\chapter{Ergebnisse}
\label{sec:ergebnisse}
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\section{Klonierung}
\label{sec:erg_klonierung}
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Sie \acs{SLIC}-Klonierung erfolgte wie in \ref{sec:slic} beschrieben. Die mittels \acs{PCR} synthetisierten \textit{Inserts} 
(vgl.~\ref{sec:inserts_slic}), sowie der linearisierte Vektor (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}) wurden auf ein zur Reinigung auf
Agarosegel aufgetragen (vgl. \ref{sec:agarose_gelelektrophorese}). Es ergab sich das in Abbildung \ref{abb:agarosegel_vektor_insert} gezeigte Auftrennungsmuster.
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\begin{figure}[htb]
 \centering
 \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
 \centering
 \includegraphics[keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/vektor_linear_text.png}
 % vektor_linear_text.png: 615x551 pixel, 300dpi, 5.21x4.67 cm, bb=0 0 148 132
 \caption{}
 \label{abb:linearisierter_vektor}
 \end{subfigure}
 %
 ~
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 \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
 \centering
 \includegraphics[keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/insert_pcr_text.png}
 % insert_pcr_text.png: 474x551 pixel, 300dpi, 4.01x4.67 cm, bb=0 0 114 132
 \caption{}
 \label{abb:}
\end{subfigure}
 \caption[Agarosegel zur Reinigung von Vektor und dem Insert]{Exemplarischer Ausschnitt aus dem Agarosegel zur Reinigung von 
                                                                                  linearisiertem Vektor (a) und dem Insert (b) zur SLIC-Klonierung.
                                                                                  Aufgetragen wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard und 
                                                                                  je \SI{20}{\micro\liter} Probe. Die erwarteten Größen sind \SI{5720}{\bp} (Vektor) 
                                                                                  und \SI{2691}{\bp} (Insert).}
 \label{abb:agarosegel_vektor_insert}
\end{figure}

Sowohl Vektor als auch Insert lagen innerhalb der erwarteten Größenordnung (\SI{5720}{\bp} bzw. \SI{2691}{\bp}) auf, so dass beide wie in \ref{sec:slic}
beschrieben in den Ligationsansatz gegeben wurden. Zur Amplifikation des Vektors wurden dann \acs{E. coli} Zellen des Stamms XL1-Blue mit diesem transformiert 
(vgl. \ref{sec:transformation}) und auf Agarplatten angezogen. Mit einer Kolonie-PCR (vgl. \ref{sec:kolonie_pcr}) wurde überprüft, ob der untersuchte Klon
das korrekte Insert trägt. Das enstsprechende Gelbild ist in Abbildung \ref{abb:kolonie_pcr} dargestellt.
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\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/colony_pcr.png}
 % colony_pcr.png: 1586x1474 pixel, 300dpi, 13.43x12.48 cm, bb=0 0 381 354
 \caption[Agarosegel nach Kolonie-PCR]{Agarosegel nach Kolonie-PCR. Es wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard und je \SI{20}{\micro\liter} Probe aufgetragen.
 Untersucht wurden 24 Klone, von denen fünf (10, 13, 22, 23 und 24) ein Plasmid mit der korrekten Größe tragen.}
 \label{abb:kolonie_pcr}
\end{figure}

Von untersuchten 24 Klonen wiesen fünf ein Plasmid auf, das der erwarteten Größe von \SI{8351}{\bp} (Vektor~+~Insert) entspricht. Die fünf positiven Klone
wurden in \SI{5}{\milli\liter} Kulturrörchen über Nacht angezogen und die Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit nach Herstellerangaben extrahiert.
Proben der isolierten Plasmid-DNA wurden zur Sequenzierung eingeschickt (StarSEQ GmbH, Mainz). Es konnte gezeigt werden, dass das aus Klon \#22 isolierte
Plasmid im für die \acs{PPDK} kodierenden Bereich keine Mutation trägt. Eine Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk ist in Abbildung \ref{abb:plasmidkarte}
aufgeführt.
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\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/pETEV-16b-ppdk.pdf}
 % pETEV-16b-ppdk.pdf: 611x480 pixel, 72dpi, 21.55x16.93 cm, bb=0 0 611 480
 \caption{Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk}
 \label{abb:plasmidkarte}
\end{figure}
