Carl Roth, Karlsruhe\\
  Saccharose                                                         & 57-50-1    & Carl Roth, Karlsruhe\\
  Salzsäure                                                          & 7647-01-0  & VWR, Darmstadt\\
  \acf{Tris}                                                         & 77-86-1    & VWR, Darmstadt\\
  \bottomrule
  \end{longtable}

 \subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren}
 \label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  \acs{BSA}-Standard (\SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter})        & Qiagen, Hilden\\
  \acs{DNA} \SI{1}{\kb}/\SI{100}{\bp} Ladder                      & New England Biolabs, Frankfurt\\
  PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained)                 & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\
  \bottomrule
 \end{tabularx} 
 
\subsection{Antikörper}
\label{sec:antikoerper}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  Anti-His-\acs{HRP} & Carl Roth, Karlsruhe\\
  \bottomrule
 \end{tabularx}
 
\subsection{Kommerzielle Kits}
\label{sec:komerzielle_kits}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
  QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\
  Roti$^\text{\textregistered}$-Quant (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
  \bottomrule
 \end{tabularx}
 
\subsection{Restriktionsenzyme}
\label{sec:restriktionsenzyme}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Erkennungssequenz (5'~--~3')}\\
  \midrule
  \textit{Nde}I & New England Biolabs, Frankfurt & CA/TATG\\
  \textit{BamH}I  & New England Biolabs, Frankfurt & G/GATCC\\
  \bottomrule
 \end{tabularx} 
 
\subsection{Bakterienstämme}
\label{sec:batrienstaemme}

\begin{samepage}
 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\
  \midrule
  BL21 (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm gal} \textlambda(DE3)\\ 
  BL21 Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm} Tet$^\text{r}$ gal \textlambda(DE3) \textit{endA} Hte\\
  XL1-Blue & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} \textit{recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac} [F' \textit{proAB lacI$^\text{q}$ Z\textDelta M15} Tn\textit{10} (Tet$^\text{r}$)]\\
  \bottomrule
 \end{tabularx}
\end{samepage}
 
\subsection{Synthetische Oligonukleotide}
\label{sec:synthetische_oligonukleotide}

\begin{samepage}
 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.3\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Sequenz (5'~--~3')} \\
  \midrule
  pETEV-16b-PPDK-for & \texttt{CATGAAAACCTGTATTTTCAGGGACATATG \newline ACCGCTAAAAAACGCGTGTT}\\
  pETEV-16b-PPDK-rev & \texttt{TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAG \newline TTAAACAATCACTTGGGCGG}\\
  \bottomrule
 \end{tabularx} 
\end{samepage}
 
\subsection{Plasmide}
\label{sec:plasmide}
% Das tatsächlich eingesetzte Plasmid trägt die Bezeichnung pETEV-16b und ist ein Derivat des pET-16b-Vektors,
% das zusätzlich zwischen der für den Hexa-Histidin-Tag kodierenden Sequenz und dem Zielgen eine für die Schnittstelle 
% der \acs{TEV}-Protease kodierende Sequenz beinhaltet.
% 
\begin{samepage}
 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Marker}\\
  \midrule
  pET-16b & Novagen, Darmstadt & Ampicillinresistenz\\
  \bottomrule
 \end{tabularx} 
\end{samepage}
 
\subsection{Kulturmedien}
\label{sec:kulturmedien}
\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[\acs{2YT} (pH 7,5)] \hfill \\
 \SI{1,6}{\percent} (w/v) Pepton\\
 \SI{1}{\percent} (w/v) Hefeextrakt\\
 \SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid
\end{description}
\end{samepage}

\subsection{Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese}
\label{sec:puffer_agarose_gelelektrophorese}
\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[\ac{TAE}-Puffer (50x)] \hfill \\
 \SI{100}{\milli\liter} \acs{EDTA} (\SI{0,5}{\Molar}, pH 8)\\
 \SI{57,1}{\milli\liter} Essigsäure\\
 \SI{242}{\gram} Tris\\
 \SI{1}[ad~]{\liter} \acs{ddH2O}
\end{description}
\end{samepage}

\subsection{Puffer für die \acs{SDS}-\acs{PAGE}}
\label{sec:puffer_sds_page}
\begin{description}
 \item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30)] \hfill \\  
  \SI{30}{\percent} Acrylamid\\
  \SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid
 \item[Laufpuffer (10\texttimes)] \hfill \\
  \SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}\\
  \SI{1,92}{\Molar} Glycin\\
  \SI{0,5}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
 \item[Sammelgelpuffer, pH 6,7 (5\texttimes)] \hfill \\
  \SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
  \SI{0,5}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
 \item[Trenngelpuffer, pH 8,9 (2,5\texttimes)] \hfill \\
  \SI{1,875}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
  \SI{0,25}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
 \item[Probenpuffer (4\texttimes)] \hfill \\
  \SI{30}{\milli\Molar} Borsäure\\
  \SI{30}{\milli\Molar} \acs{Tris}\\
  \SI{0,7}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
  \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
  \SI{50}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
  \SI{6,7}{\percent} (w/v) \acs{SDS}\\
  \SI{16,7}{\percent} (w/v) Saccharose\\
  \SI{0,16}{\percent} (w/v) Bromphenolblau
 \item[Färbelösung] \hfill \\
  \SI{0,1}{\percent}~(w/v) \acs{CBB}\\
  \SI{2}{\percent}~(w/v) Phosphorsäure\\
  \SI{5}{\percent}~(w/w) Aluminiumsulfat\\
  \SI{10}{\percent}~(v/v) Ethanol
\end{description}

\subsection{Puffer und Lösungen für den Westernblot}
\label{sec:puffer_westernblot}
\begin{description}
 \item[Transferpuffer]\hfill \\
  \SI{25}{\milli\Molar} Tris\\
  \SI{190}{\milli\Molar} Glycin\\
  \SI{10}{\percent} (v/v) Ethanol
 \item[TBS pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
  \SI{10}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl}\\
  \SI{150}{\milli\Molar} Natriumchlorid
 \item[TBT pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
  \SI{20}{\milli\Molar} Tris\\
  \SI{500}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
  \SI{0,05}{\percent} (v/v) Polysorbat 20
 \item[Caseinlösung pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
  \SI{1}{\percent} (w/v) Casein in TBS\\
  \SI{2}{\milli\liter} \SI{2}{\Molar} \ce{NaOH} je \SI{500}{\milli\liter}
\end{description}

\subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
\label{sec:puffer_zellauschluss}
\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
 \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
 \SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
 \SI{10}{\milli\Molar} Imidazol\\
 \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
 \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
 \SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
 \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
\end{description}
\end{samepage}

\subsection{Puffer und Lösungen für die Reinigung}
\label{sec:reinigungspuffer}
\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
 \SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
\end{description}
\end{samepage}

\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[Waschpuffer] \hfill \\
 \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
 \SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
 \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
 \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
 \SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
 \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
\end{description}
\end{samepage}

\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[Elutionspuffer] \hfill \\
 \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
 \SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
 \SI{500}{\milli\Molar} Imidazol\\
 \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
 \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
 \SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
 \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
\end{description}
\end{samepage}

\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[Lagerungspuffer] \hfill \\
 \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 8\\
 \SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
 \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{EDTA}\\
 \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
 \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
\end{description}
\end{samepage}

\subsection{Puffer für die \acs{CD}-Spektroskopie}
\label{sec:puffer_cd_spektroskopie}
 \begin{description}
  \item[CD-Puffer] \hfill \\
   \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat pH 7,9\\
   \SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat
 \end{description}
 
\subsection{Puffer für den Aktivitätsassay}
\label{sec:puffer_aktivitaetsassay}
\begin{samepage}
 \begin{description}
  \item[Reaktionspuffer] \hfill \\
   \SI{100}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl} pH 8\\
   \SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
   \SI{2,5}{\milli\Molar} Kaliumdihydrogenphosphat\\
   \SI{5}{\milli\Molar} Natriumhydrogencarbonat\\
   \SI{0,1}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
   \SI{5}{\milli\Molar} \acs{DTT}\\
   \textbf{frisch dazugegeben:}\\
   \SI{0,2}{\milli\Molar} \acs{NADH}\\
   \SI{1,25}{\milli\Molar} \acs{ATP}\\
   \SI{0,8}{\Unit} \ac{PEPCase}\\
   \SI{2}{\Unit} \ac{NAD-MDH}
 \end{description}
\end{samepage}

\end{singlespace}
\section{Molekularbiologische Methoden}
\label{sec:methoden}

\subsection{Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren}
\label{sec:konzentrationsbestimmung_nukleinsaeuren}
Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
\begin{align}
  \text{OD}_{260} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
  \label{eq:dna_konz}
\end{align}

\SI{2}{\micro\liter} der Probe und des verwendeten Puffers werden hierbei auf einer NanoQuant-
Platte im Mikroplatten-Lesegerät vermessen und die Konzentration aus der Differenz
aus Probe und Puffer gemäß Gleichung \ref{eq:dna_konz} berechnet.

\subsection{Isolierung von Plasmid-\acs{DNA}}
\label{sec:isolierung_plasmid_dna}
Die Isolierung von Plasmiden erfolgte aus \SI{5}{\milli\liter} Übernachtkulturen mit Hilfe des
"`QIAprep$^\text{\textregistered}$ Spin Miniprep"'-Kits nach Herstellerangaben.
Die isolierte Plasmid-\acs{DNA} wurde in \SI{10}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl} pH 8,5 bei bei 
\SI{-20}{\celsius} gelagert.

\subsection{Restriktionsverdau von \acs{DNA}}
\label{sec:restriktionsverdau_dna}
\begin{samepage}
Im Zuge der Klonierung wurde der Zielvektor pET-16b über die beiden Restriktionsenzyme \textit{BamH}I und \textit{Nde}I linearisiert.
Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}{\celsius} über einen Zeitraum von \SI{2}{\hour}.
\begin{description}
 \item[Ansatz Restriktionsverdau] \hfill \\
 \SI{4}{\micro\gram} Vektor-DNA\\
 \SI{3}{\micro\liter} NEBuffer 4 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 \SI{10}{\Unit} \textit{BamH}I \\
 \SI{10}{\Unit} \textit{Nde}I\\
 ad \SI{25}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
\end{description}
\end{samepage}

\subsection{Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von \acs{DNA}}
\label{sec:agarose_gelelektrophorese}
Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe wurde die Agarose"=Gelelektrophorese eingesetzt.
Hierbei wandern die durch das Phosphatrückrat negativ geladenen Nukleinsäuren im elektrischen Feld durch ein
Agarose"=Gel zur Anode. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist hierbei abhängig von der Größe, es resultiert
eine entsprechende Auftrennung im Gel.

Eine \SI{1}{\percent}ige~(w/v) Lösung von Agarose in \ac{TAE}-Puffer wurde etwa \SI{1}{\centi\meter} hoch auf den
Gelträger der Elektrophoresekammer gefüllt, mit Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von \SI{0,5}{\micro\gram\per\milli\liter} versetzt
und durch Schwenken homogen verteilt.

Das erstarrte Gel wurde anschließend mit \acs{TAE}-Puffer überschichtet und mit \SI{5}{\micro\liter} Marker, sowie den zu analysierenden
Proben beladen. Die Laufzeit betrug bei \SI{150}{\volt} \SIrange{30}{45}{\minute}.

Die Dokumentation der \acs{DNA}"=Banden erfolgte fotografisch im \acs{UV}"=Transilluminator.

\subsection{Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen}
\label{sec:extraktion_dna_agarosegel}
Die Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen erfolgte mit dem "`illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"'
nach Herstellerangaben.

\subsection{\acl{PCR}}
\label{sec:pcr}
Mit Hilfe der \ac{PCR} konnen Nukleinsäurefragmente gezielt
vervielfältigt werden. Die Spezifität der Reaktion ist hierbei durch die Auswahl der
eingesetzten Primer gegeben.
Eine PCR gliedert sich grundsätzlich in drei aufeinanderfolgende Phasen: Während
der Denaturierung bei \SI{95}{\celsius} wird der Doppelstrang in die beiden Einzelstränge
aufgespalten. Das Annealing bei \SIrange{50}{60}{\celsius} führt zur Anlagerung der Primer an die
komplementären Sequenzabschnitte der Einzelstränge des Templates. Die exakte
Temperatur ist hierbei von den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer abhängig.
Während der Elongationsphase erfolgt die Synthese neuer Komplementärstränge
ausgehend von den Primern durch eine DNA-Polymerase.
Durch eine mehrfache Wiederholung kann die Ziel-DNA in kurzer Zeit exponentiell
vervielfacht werden.

\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
\label{sec:inserts_slic}
\begin{samepage}
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl.~\ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz. Diese
wurden so gewählt, dass jeweils \SI{30}{\bp} zum Zielvektor und \SI{20}{\bp} zum Zielgen homolog sind.
\begin{description}
 \item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\
  \SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
  \SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
  \SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
  \SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
  \SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (\SI{1}{\Unit\per\micro\liter}, peqlab, Erlangen) \\
  \SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
  \SI{50}[ad~]{\micro\liter} \acs{ddH2O}
\end{description}
\end{samepage}
Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
des zum \acs{PPDK}-kodierenden Bereich homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.

\begin{table}[hbt]
\centering
\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
\begin{tabular}{ccc}
\toprule
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit [\si{\minute}]} & \textbf{Zyklen}\\
\midrule
95 & 5 & \multirow{4}{*}{10} \\
95 & 1 & \\
46 & 1 & \\
72 & 5 & \\
\midrule
95 & 1 & \multirow{3}{*}{20} \\
65 & 1 & \\
72 & 5 & \\
\midrule
95 & 10 & 1 \\
\bottomrule
\end{tabular}
\label{tab:slic_cycler}
\end{table}

\subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}}
\label{sec:kolonie_pcr}
Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden zufällig ausgewählte Kolonien mittels einer Kolonie-PCR
untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \acs{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht
und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \acs{2YT}-Medium verwendet.
%
\begin{description}
 \item[Kolonie-PCR-Ansatz] \hfill \\
 \SI{1}{\micro\liter} T7-Pro-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
 \SI{1}{\micro\liter} T7-Ter-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
 \SI{2,5}{\micro\liter} 10x~Thermo-Pol-Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 \SI{0,5}{\Unit} Taq-Polymerase (\SI{5}{\Unit\per\micro\liter}, New England Biolabs, Frankfurt)\\
 \SI{0,25}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar})\\
 \SI{25}[ad~]{\micro\liter} \acs{ddH2O}
\end{description}
%
Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt.

\begin{table}[hbt]
\centering
\caption[Cyclerprogramm Kolonie-\acs{PCR}]{Cyclerprogramm für die Kolonie-\acs{PCR}}
\begin{tabular}{ccc}
\toprule
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit} & \textbf{Zyklen}\\
\midrule
95 & \SI{5}{\minute} & \multirow{4}{*}{30} \\
95 & \SI{30}{\second} & \\
48 & \SI{30}{\second} & \\
72 & \SI{40}[\SI{2}{\minute}~]{\second} & \\
\midrule
72 & \SI{5}{\minute} & 1 \\
\bottomrule
\end{tabular}
\label{tab:kolonie_pcr_cycler}
\end{table}

\subsection{\acf{SLIC}}
\label{sec:slic}
Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren, 
welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.

Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor 
wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl.~\ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die 
für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
%
\begin{description}
 \item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
 x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~≡~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
 \SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
 \SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 \SI{1}{\Unit} T4-\acs{DNA}-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 ad \SI{35}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
\end{description}
%
Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase von 
\SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde 
durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.

In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert-\acs{DNA} (\SI{2691}{\bp}) im zweifachen molaren Verhältnis eingesetzt:
%
\begin{description}
 \item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
 x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} ≡~\SI{150}{\nano\gram}\\
 y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} ≡~\SI{141}{\nano\gram}\\
 \SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 ad \SI{10}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
\end{description}
%
Der Ansatz wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{37}{\celsius} inkubiert. \SI{5}{\micro\liter} der Ansätze wurden für die
Transformation von \acs{E. coli} XL1-Blue eingesetzt.

\section{Mikrobiologische Methoden}
\label{sec:mikrobiologische_methoden}

\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
\label{sec:transformation}
Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation. \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetenter Zellen wurden auf 
Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-\acs{DNA} versetzt. Anschließend wurden die Zellen für \SI{15}{\minute} auf Eis inkubiert.
Es folgte ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} von \SI{90}{\second} Dauer. Nach einer erneuten Inkubation auf Eis
für \SI{2}{\minute} und der Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} \acs{2YT}-Medium wurden die Zellen für \SI{1}{\hour} unter leichtem
Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.

Der \SI{150}{\micro\liter} des Ansatzes wurde anschließend auf \acs{2YT}"=Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin
ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.

\subsection{Stammhaltung}
\label{sec:stammhaltung}
Die Stammhaltung erfolgte in \SI{20}{\percent}igen Glycerinkulturen bei \SI{-80}{\celsius}. Hierfür wurden \SI{800}{\micro\liter} einer Übernachtkultur 
(vgl.~\ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren.

\subsection{Heterologe Expression in \acs{E. coli}}
\label{sec:expression_ecoli}
Die Transformation kompetenter Zellen erfolgte wie in \ref{sec:transformation} beschrieben. Die Anzucht erfolgte in \acs{2YT}-Medium 
mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin.

\subsubsection{Expressionsstudien}
\label{sec:expression_ecoli_studien}
Die optimalen Bedingungen zur heterologen Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} wurden durch Expressionsstudien evaluiert, bei denen 
unterschiedliche Konzentrationen von \ac{IPTG} zur Induktion verwendet wurden. Es kamen hierbei die \acs{E. coli}"=Stämme BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3)
zum Einsatz.

Von den Agarplatten (vgl.~\ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
\SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt.

Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer 
\acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar}, \SI{0,5}{\milli\Molar} und \SI{1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.

Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Vier Stunden nach der Induktion bzw. am nächsten Tag 
wurden die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet.

\subsubsection{Präparative Expression}
\label{sec:praeparative_expression}
Die heterologe Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} erfolgte mit den in den Expressionsstudien als besonders geeignet explorierten Bedingungen.
Als Expressionsstamm kam \acs{E. coli} BL21 (DE3) zum Einsatz.

Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{100}{\milli\liter} Volumen in unschikanierten \SI{250}{\milli\liter}-Kolben angesetzt. Die 
Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der 
Hauptkulturen eingesetzt.

Hierfür wurden \SI{2}{\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{500}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer 
\acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.

Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Am nächsten Tag wurden
die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet. Die Zellpellets wurden in \SI{4}{\gram}-Aliquots
in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für weitere Versuche bei \SI{-80}{\celsius} gelagert.

\section{Präparative Methoden}
\label{sec:praeparative_methoden}

Aufgrund der Kältelabilität der \acs{PPDK}, welche bei der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} besonder ausgeprägt ist \citep{Burnell1990}, wurden alle
Schritte des Zellaufschlusses und der Reinigung -- wenn nicht abweichend angegeben -- bei Raumtemperatur durchgeführt.

\subsection{Zellaufschluss}
\label{sec:zellaufschluss}
Ein Aliquot eingefrorener Zellen (siehe~\ref{sec:praeparative_expression}) wurde bei Raumtemperatur mit \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer, 
sowie einer Spatelspitze DNAse I (Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt und durch Vortexen resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch Hochdruckdispersion
bei einem Druck von \SI{1,35}{\kilo\bar} und einer Temperatur von \SI{15}{\celsius}.

\subsection{Proteinaufreinigung durch Affinitätschromatographie}
\label{sec:affinitaetschromatographie}
Proteine, die mit einem Poly-Histidin-Tag markiert sind, lassen sich über eine \acf{IMAC} aus
einem Proteingemisch isolieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden HisTrap$^\text{\textregistered}$ HP-Säulen mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter}
eingesetzt. Als Säulenmaterial dient quervernetzte Agarose an welche \acf{IDA} immobilisiert ist. \ce{Ni2+}-Ionen werden von \acs{IDA} dreifach koordinativ
komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion Poly-Histidin-markierter Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni2+}-Ionen zur
Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über die Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu
Histidin in der Lage ist, dieses kompetitiv aus der Bindung mit \ce{Ni2+} zu verdrängen. Das nachfolgend beschriebene Reinigungsprotokoll wurde nach \citet{Nakanishi2003,Chastain1996}
adaptiert.

Die wie in \ref{sec:zellaufschluss} beschrieben aufgeschlossenen Zellen wurden zunächst  bei \SI{10000}{\xg} und \SI{15}{\celsius} für \SI{30}{\minute}
zentrifugiert um Zelltrümmer und \textit{Inclusion-Bodies} zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{100000}{\xg} und \SI{15}{\celsius}
ulrazentrifugiert um lediglich lösliche Proteine im Überstand zu halten und Membranfragmente zu präzipitieren.

Die mit \ce{Ni2+} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \acs{ddH2O} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende
\ce{Ni2+} von der Säule zu eluieren und die Bildung von amorphem Nickel bei der nachfolgenden Benutzung der Puffer mit reduzierend wirksamen \acs{DTT}
zu minimieren. 

Die Säule wurde mit Waschpuffer äquilibriert und das Zelllysat mit einer Flussrate von \SI{1,5}{\milli\liter\per\minute} auf die Säule geladen. Im Anschluss
Unspezifisch bindende Proteine wurde mit \SI{20}{\CV} Waschpuffer + \SI{50}{\milli\Molar} Imidazol von der Säule gelöst. Die Elution der \acs{PPDK} erfolgte dann mit je \SI{10}{\CV} Waschpuffer + \SI{150}{\milli\Molar}, \SI{200}{\milli\Molar} und \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Es wurden Fraktionen 
mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} gesammelt und ggf. vereinigt. Zur Detektion der Proteinfraktionen wurde die Absorption bei \SI{280}{\nano\meter} verfolgt.

Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt und neu mit \ce{Ni2+} beladen.

\subsection{Konzentrierung von Proteinlösungen}
\label{sec:konzentrierung}
Proteinlösungen wurden durch zentrifugale Ultrafiltration bei \SI{20}{\celsius} und \SI{5000}{\xg} aufkonzentriert. Hierbei kamen Konzentratoren mit einer Ausschlussgröße 
von \SI{30}{\kilo\dalton} zu Einsatz.

\subsection{Entsalzung von Proteinlösungen}
\label{sec:entsalzung}
Nach der Reinigung wurden Fraktionen, welche die \acs{PPDK} enthielten mittels Ultrafiltration (vgl.~\ref{sec:konzentrierung}) auf ein Volumen
von etwa \SI{2,5}{\milli\liter} eingeengt. Zur Umpufferung des Konzentrats in Lagerungspuffer kam eine PD-10-Säule zum Einsatz. Es handelt sich
hierbei um eine Größenauschlusschromatographie-Säule, bei welcher die Proteinanteile der Lösung eine wesentlich geringere Retentionszeit aufweisen,
als die gelösten Salzionen und somit mit einem geringeren Volumen von der Säule eluieren.

Die Säule wurde mit \SI{25}{\milli\liter} Lagerungspuffer äquilibriert und anschließend mit der konzentrierten Probe beladen. Anschließend wurde die 
Differenz des Probenvolumens zu \SI{2,5}{\milli\liter} durch Lagerungspuffer ausgeglichen. Die Elution erfolgte mit \SI{3,5}{\milli\liter} 
Lagerungspuffer. Die entsalzten Proben wurden erneut aufkonzentriert (vgl.~\ref{sec:konzentrierung}).

\subsection{Lagerung von PPDK-Konzentraten}
\label{sec:lagerung}
Die kurzfristige Lagerung (max.~\SI{24}{\hour}) entsalzter \acs{PPDK}-Konzentrate (vgl.~\ref{sec:entsalzung}) erfolgte nach Zugabe von \SI{1}{\percent}iger
\ac{NaN3}-Lösung im Verhältnis 1:1000 bei Raumtemperatur.

Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v) Glycerin bei \SI{-20}{\celsius} gelagert.

\section{Analytische Methoden}
\label{sec:analytische_methoden}

\subsection{Differentielle Zentrifugation}
\label{sec:differentielle_zentrifugation}

 Nach dem Zellaufschluss (vgl.~\ref{sec:zellaufschluss}) wurde eine Probe von \SI{10}{\micro\liter} aus dem Homogenisat als Kontrolle entnommen.
 Anschließend wurde das Homogenisat bei \SI{2000}{\xg} für \SI{15}{\minute} bei \SI{15}{\celsius} zentrifugiert. Das resultierende Pellet 
 wurde im gleichen Volumen Aufschlusspuffer unter Zusatz von \SI{0,1}{\percent} (w/v) \acs{SDS} bei Raumtemperatur und unter Rühren rückgelöst.

 Es wurden jeweils vom Überstand, als auch vom resuspendierten Pellet weitere Proben von \SI{10}{\micro\liter} Volumen entnommen. Diese 
 wurden mit \SI{25}{\micro\liter} \acs{SDS}-Probenpuffer und \SI{65}{\micro\liter} \acs{ddH2O} versetzt. Alle weiteren Zentrifugationsschritte 
 erfolgten hierzu analog und sind in Tabelle \ref{tab:differentielle_zentrifugation} aufgeführt.
%
\begin{table}[htb]
 \centering
 \caption{Zentrifugationsschritte der differentiellen Zentrifugation}
 \begin{tabularx}{0.85\textwidth}{rcX}
  \toprule
   \textbf{\acs{rcf} [\si{\xg}]} & \textbf{Dauer [\si{\minute}]} & \textbf{Sediment}\\
  \midrule
   2000   & 15 & Nicht aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer\\
   10000  & 30 & Aggregierte Proteine (\textit{Inclusion Bodies})\\
   30000  & 30 & Große Membransysteme und assoziierte Proteine\\
   100000 & 60 & Kleine Membransysteme und assoziierte Proteine\\
  \bottomrule
 \end{tabularx}
 \label{tab:differentielle_zentrifugation}
\end{table}

\subsection{Größenauschlusschromatographie}
\label{sec:groessenausschluss}
Um die Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmen, wurde ein entsalztes Konzentrat (vgl.~\ref{sec:entsalzung}) nach der Reinigung mittels 
\acs{IMAC} (vgl.~\ref{sec:affinitaetschromatographie}) einer analytischen Größenausschlusschromatographie unterzogen. Hierbei dient die Säulenmatrix
als Molekularsieb. Höhermolekulare Anteile eluieren hierbei schneller von der Säule, als niedermolekulare Anteile, da letztere in die Poren des
Säulenmaterials eindringen können.

In dieser Arbeit wurde eine Superdex 200 5/150 GL-Säule der Firma GE Healthcare (Uppsala, SE) mit einem Säulenvolumen von \SI{3}{\milli\liter} 
eingesetzt.

Die Säule wurde mit \SI{5}{\CV} Lagerungspuffer äquilibriert und anschließend mit \SI{50}{\micro\liter} Probe in Lagerungspuffer beladen. Die
Detektion erfolgte durch Absorptionsmessung bei \SI{280}{\nano\meter}. Eluiert wurde mit \SI{2}{\CV} Lagerungspuffer bei einer Flussrate von 
\SI{0,2}{\milli\liter\per\minute}.

\subsection{SDS-\acl{PAGE}}
\label{sec:sds_page}
Die Proteinproben wurden auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen und dort nach ihrer Masse aufgetrennt
\citep{Laemmli1970}. Durch die Zugabe von \ac{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einr negativen
Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Somit ist die Wanderungsgeschwindigkeit
im elektrischen Feld allein von der Proteinmasse abhängig. Vor dem Auftragen auf das Geld wurden alle Proben mit 
4\texttimes-Probenpuffer versetzt. Expressionsproben wurden darüber hinaus für \SI{10}{\minute} auf \SI{95}{\celsius} erhitzt.
Im Falle der Expressionsproben errechnete sich das Auftragungsvolumen für große bzw. kleine Gele nach Gleichung \eqref{eq:page_gross} und \eqref{eq:page_klein}.
%
\begin{align}
 \label{eq:page_gross}
 V_\text{groß}~[\si{\micro\liter}] &= \frac{15}{OD_{600}}\\
 \label{eq:page_klein}
 V_\text{klein}~[\si{\micro\liter}] &= \frac{15}{OD_{600}} \ \cdot 0,75
\end{align}
%
Für die Elektrophorese wurden \SI{10}{\percent}ige Gele eingesetzt. Tabelle \ref{tab:pipettierschema_sds_page} zeigt exemplarisch eine
Pipettierschema für drei kleine Gele (\SI{9}{\centi\meter}~\texttimes~\SI{10}{\centi\meter}).
%
\begin{table}[htb]
\centering
\caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
\begin{tabular}{lSsSs}
\toprule
 & \multicolumn{2}{c}{\textbf{Trenngel}} & \multicolumn{2}{c}{\textbf{Sammelgel}}\\
\midrule
 \acs{AA/BAA} 30                   &  10,9               & \milli\liter  &   2    & \milli\liter \\
 Trenn-/Sammelgelpuffer            &  13,2               & \milli\liter  &   2,5  & \milli\liter \\
 \acs{ddH2O}                       &   8,6               & \milli\liter  &   7,4  & \milli\liter \\
 \acs{TEMED}                       &  16,5               & \micro\liter  &  12,3  & \micro\liter \\
 \acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & 112,2               & \micro\liter  & 129    & \micro\liter \\
\bottomrule
% \toprule
%                                   & {\textbf{Trenngel}} &               & {\textbf{Sammelgel}} & \\
% \midrule
% \acs{AA/BAA} 30                   &  10,9               & \milli\liter  &   2    & \milli\liter}\\
% Trenn-/Sammelgelpuffer            &  13,2               & \milli\liter  &   2,5  & \milli\liter}\\
% \acs{ddH2O}                       &   8,6               & \milli\liter  &   7,4  & \milli\liter}\\
% \acs{TEMED}                       &  16,5               & \micro\liter  &  12,3  & \micro\liter}\\
% \acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & 112,2               & \micro\liter  & 129    & \micro\liter}\\
% \bottomrule
\end{tabular}
\label{tab:pipettierschema_sds_page}
\end{table}
%
Um die Größenzuordnung der Proteinbanden zu gewährleisten, wurden die in \ref{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren} genannten
Standards eingesetzt. Bei kleinen Gelen wurde nach dem Beladen für \SI{1}{\hour} eine Stromstärke von \SI{35}{\milli\ampere} je Gel angelegt.
Größe Gele liefen über Nacht bei \SI{50}{\milli\ampere}.

\subsection{Kolloidale Coomassie-Färbung}
\label{sec:faerbung_coomassie}
Mit der kolloidalen Coomassie-Färbung nach \citet{Kang2002} lassen sich Proteine in Polyacrylamid-Gelen bis zu einer Nachweisgrenze von etwa \SI{1}{\nano\gram} 
detektieren. Sie ist damit ähnlich sensitiv wie eine Silberfärbung.

Die Gele wurden drei Mal für jeweils \SI{10}{\minute} in \acs{ddH2O} gewaschen und anschließend für mindestens \SI{2}{\hour} in der Färbelösung
inkubiert. Nach dieser Zeit sind etwa \SI{90}{\percent} der maximalen Farbintensität erreicht \citep{Kang2002}. Eine Entfärbung des Hintergrunds kann durch mehrfaches
Waschen mit \acs{ddH2O} erreicht werden.

\subsection{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen}
\label{sec:westernblot}
Über einen Westernblot können Proteine aus einem SDS-Gel elektrophoretisch auf einen Membran übertragen und dort fixiert werden. 
Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteine auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das 
Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.

Bei Gelen, welche für einen Westernblot vorgesehen waren, kam ein gefärbter Proteingrößenstandard zum Einsatz. Das Gel wurde für etwa 
\SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die benötigten Filterpapiere, sowie die Nitrozellulosemembran wurden ebenfalls kurz in 
Transferpuffer getränkt.

Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolgt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen 
Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von 
\SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.

Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in \acs{TBS} auf einem 
Rotationsschüttler inkubiert. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute} an.

Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-\acs{HRP}-Antikörper im Verhältnis 1:10000 
enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten 
zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper ließ sich über die gekoppelte 
Meerrettich-Peroxidase (\acs{HRP}) mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. die \acs{HRP} oxidiert in Anwesenheit von 
Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es zu einer Lichtemission kommt.

Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor 
(LAS 4000 mini, Fujifilm) eingesetzt.


\subsection{Konzentrationsbestimmung von Proteinen}
\label{sec:konzentrationsbestimmung_proteine}
Die Konzentration von Proteinen wurde nach \citet{Bradford1976} bestimmt. Hierzu wurde in einer Mikrotiterplatte \SI{50}{\micro\liter} einer
Verdünnung der zu vermessenden Proteinlösung mit \SI{200}{\micro\liter} Bradford-Reagenz aus dem Roti$^{\text{\textregistered}}$-Quant-Kit versetzt.
Die Probe wurde für \SI{5}{\minute} bei Raumtemperatur inkubiert und die Absorption bei \SI{595}{\nano\meter} gemessen.

Die Berechnung der Proteinkonzentration erfolgte anhand einer mit bovinem Serumalbumin \acs{BSA} erstellten Kalibriergeraden. Alle Messungen erfolgten in Dreifachbestimmung.

\subsection{\acl{CD}-Spektroskopie}
\label{sec:cd_spektroskopie}
Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken 
ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen 
weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$ 
auf, wobei letztlich ihre Differenz \textDelta\textepsilon~gemessen und als Elliptizität \texttheta~angegeben wird -- d sei die Schichtdicke und c 
die Konzentration \citep{Greenfield2007}:
%
 \begin{equation}
  \theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
 \end{equation}
%
Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von 
\SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n~\textrightarrow~\textpi$^*$ bzw. 
\textpi~\textrightarrow~\textpi$^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr 
empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{Greenfield2007}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration 
von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und 
Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.

\subsection{Aktivitätsassay}
\label{sec:aktivitaetsassay}
Um die Aktivität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmten, wurde ein Aktivitätsassay \citep{Salahas1990} durchgeführt. Hierbei wurde \ac{PEP}-Bildung
in einem gekoppelten Enzymassay über den \acs{NADH}"=Verbrauch verfolgt. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist in diesem Fall die Umsetzung
von Pyruvat, anorganischem Phosphat und \acs{ATP} zu \acl{PEP}, \acs{AMP} und Pyrophosphat \eqref{eq:aktivitaet_1}. Nachfolgend wird \acl{PEP} durch
die \acl{PEPCase} über eine \textbeta-Carboxylierung mit Hydrogencarbonat zu Oxalacetat umgesetzt \eqref{eq:aktivitaet_2}. Letzteres wird durch eine
NAD-abhängige Malatdehydrogenase zu Malat reduziert \eqref{eq:aktivitaet_3}.
%
 \begin{align}
  \cee{
       \label{eq:aktivitaet_1}
       \text{Pyruvat} + ATP + P_i <=>[PPDK] PEP + AMP + PPi\\
       \label{eq:aktivitaet_2}
       PEP + HCO3- ->[PEPCase] \text{Oxalacetat} + Pi \\
       \label{eq:aktivitaet_3}
       \text{Oxalacetat} + NADH <=>[NAD-MDH] \text{Malat} + NAD
      }
 \end{align}
%
Der \acs{NADH}-Verbrauch kann photometrisch über die Abnahme der \acs{NADH}"=spezifischen Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} verfolgt werden. Da der
Verbrauch eines \acs{NADH}-Moleküls gleichbedeutend ist mit der Bildung eines \acl{PEP}-Moleküls durch die \acs{PPDK}, kann aus dem Verbrauch an
\acs{NADH} direkt auf die Bildungsrate von \acl{PEP} und somit auf die Aktivität der \acs{PPDK} geschlossen werden.

Der Reaktionsansatz nach \citet{Salahas1990} (vgl.~\ref{sec:puffer_aktivitaetsassay}) wurde mit \SI{0,5}{\micro\liter} gereinigtem und entsalztem 
\acs{PPDK}-Konzentrat versetzt. Die \acs{PPDK}-Lösung wurde zuvor für \SI{30}{\minute} bei \SI{30}{\celsius} inkubiert, um eine möglichst vollständige
Aktivierung zu erreichen \citep{Ashton1990}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{2,5}{\milli\liter} einer \SI{100}{\milli\Molar} \acs{ATP}-Lösung 
(Endkonzentration: \SI{1,25}{\milli\Molar}) gestartet und die Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} über einen Zeitraum von \SI{3}{\minute} bei \SI{30}{\celsius}
aufgezeichnet.

Der Verbrauch an \acs{NADH} kann über das Lambert-Beer'sche Gesetz in Gleichung \eqref{eq:lambert_beer} aus der gemessenen Extinktion mit Hilfe des molaren Extinktionskoeffizienten für NADH 
$\epsilon_{340} = \SI{6,3e3}{\per\Molar\per\centi\meter}$ \citep{McComb1976} und der Schichtdicke berechnet werden.
%
\begin{samepage}
 \begin{align}
  \label{eq:lambert_beer}
  E = \epsilon \cdot c \cdot d
  \intertext{$\epsilon$: molarer Extinktionskoeffizient \newline $c$: Konzentration \newline $d$: Schichtdicke}\nonumber
 \end{align}
\end{samepage}
%
\section{Bioinformatische Methoden}
\label{sec:bioinformatische_methoden}

\subsection{Analyse von \ac{CD}-Spektren}
\label{sec:analyse_cd_spektren}
Aufgenommene CD-Spektrem (siehe \ref{sec:cd_spektroskopie}) wurden mit dem Programmpaket \textit{CDPro} \citep{Sreerama2000}, sowie
dem Programm \textit{K2D3} \citep{Louis-Jeune2011} untersucht. Die Analyse erfolgte jeweils in einem Wellenlängenbereich von \SIrange{190}{240}{\nano\meter}.
Für das Programmpaket \textit{CDPro} wurde die Datenbank SMP56 mit 43 löslichen und 13 Membranproteinen als Grundlage der Vorhersage verwendet.
Die berechneten Sekundärstrukturanteile wurden dann mit mit einer \textit{ab initio} Vorhersage, welche mit \acs{SOPMA} \citep{Geourjon1995a} 
berechnet wurde verglichen. Zusätzlich wurden die Sekundärstrukturanteile aus der bereits bekannten \acs{PPDK}-Struktur aus \textit{Zea mays} 
herangezogen.

\subsection{Alignment von Nuklein- und Aminosäuresequenzen}
\label{sec:alignment}
Alignments von Nuklein- und Aminosäuren wurden mit dem Programm \textit{T-Coffee} \citep{Notredame2000,Wallace2006,Moretti2007,DiTommaso2011} erstellt. Das Programm \textit{Bowtie 2} 
\citep{Langmead2012} kam zum Einsatz, um \textit{Reads} aus der Sequenzierung an die Referenzsequenz zu alignieren.

\subsection{Erstellung von Homologiemodellen}
\label{sec:erstellung_homologiemodell}
Zur Visualisierung der wahrscheinlichen dreidimensionalen Struktur der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} und zur Vorbereitung zukünftiger Analysen
wurden Homologiemodelle erstellt. Diese basieren auf den aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBG/1VBH) und \textit{Chlostridium symbiosum} (PDB: 1KBL) bekannten 
Extremkonformationen des putativen \textit{Domain-swiveling}-Mechanismus.

Jeweils fünf Homologiemodelle wurden mit dem Programm \textit{Modeller} \citep{Sali1993a} aus den jeweiligen Templaten und der Primärstruktur der 
\acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Rosche1990} generiert. Im Falle des von \textit{Zea mays} abgeleiteten Modells wurde als Vorlage die Pyruvat gebundene Struktur
verwendet (PDB: 1VBH). Lücken in der dreidimensionalen Struktur wurden anhand der ungebundenen Struktur (PDB: 1VBG) ergänzt. Um die Substratbindetasche möglichst
exakt zu nachzubilden, wurde das in der Kristallstruktur 1VBH vorhandene \acs{PEP}-Molekül, sowie das \ce{Mg2+}-Ion beim Modellieren berücksichtigt.

Die Evaluation der erstellten Modelle erfolgte mit dem Programmpaket \textit{PROCHECK} \citep{Laskowski1993,Laskowski1996}.
