\chapter{Material und Methoden}
\section{Material}
\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
\label{sec:geraete_hilfsmittel}
 \begin{singlespace}
 \begin{longtable}{p{0.5\textwidth} p{0.45\textwidth}}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  Analysen-/Präzisionswaagen                               & Sartorius, Göttingen\\
  Autoklav                                                 & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
  Automatische Pipetten                                    & Gilson, Bad Camberg\\
  \acs{CD}-Spektrometer J-715                              & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
  Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus             & GE Healthcare, Freiburg \\
  \acs{DNA}-Gelkammersystem PerfectBlue                          & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
  Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry'                    & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
  Gelsysteme für große Gele                                & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
  Inkubationsschüttler INNOVA 44R                          & New Brunswick, Nürtigen\\
  Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP                            & Beckman Coulter, Krefeld\\
  Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R                          & Eppendorf, Hamburg\\
  Image Analyzer LAS-4000 mini                             & Fujifilm, Düsseldorf\\
  Magnetrührer MR 3000/3001                                & Heidolph, Schwabach\\
  Microplate Reader Infinite 200 PRO                       & Tecan, Crailsheim \\
  Mikrozentrifuge Minispin                                 & Eppendorf, Hamburg\\
  Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage                      & Millipore, Schwalbach\\
  Minishaker MS 2                                          & IKA, Staufen\\
  Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti                   & Beckman Coulter, Krefeld\\
  Taumelschüttler Polymax 1040                             & Heidolph, Schwalbach\\
  Thermomixer compact/comfort                              & Eppendorf, Hamburg\\
  Ultrazentrifuge Optima L-80 XP                           & Beckman Coulter, Krefeld\\
  Zellaufschlusssystem 'One-Shot'                          & Constant Systems, Daventry, UK\\
  \bottomrule
 \end{longtable}
 
\subsection{Verbrauchsmaterialien}
\label{sec:verbrauchsmaterialien}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  Chromatographiepapier 3MM Chr                                   & Whatman, Maidstone, UK\\
  Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25                            & GE Healthcare, Freiburg\\
  Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter}  & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
  \acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter}                & GE-Healthcare, Freiburg\\
  Mikrotiterplatten                                               & Hartenstein, Würzburg\\
  Petrischalen                                                    & Hartenstein, Würzburg\\
  Pipettenspitzen                                                 & Brand, Wertheim\\
  Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One,\newline Frickenhausen\\
  Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter})                  & Merck, Bruchsal\\
  \bottomrule
 \end{tabularx}
 
\subsection{Chemikalien}
\label{sec:chemikalien}
  \begin{longtable}{p{0.35\textwidth} r p{0.36\textwidth}}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  Agar                                                               &            & Becton Dickinson, Heidelberg\\
  Ampicillin-Natriumsalz                                             & 69-52-3    & AppliChem, Darmstadt\\
  Bromphenolblau                                                     & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
  \ac{CBB}                                                           & 6104-58-1  & \\
  Dikaliumhydrogenphosphat                                           & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
  \acf{DTT}                                                          & 3483-12-3  & Sigma-Aldrich, München\\
  \acf{EDTA}                                                         & 60-00-4    & AppliChem, Darmstadt\\
  Ethanol                                                            & 64-17-5    & VWR, Darmstadt\\
  Glycerin                                                           & 56-81-5    & Carl Roth, Karlsruhe\\
  Hefeextrakt                                                        &            & Becton Dickinson, Heidelberg\\
  Imidazol                                                           & 288-32-4   & AppliChem, Darmstadt\\
  \acf{IPTG}                                                         & 367-93-1   & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
  Kaliumdihydrogenphosphat                                           & 7778-77-0  & Grüssing, Filsum\\
  Magnesiumchlorid                                                   & 7791-18-6  & VWR, Darmstadt\\
  Magnesiumsulfat-Heptahydrat                                        & 10034-99-8 & \\
  Natriumchlorid                                                     & 7647-14-5  & VWR, Damrstadt\\
  Natriumdodecylsulfat (SDS)                                         & 151-21-3   & Serva, Heidelberg\\
  Natriumhydrogencarbonat                                            & 144-55-8   & VWR, Darmstadt\\
  Nickelsulfat                                                       & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
  Pepton                                                             &            & Becton Dickinson, Heidelberg\\
  Phosphorsäure                                                      & 7664-38-2  & Grüssing, Filsum\\
  \acf{PMSF}                                                         & 329-98-6   & Merck, Bruchsal\\
  Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20)                & 9005-64-5  & Sigma-Aldrich, München\\
  Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30                        &            & Carl Roth, Karlsruhe\\
  Saccharose                                                         & 57-50-1    & Carl Roth, Karlsruhe\\
  Salzsäure                                                          & 7647-01-0  & VWR, Darmstadt\\
  \acf{Tris}                                                         & 77-86-1    & VWR, Darmstadt\\
  \bottomrule
  \end{longtable}

 \subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren}
 \label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  \acs{BSA}-Standard (\SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter})        & Qiagen, Hilden\\
  \acs{DNA} \SI{1}{\kb}/\SI{100}{\bp} Ladder                      & New England Biolabs, Frankfurt\\
  PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained)                 & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\
  \bottomrule
 \end{tabularx} 
 
\subsection{Antikörper}
\label{sec:antikoerper}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  Anti-His-\acs{HRP} & Carl Roth, Karlsruhe\\
  \bottomrule
 \end{tabularx}
 
\subsection{Kommerzielle Kits}
\label{sec:komerzielle_kits}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
  \midrule
  illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Freiburg\\
  QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\
  Roti-Quant$^\text{\textregistered}$ (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
  \bottomrule
 \end{tabularx}
 
\subsection{Restriktionsenzyme}
\label{sec:restriktionsenzyme}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Erkennungssequenz (5'~--~3')}\\
  \midrule
  \textit{BamH}I & New England Biolabs, Frankfurt & CA/TATG\\
  \textit{Nde}I  & New England Biolabs, Frankfurt & G/GATCC\\
  \bottomrule
 \end{tabularx} 
 
\subsection{Bakterienstämme}
\label{sec:batrienstaemme}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\
  \midrule
  BL21 (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm gal} \textlambda(DE3)\\ 
  BL21 Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm} Tet$^\text{r}$ gal \textlambda(DE3) \textit{endA} Hte\\
  XL1-Blue & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} \textit{recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac} [F' \textit{proAB lacI$^\text{q}$ Z\textDelta M15} Tn\textit{10} (Tet$^\text{r}$)]\\
  \bottomrule
 \end{tabularx} 
 
\subsection{Synthetische Oligonukleotide}
\label{sec:synthetische_oligonukleotide}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.3\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Sequenz (5'~--~3')} \\
  \midrule
  pETEV-16b-PPDK-for & \texttt{CATGAAAACCTGTATTTTCAGGGACATATG \newline ACCGCTAAAAAACGCGTGTT}\\
  pETEV-16b-PPDK-rev & \texttt{TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAG \newline TTAAACAATCACTTGGGCGG}\\
  \bottomrule
 \end{tabularx} 
 
\subsection{Plasmide}
\label{sec:plasmide}

 \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
  \toprule
  \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Marker}\\
  \midrule
  pET-16b & Novagen, Darmstadt & Ampicillinresistenz\\
  \bottomrule
 \end{tabularx} 
 
\subsection{Kulturmedien}
\label{sec:kulturmedien}
\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[\acs{2YT} (pH 7,5)] \hfill \\
 \SI{1,6}{\percent} (w/v) Pepton\\
 \SI{1}{\percent} (w/v) Hefeextrakt\\
 \SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid
\end{description}
\end{samepage}

\subsection{Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese}
\label{sec:puffer_agarose_gelelektrophorese}
\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[\ac{TAE}-Puffer (50x)] \hfill \\
 \SI{100}{\milli\liter} \acs{EDTA} (\SI{0,5}{\Molar}, pH 8)\\
 \SI{57,1}{\milli\liter} Essigsäure\\
 \SI{242}{\gram} Tris\\
 \SI{1}[ad~]{\liter} \ce{ddH2O}
\end{description}
\end{samepage}


\subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
\label{sec:puffer_zellauschluss}
\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
 \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
 \SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
 \SI{10}{\milli\Molar} Imidazol\\
 \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
 \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
 \SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
 \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
\end{description}
\end{samepage}

\subsection{Puffer und Lösungen für die Reinigung}
\label{sec:reinigungspuffer}
\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
 \SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
\end{description}
\end{samepage}

\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[Waschpuffer] \hfill \\
 \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
 \SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
 \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
 \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
 \SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
 \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
\end{description}
\end{samepage}

\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[Elutionspuffer] \hfill \\
 \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
 \SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
 \SI{500}{\milli\Molar} Imidazol\\
 \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
 \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
 \SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
 \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
\end{description}
\end{samepage}

\begin{samepage}
\begin{description}
 \item[Lagerungspuffer] \hfill \\
 \SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 8\\
 \SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
 \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{EDTA}\\
 \SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
 \SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
\end{description}
\end{samepage}

\end{singlespace}
\section{Molekularbiologische Methoden}
\label{sec:methoden}

\subsection{Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren}
\label{sec:konzentrationsbestimmung_nukleinsaeuren}
Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
\begin{align}
  \text{OD}_{260} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
  \label{eq:dna_konz}
\end{align}

\SI{2}{\micro\liter} der Probe und des verwendeten Puffers werden hierbei auf einer NanoQuant-
Platte im Mikroplatten-Lesegerät vermessen und die Konzentration aus der Differenz
aus Probe und Puffer gemäß Gleichung \ref{eq:dna_konz} berechnet.

\subsection{Isolierung von Plasmid-\acs{DNA}}
\label{sec:isolierung_plasmid_dna}
Die Isolierung von Plasmiden erfolgte aus \SI{5}{\milli\liter} Übernachtkulturen mit Hilfe des
"`QIAprep$^\text{\textregistered}$ Spin Miniprep"'-Kits nach Herstellerangaben.
Die isolierte Plasmid-\acs{DNA} wurde in \SI{10}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl} pH 8,5 bei bei 
\SI{-20}{\celsius} gelagert.

\subsection{Restriktionsverdau von \acs{DNA}}
\label{sec:restriktionsverdau_dna}
\begin{samepage}
Im Zuge der Klonierung wurde der Zielvektor pET-16b über die beiden Restriktionsenzyme \textit{BamH}I und \textit{Nde}I linearisiert.
Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}{\celsius} über einen Zeitraum von \SI{2}{\hour}.
\begin{description}
 \item[Ansatz Restriktionsverdau] \hfill \\
 \SI{4}{\micro\gram} Vektor-DNA\\
 \SI{3}{\micro\liter} NEBuffer 4 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 \SI{10}{\Unit} \textit{BamH}I \\
 \SI{10}{\Unit} \textit{Nde}I\\
 ad \SI{25}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
\end{description}
\end{samepage}

\subsection{Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von \acs{DNA}}
\label{sec:agarose_gelelektrophorese}
Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe wurde die Agarose"=Gelelektrophorese eingesetzt.
Hierbei wandern die durch das Phosphatrückrat negativ geladenen Nukleinsäuren im elektrischen Feld durch ein
Agarose"=Gel zur Anode. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist hierbei abhängig von der Größe, es resultiert
eine entsprechende Auftrennung im Gel.

Eine \SI{1}{\percent}ige~(w/v) Lösung von Agarose in \ac{TAE}-Puffer wurde etwa \SI{1}{\centi\meter} hoch auf den
Gelträger der Elektrophoresekammer gefüllt, mit Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von \SI{0,5}{\micro\gram\per\milli\liter} versetzt
und durch Schwenken homogen verteilt.

Das erstarrte Gel wurde anschließend mit \acs{TAE}-Puffer überschichtet und mit \SI{5}{\micro\liter} Marker, sowie den zu analysierenden
Proben beladen. Die Laufzeit betrug bei \SI{150}{\volt} \SIrange{30}{45}{\minute}.

Die Dokumentation der \acs{DNA}"=Banden erfolgte fotografisch im \acs{UV}"=Transilluminator.

\subsection{Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen}
\label{sec:extraktion_dna_agarosegel}
Die Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen erfolgte mit dem "`illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"'
nach Herstellerangaben.

\subsection{\acl{PCR}}
\label{sec:pcr}
Mit Hilfe der \ac{PCR} konnen Nukleinsäurefragmente gezielt
vervielfältigt werden. Die Spezifität der Reaktion ist hierbei durch die Auswahl der
eingesetzten Primer gegeben.
Eine PCR gliedert sich grundsätzlich in drei aufeinanderfolgende Phasen: Während
der Denaturierung bei \SI{95}{\celsius} wird der Doppelstrang in die beiden Einzelstränge
aufgespalten. Das Annealing bei \SIrange{50}{60}{\celsius} führt zur Anlagerung der Primer an die
komplementären Sequenzabschnitte der Einzelstränge des Templates. Die exakte
Temperatur ist hierbei von den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer abhängig.
Während der Elongationsphase erfolgt die Synthese neuer Komplementärstränge
ausgehend von den Primern durch eine DNA-Polymerase.
Durch eine mehrfache Wiederholung kann die Ziel-DNA in kurzer Zeit exponentiell
vervielfacht werden.

\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
\label{sec:inserts_slic}
\begin{samepage}
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl. \ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz.
\begin{description}
 \item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\
  \SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
  \SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
  \SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
  \SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
  \SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (\SI{1}{\Unit\per\micro\liter}, peqlab, Erlangen) \\
  \SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
  \SI{50}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
\end{description}
\end{samepage}
Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
des zum \acs{PPDK}-kodierenden Bereich homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.

\begin{table}[hbt]
\centering
\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
\begin{tabular}{ccc}
\toprule
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit [\si{\minute}]} & \textbf{Zyklen}\\
\midrule
95 & 5 & \multirow{4}{*}{10} \\
95 & 1 & \\
46 & 1 & \\
72 & 5 & \\
\midrule
95 & 1 & \multirow{3}{*}{20} \\
65 & 1 & \\
72 & 5 & \\
\midrule
95 & 10 & 1 \\
\bottomrule
\end{tabular}
\label{tab:slic_cycler}
\end{table}

\subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}}
Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden zufällig ausgewählte Kolonien mittels einer Kolonie-PCR
untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \ce{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht
und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \acs{2YT}-Medium verwendet.

\begin{description}
 \item[Kolonie-PCR-Ansatz] \hfill \\
 \SI{1}{\micro\liter} T7-Pro-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
 \SI{1}{\micro\liter} T7-Ter-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
 \SI{2,5}{\micro\liter} 10x~Thermo-Pol-Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 \SI{0,5}{\Unit} Taq-Polymerase (\SI{5}{\Unit\per\micro\liter}, New England Biolabs, Frankfurt)\\
 \SI{0,25}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar})\\
 \SI{25}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
\end{description}

Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß dem in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt.

\begin{table}[hbt]
\centering
\caption[Cyclerprogramm Kolonie-\acs{PCR}]{Cyclerprogramm für die Kolonie-\acs{PCR}}
\begin{tabular}{ccc}
\toprule
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit} & \textbf{Zyklen}\\
\midrule
95 & \SI{5}{\minute} & \multirow{4}{*}{30} \\
95 & \SI{30}{\second} & \\
48 & \SI{30}{\second} & \\
72 & \SI{40}[\SI{2}{\minute}~]{\second} & \\
\midrule
72 & \SI{5}{\minute} & 1 \\
\bottomrule
\end{tabular}
\label{tab:kolonie_pcr_cycler}
\end{table}

\subsection{\acf{SLIC}}
\label{sec:slic}
Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren, 
welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.

Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl. \ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor 
wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl. \ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die 
für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:

\begin{description}
 \item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
 x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~≡~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
 \SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
 \SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 \SI{1}{\Unit} T4-\acs{DNA}-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
\end{description}

Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von 
\SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde 
durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.

In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert-\acs{DNA} (\SI{2691}{\bp}) im zweifachen molaren Verhältnis eingesetzt:

\begin{description}
 \item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
 x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} ≡~\SI{150}{\nano\gram}\\
 y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} ≡~\SI{141}{\nano\gram}\\
 \SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
 ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
\end{description}

Der Ansatz wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{37}{\celsius} inkubiert. \SI{5}{\micro\liter} der Ansätze wurden für die
Transformation von \acs{E. coli} XL1-Blue eingesetzt.

\section{Mikrobiologische Methoden}
\label{sec:mikrobiologische_methoden}

\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
\label{sec:transformation}
Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation. \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetenter Zellen wurden auf 
Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-\acs{DNA} versetzt. Anschließend wurden die Zellen für \SI{15}{\minute} auf Eis inkubiert.
Es folgte ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} von \SI{90}{\second} Dauer. Nach einer erneuten Inkubation auf Eis
für \SI{2}{\minute} und der Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} \acs{2YT}-Medium wurden die Zellen für \SI{1}{\hour} unter leichtem
Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.

Der \SI{150}{\micro\liter} des Ansatzes wurde anschließend auf \acs{2YT}"=Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin
ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.

\subsection{Stammhaltung}
\label{sec:stammhaltung}
Die Stammhaltung erfolgte in \SI{20}{\percent}igen Glycerinkulturen bei \SI{-80}{\celsius}. Hierfür wurden \SI{800}{\micro\liter} einer Übernachtkultur 
(vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren.

\subsection{Expression in \acs{E. coli}}
\label{sec:expression_ecoli}
Die Transformation kompetenter Zellen erfolgte wie in \ref{sec:transformation} beschrieben. Die Anzucht erfolgte in \acs{2YT}-Medium 
mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin.

\subsubsection{Expressionsstudien}
\label{sec:expression_ecoli_studien}
Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
\SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt.

Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter} Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer 
\acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar}, \SI{0,5}{\milli\Molar} und \SI{1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.

Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Vier Stunden nach der Induktion bzw. am nächsten Tag 
wurden die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet.

\subsubsection{Präparative Expression}
Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{100}{\milli\liter} Volumen in unschikanierten \SI{250}{\milli\liter}-Kolben angesetzt. Die 
Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der 
Hauptkulturen eingesetzt.

Hierfür wurden \SI{2}{\liter} Kolben mit Schikane und \SI{500}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer 
\acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.

Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Am nächsten Tag wurden
die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet.

\section{Präparative Methoden}
\label{sec:praeparative_methoden}

\section{Analytische Methoden}
\label{sec:analytische_methoden}

\section{Bioinformatische Methoden}
\label{sec:bioinformatische_methoden}
