\chapter{Material und Methoden}
\section{Material}
\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
\label{sec:geraete_hilfsmittel}
 \begin{singlespace}
 \begin{longtable}{p{0.5\textwidth} p{0.45\textwidth}}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  Analysen-/Präzisionswaagen                               & Sartorius, Göttingen\\
  Autoklav                                                 & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
  Automatische Pipetten                                    & Gilson, Bad Camberg\\
  \acs{CD}-Spektrometer J-715                              & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
  Chromatographiesystem \newlineÄKTAprime plus             & GE Healthcare, Freiburg \\
  DNA-Gelkammersystem PerfectBlue                          & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
  Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry'                    & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
  Gelsysteme für große Gele                                & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
  Inkubationsschüttler INNOVA 44R                          & New Brunswick, Nürtigen\\
  Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP                            & Beckman Coulter, Krefeld\\
  Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R                          & Eppendorf, Hamburg\\
  Image Analyzer LAS-4000 mini                             & Fujifilm, Düsseldorf\\
  Magnetrührer MR 3000/3001                                & Heidolph, Schwabach\\
  Microplate Reader Infinite 200 PRO                       & Tecan, Crailsheim \\
  Mikrozentrifuge Minispin                                 & Eppendorf, Hamburg\\
  Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage                      & Millipore, Schwalbach\\
  Minishaker MS 2                                          & IKA, Staufen\\
  Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti                   & Beckman Coulter, Krefeld\\
  Taumelschüttler Polymax 1040                             & Heidolph, Schwalbach\\
  Thermomixer compact/comfort                              & Eppendorf, Hamburg\\
  Ultrazentrifuge Optima L-80 XP                           & Beckman Coulter, Krefeld\\
  Zellaufschlusssystem 'One-Shot'                          & Constant Systems, Daventry, UK\\
  \bottomrule
 \end{longtable}
 
\subsection{Verbrauchsmaterialien}
\label{sec:verbrauchsmaterialien}

%\begin{center}
 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  Chromatographiepapier 3MM Chr                                   & Whatman, Maidstone, UK\\
  Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25                            & GE Healthcare, Freiburg\\
  Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter}  & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
  \acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter}                & GE-Healthcare, Freiburg\\
  Mikrotiterplatten                                               & Hartenstein, Würzburg\\
  Petrischalen                                                    & Hartenstein, Würzburg\\
  Pipettenspitzen                                                 & Brand, Wertheim\\
  Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One,\newline Frickenhausen\\
  Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter})                  & Merck, Bruchsal\\
  \bottomrule
 \end{tabularx}
 
 \subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren}
 \label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren}

%\begin{center}
 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  \acs{BSA}-Standard (\SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter})        & Qiagen, Hilden\\
  \acs{DNA} \SI{1}{\kb}/\SI{100}{\bp} Ladder                      & New England Biolabs, Frankfurt\\
  PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained)                 & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\
  \bottomrule
 \end{tabularx} 
\end{singlespace}

\section{Methoden}
\label{sec:methoden}

\subsection{DNA-Konzentrationsbestimmung}
\label{sec:dna_konzentrationsbestimmung}
Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
\begin{align}
  \text{OD}_{600} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
  \label{eq:dna_konz}
\end{align}

\SI{2}{\micro\liter} der Probe und des verwendeten Puffers werden hierbei auf einer NanoQuant-
Platte im Mikroplatten-Lesegerät vermessen und die Konzentration aus der Differenz
aus Probe und Puffer gemäß Gleichung \ref{eq:dna_konz} berechnet.

\subsection{\acl{PCR}}
\label{sec:pcr}
Mit Hilfe der \ac{PCR} konnen Nukleinsäurefragmente gezielt
vervielfaltigt werden. Die Spezifität der Reaktion ist hierbei durch die Auswahl der
eingesetzten Primer gegeben.
Eine PCR gliedert sich grundsätzlich in drei aufeinanderfolgende Phasen: Während
der Denaturierung bei \SI{95}{\celsius} wird der Doppelstrang in die beiden Einzelstränge
aufgespalten. Das Annealing bei \SIrange{50}{60}{\celsius} führt zur Anlagerung der Primer an die
komplementären Sequenzabschnitte der Einzelstränge des Templates. Die exakte
Temperatur ist hierbei von den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer abhängig.
Während der Elongationsphase erfolgt die Synthese neuer Komplementärstränge
ausgehend von den Primern durch eine DNA-Polymerase.
Durch eine mehrfache Wiederholung kann die Ziel-DNA in kurzer Zeit exponentiell
vervielfacht werden.

\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
\label{sec:inserts_slic}
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} wurde mittels einer \ac{PCR} nach folgendem
Ansatz durchgeführt:
\begin{description}
 \item[\ac{PCR}-Ansatz (\SI{50}{\micro\liter})] \hfill \\
  \SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
  \SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
  \SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
  \SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
  \SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (peqlab, Erlangen) \\
  \SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
  ad \SI{50}{\micro\liter} dH2O
\end{description}
Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
des zum \ac{PPDK}-Gen homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.
\begin{table}
\centering
\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
\begin{tabular}{ccc}
\toprule
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit [\si{\minute}]} & \textbf{Zyklen}\\
\midrule
95 & 5 & \multirow{4}{*}{10} \\
95 & 1 & \\
46 & 1 & \\
72 & 5 & \\
\midrule
95 & 1 & \multirow{3}{*}{20} \\
65 & 1 & \\
72 & 5 & \\
\midrule
95 & 10 & 1 \\
\bottomrule
\end{tabular}
\label{tab:slic_cycler}
\end{table}

\subsection{\acf{SLIC}}
\label{sec:slic}
Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren, welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.

Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I (New England Biolabs, Frankfurt) linearisiert. Hierfür wurden in einem Gesamtvolumen von \SI{25}{\micro\liter} \SI{4000}{\nano\gram} Plasmid-\acs{DNA} für \SI{2}{\hour} bei \SI{22}{\celsius} nach Herstellerangaben gedaut.

Der linearisierte Vektor wurde anschlieend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst.

Die für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.

Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:

\begin{description}
 \item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
 x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~\textequiv~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
 \SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
 \SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 \SI{1}{\Unit} T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{dH2O}
\end{description}

Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von \SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{3,5}{\micro\liter} \ac{dCTP} gestoppt.

In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert DNA im zweifachen molaren Verhältnis (\SI{144}{\nano\gram}) eingesetzt:

\begin{description}
 \item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
 x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} \textequiv~\SI{150}{\nano\gram}\\
 y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} \textequiv~\SI{144}{\nano\gram}\\
 \SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{dH2O}
\end{description}


