\chapter{Ergebnisse}
\label{sec:ergebnisse}
%
\section{Klonierung}
\label{sec:erg_klonierung}
%
Sie \acs{SLIC}-Klonierung erfolgte wie in \ref{sec:slic} beschrieben. Zur Erhöhung der Translationsgeschwindigkeit und somit der Expressionsrate lag die für die \acs{PPDK} kodierende \acs{DNA} Sequenz Codon optimiert für \acs{E. coli} vor \citep{Ikemura1981}. Die mittels \acs{PCR} synthetisierten \textit{Inserts} (vgl.~\ref{sec:inserts_slic}), sowie der linearisierte Vektor (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}) wurden zur Reinigung auf ein Agarosegel aufgetragen (vgl. \ref{sec:agarose_gelelektrophorese}). Es ergab sich das in Abbildung \ref{abb:agarosegel_vektor_insert} gezeigte Auftrennungsmuster.
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
 \centering
 \includegraphics[keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/vektor_linear_text.png}
 % vektor_linear_text.png: 615x551 pixel, 300dpi, 5.21x4.67 cm, bb=0 0 148 132
 \caption{}
 \label{abb:linearisierter_vektor}
 \end{subfigure}
 %
 ~
 %
 \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
 \centering
 \includegraphics[keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/insert_pcr_text.png}
 % insert_pcr_text.png: 474x551 pixel, 300dpi, 4.01x4.67 cm, bb=0 0 114 132
 \caption{}
 \label{abb:}
\end{subfigure}
 \caption[Agarosegel zur Reinigung von Vektor und dem Insert]{Exemplarischer Ausschnitt aus dem Agarosegel zur Reinigung von 
                                                                                  linearisiertem Vektor (a) und dem Insert (b) zur SLIC-Klonierung.
                                                                                  Aufgetragen wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard (M) und 
                                                                                  je \SI{20}{\micro\liter} Probe (V bzw. I). Die erwarteten Größen sind \SI{5720}{\bp} (Vektor) 
                                                                                  und \SI{2691}{\bp} (Insert).}
 \label{abb:agarosegel_vektor_insert}
\end{figure}

Sowohl Vektor als auch Insert lagen innerhalb der erwarteten Größenordnung (\SI{5720}{\bp} bzw. \SI{2691}{\bp}), so dass beide wie in \ref{sec:slic}
beschrieben in den Ligationsansatz gegeben wurden. Zur Amplifikation des Vektors wurden dann \acs{E. coli} Zellen des Stamms XL1-Blue mit diesem transformiert 
(vgl. \ref{sec:transformation}) und auf Agarplatten angezogen. Mit einer Kolonie-PCR (vgl. \ref{sec:kolonie_pcr}) wurde überprüft, ob der untersuchte Klon
das korrekte Insert trägt. Das enstsprechende Gelbild ist in Abbildung \ref{abb:kolonie_pcr} dargestellt.
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/colony_pcr.png}
 % colony_pcr.png: 1586x1474 pixel, 300dpi, 13.43x12.48 cm, bb=0 0 381 354
 \caption[Agarosegel nach Kolonie-PCR]{Agarosegel nach Kolonie-PCR. Es wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard (M) und je \SI{20}{\micro\liter} Probe aufgetragen.
 Untersucht wurden 24 Klone, von denen fünf (10, 13, 22, 23 und 24) ein Plasmid mit der korrekten Größe tragen.}
 \label{abb:kolonie_pcr}
\end{figure}

Von untersuchten 24 Klonen wiesen fünf ein Plasmid auf, welches ein Insert der erwarteten Größe von \SI{2691}{\bp} trägt. Die fünf positiven Klone
wurden in \SI{5}{\milli\liter} Kulturrörchen über Nacht angezogen und die Plasmid-DNA mit dem \textit{QIAprep Spin Miniprep Kit} nach Herstellerangaben extrahiert.
Proben der isolierten Plasmid-\acs{DNA} wurden zur Sequenzierung eingeschickt (StarSEQ GmbH, Mainz). Es konnte gezeigt werden, dass das aus Klon \#22 isolierte
Plasmid im für die \acs{PPDK} kodierenden Bereich keine Mutation trägt. Eine Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk ist in Abbildung \ref{abb:plasmidkarte}
aufgeführt.
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/pETEV-16b-ppdk.pdf}
 % pETEV-16b-ppdk.pdf: 611x480 pixel, 72dpi, 21.55x16.93 cm, bb=0 0 611 480
 \caption[Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk]{Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk. Der für die \acs{PPDK} kodierende Bereich liegt zwischen Position 5392 und 8022.
          \textit{Upstream} befinden sich die kodierenden Sequenzen für die \acs{TEV}-Schnittstelle und den Hexa-Histidin-Tag. Die Plasmidkarte wurde mit 
          \textit{PlasMapper} \citep{Dong2004} erstellt.}
 \label{abb:plasmidkarte}
\end{figure}

\clearpage
\section{Expressionsstudien}
\label{sec:Expressionsstudien}
Die Expressionsstudien (vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) zeigten eine deutliche Überexpression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} BL21 (DE3) bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius} und 
einer \acs{IPTG}-Konzentration von \SI{0,1}{\milli\Molar} (vgl. Abbildung \ref{abb:expressionsstudie}). Der direkte Vergleich zwischen den beiden verwendeten
Expressionsstämmen BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3) (Abbildung \ref{abb:expressionsstudie_klein}) zeigt eine deutlich stärkere Überexpression in BL21 (DE3) bei
gleichzeitig geringerer IPTG-Konzentration. Eine Expression über Nacht führte zu einer deutlich höheren Proteinausbeute im Vergleich zu einer Zellernte nach 
\SI{4}{\hour}. Die Identifizierung der \acs{PPDK} erfolgte durch einen Westernblot (vgl. \ref{sec:westernblot}).
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_gross.png}
 % Expressionsstudie_19042012_gross.png: 2480x1828 pixel, 300dpi, 21.00x15.48 cm, bb=0 0 595 439
 \caption[\acs{SDS}-\acs{PAGE} der Expressionsstudien]{\acs{SDS}-\acs{PAGE} der Expressionsstudien. Aufgetragen wurden Proben der beiden Expressionsstämme 
          BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3) bei Induktion mit unterschiedlicher \acs{IPTG}-Konzentration und einer Temperatur von jeweils \SI{30}{\celsius}. 
          Angegeben sind die Zeitpunkte der Probenentnahme vom Zeitpunkt der Induktion an. Der Größenbereich der \acs{PPDK} ist rot hervorgehoben.}
 \label{abb:expressionsstudie}
\end{figure}
%
\begin{figure}[H]
 \centering
 \begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
  \centering
  \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_klein.png}
  % Expressionsstudie_19042012_klein.png: 2480x2894 pixel, 241dpi, 26.13x30.49 cm, bb=0 0 741 864
  \caption{}
  \label{abb:expressionsstudie_klein_sds}
 \end{subfigure}
% 
 ~
% 
  \begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
  \centering
  \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_klein_blot.png}
  % Expressionsstudie_19042012_klein_blot.png: 2480x2894 pixel, 241dpi, 26.13x30.49 cm, bb=0 0 741 864
  \caption{}
  \label{abb:expressionsstudie_klein_blot}
 \end{subfigure}
 \caption[Vergleich der Expression in BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3)]{Vergleich der Expression in BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3). SDS-PAGE (a) und Westernblot (b). Aufgetragen wurden
         Expressionsproben nach \SI{0}{\hour} und \SI{4}{\hour} nach Induktion, sowie über Nacht. Verglichen wurden die Expressionsreihen mit dem jeweils besten
         Expressionsergebnis in BL21 (DE3) bzw. BL21 Gold (DE3). Die Induktion erfolgte mit \SI{0,1}{\milli\Molar} bzw. \SI{1}{\milli\Molar} IPTG.}
 \label{abb:expressionsstudie_klein}
\end{figure}
\clearpage

\section{Differentielle Zentrifugation}
\label{sec:ergebnisse_dz}

Im Rahmen der Expressionsstudien wurden Zellen von \acs{E. coli} BL21 (DE3) nach \SI{4}{\hour} bzw. nach einer Übernachtexpression geerntet, aufgeschlossen
und einer differentiellen Zentrifugation unterzogen (vgl. \ref{sec:differentielle_zentrifugation}). Die Proben wurden mittels eines Westernblots ausgewertet 
(Abbildung \ref{abb:dz}). Hierbei zeigte sich, dass der überwiegende Anteil der \acs{PPDK} in den Überstandsfraktionen lokalisiert und somit löslich ist.
Nur ein geringer Anteil befindet sich in den Pellets nach der Zentrifugation.

\begin{figure}[H]
 \centering
 \begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
  \centering
  \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/03052012_4h_2min.png}
  % 03052012_4h_2min.png: 2480x2254 pixel, 300dpi, 21.00x19.08 cm, bb=0 0 595 541
  \caption{}
  \label{abb:dz_4h}
 \end{subfigure}
 %
 ~
 %
 \begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
  \centering
  \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/03052012_üN_2min.png}
  % 03052012_üN_2min.png: 2480x2141 pixel, 300dpi, 21.00x18.13 cm, bb=0 0 595 514
  \caption{}
  \label{abb:dz_on}
 \end{subfigure}
 \caption[Westernblots der differentiellen Zentrifugation]{Westernblots der differentiellen Zentrifugation. Die Zellen wurden nach \SI{4}{\hour} (a) bzw. nach 
          einer Übernachtexpression (b) geerntet. Aufgetragen wurden \SI{3}{\micro\liter} Marker (M), Probe nach Zellaufschluss (A), sowie Pellets (P) und Überstände (Ü) der 
          Zentrifugationsschritte (jeweils \SI{10}{\micro\liter}).}
 \label{abb:dz}
\end{figure}
\clearpage

\section{Native Reinigung der \acs{PPDK}}
\label{sec:ergebnisse_reinigung}

Die Reinigung der \acs{PPDK} erfolgte wie in \ref{sec:affinitaetschromatographie} beschrieben. Im Verlauf der Reinigung konnten vier Proteinfraktionen bei Elution
mit \SIlist{50;150;200;250}{\milli\Molar} Imidazol identifiziert werden (vgl. Abbildung \ref{abb:chromatogramm_aff}). In einer nachfolgend durchgeführten
\acs{SDS}-\acs{PAGE} mit Westernblot zeigte sich, dass drei Fraktionen (\SIlist{150;200;250}{\milli\Molar}) \acs{PPDK} in hoher Reinheit enthielten (Abbildung \ref{abb:reinigung_sds}).
%
\begin{figure}[H]
 \centering
 \includegraphics[width=0.9\textwidth,keepaspectratio=true]{img/ergebnisse/aekta/20062012.eps}
 \caption[Chromatogramm der \acs{PPDK}-Reinigung mittels \acs{IMAC}]{Chromatogramm der \acs{PPDK}-Reinigung mittels \acs{IMAC}. Dargestellt sind die Absorption bei 
          \SI{280}{\nano\meter} (schwarz) und die Imidazolkonzentration (rot). Die gesammelten \acs{PPDK}-Fraktionen sind durch Pfeile markiert.}
 \label{abb:chromatogramm_aff}
\end{figure}
%
\begin{table}[H]
\centering
\caption[\acs{PPDK}-Konzentration und Ausbeute nach Reinigung]{\acs{PPDK}-Konzentration und Ausbeute nach Reinigung. Die Konzentrationen beziehen sich auf den erreichten 
Wert nach Einengen der fraglichen Fraktionen auf ein Volumen von \SI{500}{\micro\liter}.}
\label{tab:ausbeute}
 \begin{tabular}{lS[seperr,table-format=2.3(3)]S[seperr,table-format=2.3(3)]S[seperr,table-format=2.3(3)]}
  \toprule
   \textbf{Fraktion} & \multicolumn{1}{c}{\textbf{c(PPDK) [\si{\milli\gram\per\milli\liter}]}} & \multicolumn{1}{c}{\textbf{m(PPDK) [\si{\milli\gram}]}} & \multicolumn{1}{c}{$\frac{\textbf{m(PPDK)}}{\textbf{V(Kultur)}}$ \textbf{[\si{\milli\gram\per\liter}]}}\\
  \midrule
   1 (\SI{150}{\milli\Molar}) & 8,078(1812)  & 4,039(906)   & 10,098(2265)\\
   2 (\SI{200}{\milli\Molar}) & 48,935(2556) & 24,466(1278) & 61,165(3195)\\
   3 (\SI{250}{\milli\Molar}) & 37,536(1334) & 18,768(667)  & 46,920(1693)\\
  \bottomrule
 \end{tabular}
\end{table}
%
Die gesammelte PPDK-Fraktionen bei Elution mit \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol ließ sich bis auf \SI[seperr]{37,54(134)}{\milli\gram\per\milli\liter} konzentrieren. 
In der Expression konnten aus \SI{2}{\liter} Kultur \SI{20}{\gram} Zellen geerntet werden. Da im Zuge der Reinigung \SI{4}{\gram} Zellen aufgeschlossen wurden, ergibt sich eine Ausbeute von etwa 
\SI{47}{\milli\gram\per\liter}~Kultur (vgl. Tabelle \ref{tab:ausbeute}).

\begin{figure}[H]
 \centering
  \begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
   \centering
   \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Reinigung_02072012.png}
   % Reinigung_02072012.png: 2480x2338 pixel, 300dpi, 21.00x19.80 cm, bb=0 0 595 561
   \caption{}
   \label{abb:reinigung_sds_a}
  \end{subfigure}
%
~
%
  \begin{subfigure}[b]{0.48\textwidth}
   \centering
   \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Reinigung_02072012_blot.png}
   % Reinigung_02072012.png: 2480x2338 pixel, 300dpi, 21.00x19.80 cm, bb=0 0 595 561
   \caption{}
   \label{abb:reinigung_sds_b}
  \end{subfigure}
  \caption[\acs{SDS}-\acs{PAGE} und Westernblot der nativen Reinigung]{\acs{SDS}-\acs{PAGE} (a) und Westernblot (b) der nativen Reinigung. Aufgetragen wurden \SI{3}{\micro\liter} Marker (M), \SI{1}{\micro\liter} 
           der Proben des Zelllysates (A), sowie der Zentrifugationen bei \SI{10000}{\xg} (10kÜ) bzw \SI{100000}{\xg} und \SI{10}{\micro\liter} des Durchflusses (D) und nachfolgenden Elutionsfraktionen. 
           Die \acs{PPDK}-Banden sind rot hervorgehoben (MW: \SI{98}{\kilo\dalton}). Beim Westernblot wurden Anti"=His"=HRP"=Antikörper in einer Verdünnung von 1:10000 verwendet.}
  \label{abb:reinigung_sds}
\end{figure}
%
\begin{figure}[H]
 \centering
 \includegraphics[width=0.87\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/aekta/11072012.eps}
 % 11072012.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=5 4 461 375
 \caption[Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie]{Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie. Die Kurvenverläufe wurden auf die jeweilige Konzentration normalisiert. Fraktion 3 zeigt ein monodisperses Profil, 
 während die \acs{PPDK} in den Fraktionen 1 und 2 in verschiedenen Oligomerisierungszuständen vorliegt. Vertikale Linien markieren die Position der \textit{Peaks}. Es wurde eine Superdex 200 5/150 GL"=Säule mit einem Volumen von \SI{3}{\milli\liter} eingesetzt.}
 \label{abb:chromatogramm_gefi}
\end{figure}
%
Zur Bestimmung der Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} wurden Proben aller drei Fraktionen mittels einer Größenausschlusschromatographie (vgl. \ref{sec:groessenausschluss}) analysiert.
Hierbei zeigte sich, dass lediglich die mit \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol eluierte Fraktion monodispers ist, während die mit \SIlist{150;200}{\milli\Molar} eluierten 
\acs{PPDK}-Fraktionen in multiplen Oligomerisierungsgraden vorlagen (vgl. Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}). Da einige der eingesetzten Eichproteine im verwendeten Puffer nicht stabil waren, konnte eine zuverlässige Größenzuordnung nicht vorgenommen werden. Somit können lediglich die \acs{PPDK}-Eluate untereinander verglichen werden. Deutlich zu erkennen sind aber insgesamt drei distinkte \textit{Peaks} bei einem Elutionsvolumen von \SIlist{1,28;1,68;1,97}{\milli\liter}. Das Ausschlussvolumen der Säule beträgt \SI{1,2}{\milli\liter}.

\section{\acs{CD}-Spektroskopie}
\label{sec:ergebnisse_cd}
Das \acs{CD}-Spektrum wurde wie in \ref{sec:cd_spektroskopie} beschrieben aufgenommen. Abbildung \ref{abb:cd_spektrum} zeigt das Spektrum nach Pufferkorrektur. Deutlich zu erkennen ist
ein negativer Cotton-Effekt im Bereich um \SI{210}{\nano\meter}, welcher auf \textalpha-helikale Strukturen hindeutet.
Anhand des experimentellen Spektrums wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit den Programmen SELCON3 \citep{Sreerama1993}, CONTINLL \citep{Provencher1981}, CDSSTR \citep{Johnson1999} und K2D3 \citep{Louis-Jeune2011} durchgeführt.
%
\begin{figure}[H]
 \centering
 \includegraphics[width=0.9\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd/cd.eps}
 % cd.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=2 4 468 375
 \caption[\acs{CD}-Spektrum von gereinigter PPDK]{\acs{CD}-Spektrum von gereinigter PPDK. Die \acs{PPDK} lag in einer Konzentration von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter} in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat"=Puffer mit
          \SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat vor. Es wurden 15 Spektren mit einer Auflösung von \SI{1}{\nano\meter} akkumuliert. Im Bereich um \SI{210}{\nano\meter} zeigt sich ein negativer
          Cotton-Effekt, welcher charakteristisch für \textalpha-helikale Strukturanteile ist. Farbig dargestellt sind die mit unterschiedlichen Programmen vorhergesagten Spektren.}
 \label{abb:cd_spektrum}
\end{figure}
%
\clearpage
Die daraus resultierenden, vorhergesagten Spektren sind ebenfalls in Abbildung \ref{abb:cd_spektrum} dargestellt. Alle verwendeten Algorithmen sagen das Spektrum qualitativ korrekt vorher, die geringsten Abweichungen vom experimentellen Spektrum ergeben sich für CONTINLL und CDSSTR, wobei ersteres allerdings die geringste Übereinstimmung mit den Sekundärstrukturanteilen aus der \textit{ab initio} Vorhersage und den Strukturdaten aus \textit{Zea mays} zeigt. Für die \acs{PPDK} werden in allen Fällen hohe \textalpha"=helikale Strukturanteile vorhergesagt, im Fall von CONTINLL jedoch nur ein sehr geringer Anteil an \textbeta"=Strands (vgl. Tabelle \ref{tab:cd}). Die \textit{ab initio} Vorhersage mit SOPMA, sowie die Ergebnisse von K2D3 und CDSSTR sind weitestgehend deckungsgleich mit den Strukturanteilen der PPDK aus \textit{Zea mays} (Tabelle \ref{tab:cd}).
%
\begin{table}[H]
 \caption[Vorhersage der Sekundärstrukturanteile]{Vorhersage der Sekundärstrukturanteile. Aufgeführt sind die vorhergesagten Strukturelemente anhand des \acs{CD}-Spektrums. Zum Vergleich dienen die Ergebnisse der sequenzbasierten \textit{ab initio} Vorhersage (SOPMA), 
          sowie die Sekundärstrukturanteile aus der Kristallstruktur der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBG).}
 \label{tab:cd}
 \begin{tabular}{lrrrr}
  \toprule
   \textbf{Algorithmus}     & \textbf{\textalpha-Helix [\si{\percent}]} & \textbf{\textbeta-Strand [\si{\percent}]} & \textbf{\textbeta-Turn [\si{\percent}]} & \textbf{Coil [\si{\percent}]} \\
  \midrule
   K2D3                     & 56                        & 18                           &                             &                               \\
   SELCON3                  & 56                        & 5                            & 17                          & 22                            \\
   CONTINLL                 & 68                        & 1                            & 14                          & 17                            \\
   CDSSTR                   & 51                        & 20                           & 15                          & 15                            \\
   \midrule
   SOPMA                    & 47                        & 17                           &  9                          & 27                            \\
   \midrule            
   PPDK (\textit{Zea mays}) & 47                        & 16                           &                             &                               \\
   \bottomrule
 \end{tabular}
\end{table}
\clearpage

\section{Aktivitätstest}
\label{sec:ergebnisse_aktivitaetsassay}
Um die Aktivität der gereinigten PPDK zu quantifizieren, wurden zunächst die beiden Fraktionen mit der höchsten \acs{PPDK}-Konzentration -- Fraktion~2 und Fraktion~3 (\SIlist{200;250}{\milli\Molar} Imidazol) -- untersucht (vgl. \ref{sec:aktivitaetsassay}). Hierbei zeigte sich im Vergleich zur Negativkontrolle, 
dass in beiden Fraktionen eine Aktivität zu verzeichnen ist (siehe Tabelle \ref{tab:aktivitaet}).
\begin{table}[H]
 \centering
 \caption[Aktivität der gereinigten PPDK-Fraktionen]{Aktivität der gereinigten PPDK-Fraktionen 2 und 3. Die Absorption bei \SI{340}{\nano\meter} wurde über einen Zeitraum von \SI{80}{\second} in Dreifachbestimmung aufgenommen. Anschließend wurde eine Tangente an die Messpunkte gelegt um die Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen. Der Vergleich der Negativkontrolle mit den beiden vermessenen Fraktionen zeigt eine deutliche Aktivität.}
 \label{tab:aktivitaet}
 \begin{tabular}{cS[seperr,table-format = 1.4(2)]S[seperr,table-format = 1.2(2)]}
  \toprule
  \textbf{Fraktion} & \textbf{Aktivität [\si{\micro\mole\per\minute}]} &\textbf{spez. Aktivität [\si{\Unit\per\milli\gram}]}\\
  \midrule
  Negativkontrolle                    & 0,0005(1)  & \\
  2 (\SI{200}{\milli\Molar} Imidazol) & 0,065(24)  & 0,31(12) \\
  3 (\SI{250}{\milli\Molar} Imidazol) & 0,037(6)   & 0,99(9) \\
  \bottomrule
 \end{tabular}

\end{table}

% \begin{figure}[H]
%  \centering
%  \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/aktivitaet.eps}
%  % aktivitaet.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=6 4 466 375
%  \caption[Aktivität der gereinigten PPDK]{Aktivität der gereinigten PPDK. Die Absorption bei \SI{340}{\nano\meter} wurde über einen Zeitraum von \SI{80}{\second} 
%           aufgenommen und auf die jeweilige PPDK-Konzentration, sowie das absolute Absorptionsmaximum normiert. Die Kontrolle enthielt anstelle der PPDK ein identisches
%           Volumen Puffer. Die beiden PPDK-Fraktionen weisen eine deutliche Absorptionsabnahme auf, während die Absorption der Kontrolle nahezu unverändert bleibt.}
%  \label{abb:aktivitaet}
% \end{figure}
Da hinsichtlich zukünftiger Kristallisationsexperimente
in erster Linie die monodispers vorliegende Fraktion 3 von Interesse ist, wurde von dieser Fraktion eine vollständige Reaktionskinetik aufgenommen. Hierbei ergaben 
sich durch Anpassen einer Sättigungsfunktion durch nichtlineare Regression an die Michaelis"=Menten"=Gleichung \eqref{eq:mm} für \acs{ATP} und Pyruvat ein \ce{K_M} von 
\SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} bzw. \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar}, sowie ein \ce{V_{max}} von \SI[seperr]{0,095(5)}{\milli\Molar\per\minute} (ATP) 
\SI[seperr]{0,093(5)}{\milli\Molar\per\minute} (Pyruvat). Auffällig ist die bei höheren \acs{ATP}-Konzentrationen wieder abfallende Reaktionsgeschwindigkeit (vgl. Abbildung \ref{abb:kinetik}).
%
\begin{align}
 \label{eq:mm}
 v &= \frac{V_\text{max} \cdot [S]}{K_m + [S]}
\end{align}
%
\begin{figure}[H]
  \centering
  \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/kinetik_combined.eps}
  \caption[Reaktionskinetik der \acs{PPDK}]{Reaktionskinetik der \acs{PPDK} mit \acs{ATP} (A) und Pyruvat (B) als Substrat. Der inhibierende Effekt von \acs{ATP} auf die im gekoppelten Enzymassay eingesetzte \acs{MDH} ist in (A) ersichtlich. Die Ordinatenachse ist der besseren Übersichtlichkeit wegen logarithmisch skaliert.}
  \label{abb:kinetik}
\end{figure}
%
\begin{samepage}
Die Wechselzahl \ce{k_{cat}} wurde anhand von Gleichung \eqref{eq:kcat} aus \ce{V_{max}} und der PPDK-Konzentration von \SI[seperr]{0,38(2)}{\milli\Molar} mit 
\SI[seperr]{1,63(9)}{\per\second} bestimmt. Die spezifische Aktivität der \acs{PPDK} beträgt \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram} und konnte ebenfalls unter Berücksichtigung der 
Proteinkonzentration mittels Gleichung \ref{eq:spez_akt} berechnet werden.
%
\begin{align}
 \label{eq:kcat}
 k_\text{cat} &= \frac{V_\text{max}}{[E_0]}
\end{align}
\end{samepage}

Die katalytische Effizienz {\ce{k_{cat}}/\ce{K_M}} beträgt \SI[seperr]{32,60(936)}{\per\second\per\milli\Molar} (ATP) bzw.\\ \SI[seperr]{6,04(154)}{\per\second\per\milli\Molar} (Pyruvat). Eine Auflistung der kinetischen Parameter ist in Tabelle \ref{tab:kinetische_parameter} zu finden.
%
\begin{align}
 \label{eq:spez_akt}
 \text{spez. Aktivität [\si{\Unit\per\milli\gram}]} &= \frac{V_\text{max}~[\si{\micro\Molar\per\minute}] \cdot V(\text{Ansatz})~[\si{\liter}]}{m(\text{Protein})~[\si{\milli\gram}]}
\end{align}

\begin{table}[htb]
 \centering
 \caption[Kinetische Parameter der \acs{PPDK}]{Kinetische Parameter der \acs{PPDK}.}
 \label{tab:kinetische_parameter}
 \begin{tabular}{lS[seperr, table-format = 3.3(2)]s}
   \toprule
   \textbf{Parameter} & \textbf{Wert} & \textbf{Einheit}\\
   \midrule
   \ce{V_{max}}       & 0,093(5)   & \milli\Molar\per\minute  \\
   \ce{k_{cat}}       & 1,63(9)    & \per\second \\
   \midrule
   \ce{K_m} (ATP)     & 50(9)    & \micro\Molar \\
   \ce{K_m} (Pyruvat) & 270(44)  & \micro\Molar \\
   \midrule
   \ce{k_{cat}}/\ce{K_M} (ATP) & 32,60(936)& \per\second\per\milli\Molar \\
   \ce{k_{cat}}/\ce{K_M} (Pyruvat) & 6,04(154) & \per\second\per\milli\Molar \\
   \midrule
   spez. Aktivität   & 0,99(9) & \Unit\per\milli\gram \\
   \bottomrule
 \end{tabular}
\end{table}

\clearpage

\section{Homologiemodelle}
\label{sec:ergebnisse_homologemodell}
Die erzeugten Homologiemodelle (vgl. \ref{sec:erstellung_homologiemodell}) der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} zeigen eine gute Übereinstimmung mit den zu Grunde liegenden Templat-Strukturen: Es ergab sich ein \acs{RMSD} von \SI{0,708}{\angstrom} für das auf der Struktur aus \acs{C. symbiosum} und \SI{0,705}{\angstrom} für das auf der Struktur aus \textit{Zea mays} basierende Modell. Die Sequenzidentität zur zwischen \acs{F. trinervia} und \textit{Zea mays} beträgt \SI{79}{\percent}, zwischen \acs{F. trinervia} und \acs{C. symbiosum} \SI{55}{\percent}. Das jeweils beste Modell wurde anhand des zDOPE Wertes \citep{Shen2006,Pieper2011}, sowie der Ergebnisse der PROCHECK-Analyse ausgewählt. Der \ac{DOPE} Wert stellt ein statistisch ermitteltes Potential dar, welches die paarweisen atomaren Abstände innerhalb eines Modells im Vergleich zu einer definierten Menge bekannter Proteinstrukturen beurteilt. 

In der normalisierten Variante (zDOPE) stehen Werte gleich oder kleiner als -1,0 für ein sehr exaktes Modell, bei dem sich mehr als \SI{80}{\percent} der \ce{C_α}"=Atome innerhalb eines Abstands von \SI{3,5}{\angstrom} zu ihrer korrekten Position befinden \citep{Lasker2012}. Der zDOPE für das auf \textit{Zea mays} basierende Modell beträgt -0,92803, für das auf \acs{C. symbiosum} basierende Modell -0,92815. Da das Templat Strukturen aufweisen kann, welche nicht in der verwendeten Vergleichsmenge bekannter Strukturen vorhanden ist, kann der zDOPE-Wert hierdurch fälschlich erhöht werden. Daher können die DOPE-Werte je Aminosäurerest für das Templat und das Homologiemodell verglichen werden. Eine vergleichende Darstellung der DOPE-Profile der im Rahmen dieser Arbeit generierten Modelle findet sich in Abbildung \ref{abb:dope}. Die Profile weisen einen qualitativ ähnlichen Verlauf auf, was für die Korrektheit der erstellen Modelle spricht. Allerdings zeigt sich in beiden Fällen ein zunehmender Versatz der Kurvenverläufe, was auf eine Verschiebung des Alignments in den entsprechenden Sequenzabschnitten hindeuten kann.
%
\begin{figure}[H]
 \centering
  \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/DOPE_combined.eps}
  \caption[\acs{DOPE}-Profile der Homologiemodelle und ihrer Template]{\acs{DOPE}-Profile der von \textit{Zea mays} (A) bzw \acs{C. symbiosum} (B) abgeleiteten Homologiemodelle und ihrer Template je Position im Alignment. Der Verlauf ist in beiden Fällen für das Modell und das Templat ähnlich, was auf eine gute Qualität der Homologiemodelle schließen lässt. Allerdings zeigen sich Verschiebungen der Profile um einige Reste, was auf einen Versatz des Alignments hindeuten kann.}
  \label{abb:dope}
\end{figure}
%
Im Ramachandran-Plot zeigt keines der beiden ausgewählten Modelle eine Kombination von ψ- und φ-Winkel, die nicht in einem der erlaubten Bereiche liegt (vgl. Abbildungen \ref{abb:ramachandran_Zm} 
und \ref{abb:ramachandran_Cs}).

Anhand der Modelle wurde eine Visualisierung des \textit{Domain-Swiveling} Mechanismus für die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} (Abbildung \ref{abb:overlay_homologiemodell}), sowie
der \acs{PEP}-Bindestelle (Abbildung \ref{abb:substratbindetasche}) erstellt. Es zeigt sich eine deutliche Torsion der zentralen Phospo-Histidindomäne und des katalytischen His458.
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/swiveling_domain3.png}
 % swiveling_domain2.png: 2480x976 pixel, 119dpi, 53.13x20.91 cm, bb=0 0 1506 593
 \caption[Homologiemodelle der \acs{PPDK}]{Homologiemodelle der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}. Es zeigt die \acs{PEP} gebundene Konformation basierend auf der Struktur aus
 \textit{Zea mays}, sowie das auf \acs{C. symbiosum} basierende Modell (transparent, grau). Beide Modelle stellen die jeweiligen Extremkonformationen des \textit{Swiveling-domain} Mechanismus dar. Das
 an der Übertragung der Phosphatgruppe beteiligte His458 ist als Stabmodell rot eingefärbt und durch einen Stern markiert. Die einzelnen Domänen der \acs{PPDK} sind farblich hervorgehoben: Nukleotidbindedomäne (grün), Pyruvat/PEP-Bindedomäne (blau), Phosphohistidin-Domäne (gelb), Linker-Peptide (magenta und rot).}
 \label{abb:overlay_homologiemodell}
\end{figure}

In der Darstellung der modellierten Substratbindestelle sind die für die Koordination von \acs{PEP} wichtigen Reste Arg562, Arg619, Arg669, Glu748, Asp772 und
Asn771 sichtbar. Ebenfalls erkennbar ist das Cys834, welches als Protonendonor/"=akzeptor zusammen mit Ser767 an der Enolisierung des Pyruvats beteiligt ist \citep{Yankie1995}. Die genannten Reste befinden sich in hoch konservierten Bereichen (Abbildung \ref{abb:ma}).
%
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/substratbindung.png}
 % substratbindung.png: 2480x1681 pixel, 90dpi, 70.00x47.45 cm, bb=0 0 1984 1345
 \caption[Substratbindetasche für \acs{PEP}]{Substratbindetasche für \acs{PEP}. Die Ansicht zeigt die Bindestelle für \acs{PEP} im
  Homologiemodell der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}. Seitenketten in räumlicher Nähe zum Substrat sind als Linienmodell dargestellt und benannt. Die
  gestrichelten Linien zeigen mögliche polare Wechselwirkungen mit einer Länge von maximal \SI{3,5}{\angstrom} an.}
 \label{abb:substratbindetasche}
\end{figure}

