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49 KiB
TeX
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\chapter{Material und Methoden}
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\section{Material}
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\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
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\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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\begin{singlespace}
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\begin{longtable}{p{0.5\textwidth} p{0.45\textwidth}}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Analysen-/Präzisionswaagen & Sartorius, Göttingen\\
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Autoklav & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
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Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
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\acs{CD}-Spektrometer J-715 & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
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Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus & GE Healthcare, Uppsala, SE \\
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\acs{DNA}-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
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Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\
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Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R & Eppendorf, Hamburg\\
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Image Analyzer LAS-4000 mini & Fujifilm, Düsseldorf\\
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Magnetrührer MR 3000/3001 & Heidolph, Schwabach\\
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Microplate Reader Infinite 200 PRO & Tecan, Crailsheim \\
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Mikrozentrifuge Minispin & Eppendorf, Hamburg\\
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Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage & Millipore, Schwalbach\\
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Minishaker MS 2 & IKA, Staufen\\
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Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwalbach\\
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Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\
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Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Zellaufschlusssystem 'One-Shot' & Constant Systems, Daventry, UK\\
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\bottomrule
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\end{longtable}
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\subsection{Verbrauchsmaterialien}
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\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\
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Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25 & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
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Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
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Filter für Ultrazentrifugation "`Amicon Ultra"' & Millipore, Schwalbach\\
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\acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter} & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
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Mikrotiterplatten & Hartenstein, Würzburg\\
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Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
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Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
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Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One,\newline Frickenhausen\\
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Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter}) & Merck, Bruchsal\\
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|
\bottomrule
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\end{tabularx}
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\subsection{Chemikalien}
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\label{sec:chemikalien}
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\begin{longtable}{p{0.35\textwidth} r p{0.36\textwidth}}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
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|
Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
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\ac{CBB} & 6104-58-1 & Serva, Heidelberg\\
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Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
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\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
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\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
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Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Hefeextrakt & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Imidazol & 288-32-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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|
\acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\
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Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\
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Magnesiumsulfat-Heptahydrat & 10034-99-8 & Sigma-Aldrich, München\\
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Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\
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|
Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\
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|
Natriumhydrogencarbonat & 144-55-8 & VWR, Darmstadt\\
|
|
Nickelsulfat & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
|
|
Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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|
Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
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|
\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
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|
Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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|
Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
|
Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
|
Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
|
|
\acf{Tris} & 77-86-1 & VWR, Darmstadt\\
|
|
\bottomrule
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|
\end{longtable}
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|
\subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren}
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\label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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|
\toprule
|
|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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|
\midrule
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|
\acs{BSA}-Standard (\SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter}) & Qiagen, Hilden\\
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|
\acs{DNA} \SI{1}{\kb}/\SI{100}{\bp} Ladder & New England Biolabs, Frankfurt\\
|
|
PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained) & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabularx}
|
|
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|
\subsection{Antikörper}
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\label{sec:antikoerper}
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|
|
|
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
|
|
\toprule
|
|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
|
|
\midrule
|
|
Anti-His-\acs{HRP} & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
|
\bottomrule
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|
\end{tabularx}
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|
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|
\subsection{Kommerzielle Kits}
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\label{sec:komerzielle_kits}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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|
illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
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|
QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\
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|
Roti$^\text{\textregistered}$-Quant (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabularx}
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|
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|
\subsection{Restriktionsenzyme}
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\label{sec:restriktionsenzyme}
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|
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
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|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Erkennungssequenz (5'~--~3')}\\
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|
\midrule
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|
\textit{Nde}I & New England Biolabs, Frankfurt & CA/TATG\\
|
|
\textit{BamH}I & New England Biolabs, Frankfurt & G/GATCC\\
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|
\bottomrule
|
|
\end{tabularx}
|
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|
\subsection{Bakterienstämme}
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\label{sec:batrienstaemme}
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|
\begin{samepage}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
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|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\
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|
\midrule
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|
BL21 (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm gal} \textlambda(DE3)\\
|
|
BL21 Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm} Tet$^\text{r}$ gal \textlambda(DE3) \textit{endA} Hte\\
|
|
XL1-Blue & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} \textit{recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac} [F' \textit{proAB lacI$^\text{q}$ Z\textDelta M15} Tn\textit{10} (Tet$^\text{r}$)]\\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabularx}
|
|
\end{samepage}
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|
\subsection{Synthetische Oligonukleotide}
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\label{sec:synthetische_oligonukleotide}
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|
|
|
\begin{samepage}
|
|
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.3\textwidth}X}
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|
\toprule
|
|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Sequenz (5'~--~3')} \\
|
|
\midrule
|
|
pETEV-16b-PPDK-for & \texttt{CATGAAAACCTGTATTTTCAGGGACATATG \newline ACCGCTAAAAAACGCGTGTT}\\
|
|
pETEV-16b-PPDK-rev & \texttt{TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAG \newline TTAAACAATCACTTGGGCGG}\\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabularx}
|
|
\end{samepage}
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|
\subsection{Plasmide}
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\label{sec:plasmide}
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|
% Das tatsächlich eingesetzte Plasmid trägt die Bezeichnung pETEV-16b und ist ein Derivat des pET-16b-Vektors,
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|
% das zusätzlich zwischen der für den Hexa-Histidin-Tag kodierenden Sequenz und dem Zielgen eine für die Schnittstelle
|
|
% der \acs{TEV}-Protease kodierende Sequenz beinhaltet.
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|
%
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\begin{samepage}
|
|
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
|
|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Marker}\\
|
|
\midrule
|
|
pET-16b & Novagen, Darmstadt & Ampicillinresistenz\\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabularx}
|
|
\end{samepage}
|
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|
\subsection{Kulturmedien}
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\label{sec:kulturmedien}
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|
\begin{samepage}
|
|
\begin{description}
|
|
\item[\acs{2YT} (pH 7,5)] \hfill \\
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|
\SI{1,6}{\percent} (w/v) Pepton\\
|
|
\SI{1}{\percent} (w/v) Hefeextrakt\\
|
|
\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid
|
|
\end{description}
|
|
\end{samepage}
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|
\subsection{Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese}
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\label{sec:puffer_agarose_gelelektrophorese}
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|
\begin{samepage}
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|
\begin{description}
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|
\item[\ac{TAE}-Puffer (50x)] \hfill \\
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|
\SI{100}{\milli\liter} \acs{EDTA} (\SI{0,5}{\Molar}, pH 8)\\
|
|
\SI{57,1}{\milli\liter} Essigsäure\\
|
|
\SI{242}{\gram} Tris\\
|
|
\SI{1}[ad~]{\liter} \acs{ddH2O}
|
|
\end{description}
|
|
\end{samepage}
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|
\subsection{Puffer für die \acs{SDS}-\acs{PAGE}}
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|
\label{sec:puffer_sds_page}
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|
\begin{description}
|
|
\item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30)] \hfill \\
|
|
\SI{30}{\percent} Acrylamid\\
|
|
\SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid
|
|
\item[Laufpuffer (10\texttimes)] \hfill \\
|
|
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}\\
|
|
\SI{1,92}{\Molar} Glycin\\
|
|
\SI{0,5}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
|
|
\item[Sammelgelpuffer, pH 6,7 (5\texttimes)] \hfill \\
|
|
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
|
|
\SI{0,5}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
|
|
\item[Trenngelpuffer, pH 8,9 (2,5\texttimes)] \hfill \\
|
|
\SI{1,875}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
|
|
\SI{0,25}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
|
|
\item[Probenpuffer (4\texttimes)] \hfill \\
|
|
\SI{30}{\milli\Molar} Borsäure\\
|
|
\SI{30}{\milli\Molar} \acs{Tris}\\
|
|
\SI{0,7}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
|
|
\SI{50}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{6,7}{\percent} (w/v) \acs{SDS}\\
|
|
\SI{16,7}{\percent} (w/v) Saccharose\\
|
|
\SI{0,16}{\percent} (w/v) Bromphenolblau
|
|
\item[Färbelösung] \hfill \\
|
|
\SI{0,1}{\percent}~(w/v) \acs{CBB}\\
|
|
\SI{2}{\percent}~(w/v) Phosphorsäure\\
|
|
\SI{5}{\percent}~(w/w) Aluminiumsulfat\\
|
|
\SI{10}{\percent}~(v/v) Ethanol
|
|
\end{description}
|
|
|
|
\subsection{Puffer und Lösungen für den Westernblot}
|
|
\label{sec:puffer_westernblot}
|
|
\begin{description}
|
|
\item[Transferpuffer]\hfill \\
|
|
\SI{25}{\milli\Molar} Tris\\
|
|
\SI{190}{\milli\Molar} Glycin\\
|
|
\SI{10}{\percent} (v/v) Ethanol
|
|
\item[TBS pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
|
|
\SI{10}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl}\\
|
|
\SI{150}{\milli\Molar} Natriumchlorid
|
|
\item[TBT pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
|
|
\SI{20}{\milli\Molar} Tris\\
|
|
\SI{500}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
|
\SI{0,05}{\percent} (v/v) Polysorbat 20
|
|
\item[Caseinlösung pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
|
|
\SI{1}{\percent} (w/v) Casein in TBS\\
|
|
\SI{2}{\milli\liter} \SI{2}{\Molar} \ce{NaOH} je \SI{500}{\milli\liter}
|
|
\end{description}
|
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|
|
\subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
|
|
\label{sec:puffer_zellauschluss}
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|
\begin{samepage}
|
|
\begin{description}
|
|
\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
|
|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
|
|
\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
|
\SI{10}{\milli\Molar} Imidazol\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
|
|
\end{samepage}
|
|
|
|
\subsection{Puffer und Lösungen für die Reinigung}
|
|
\label{sec:reinigungspuffer}
|
|
\begin{samepage}
|
|
\begin{description}
|
|
\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
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|
\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
|
|
\end{description}
|
|
\end{samepage}
|
|
|
|
\begin{samepage}
|
|
\begin{description}
|
|
\item[Waschpuffer] \hfill \\
|
|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
|
|
\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
|
|
\end{samepage}
|
|
|
|
\begin{samepage}
|
|
\begin{description}
|
|
\item[Elutionspuffer] \hfill \\
|
|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
|
|
\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
|
\SI{500}{\milli\Molar} Imidazol\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
|
|
\end{samepage}
|
|
|
|
\begin{samepage}
|
|
\begin{description}
|
|
\item[Lagerungspuffer] \hfill \\
|
|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 8\\
|
|
\SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
|
|
\SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{EDTA}\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
|
|
\end{samepage}
|
|
|
|
\subsection{Puffer für die \acs{CD}-Spektroskopie}
|
|
\label{sec:puffer_cd_spektroskopie}
|
|
\begin{description}
|
|
\item[CD-Puffer] \hfill \\
|
|
\SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat pH 7,9\\
|
|
\SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat
|
|
\end{description}
|
|
|
|
\subsection{Puffer für den Aktivitätstest}
|
|
\label{sec:puffer_aktivitaetsassay}
|
|
\begin{samepage}
|
|
\begin{description}
|
|
\item[Reaktionspuffer] \hfill \\
|
|
\SI{100}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl} pH 8\\
|
|
\SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
|
|
\SI{2,5}{\milli\Molar} Kaliumdihydrogenphosphat\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Natriumhydrogencarbonat\\
|
|
\SI{0,1}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \acs{DTT}\\
|
|
\textbf{frisch dazugegeben:}\\
|
|
\SI{0,2}{\milli\Molar} \acs{NADH}\\
|
|
\SI{1,25}{\milli\Molar} \acs{ATP}\\
|
|
\SI{0,8}{\Unit} \ac{PEPCase}\\
|
|
\SI{2}{\Unit} \ac{NAD-MDH}
|
|
\end{description}
|
|
\end{samepage}
|
|
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|
\end{singlespace}
|
|
\section{Molekularbiologische Methoden}
|
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\label{sec:methoden}
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|
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|
\subsection{Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren}
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|
\label{sec:konzentrationsbestimmung_nukleinsaeuren}
|
|
Nukleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
|
|
bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
|
|
durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
|
|
\begin{align}
|
|
\text{OD}_{260} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
|
|
\label{eq:dna_konz}
|
|
\end{align}
|
|
|
|
\SI{2}{\micro\liter} der Probe und des verwendeten Puffers werden hierbei auf einer NanoQuant-
|
|
Platte im Mikroplatten-Lesegerät vermessen und die Konzentration aus der Differenz
|
|
aus Probe und Puffer gemäß Gleichung \ref{eq:dna_konz} berechnet.
|
|
|
|
\subsection{Isolierung von Plasmid-\acs{DNA}}
|
|
\label{sec:isolierung_plasmid_dna}
|
|
Die Isolierung von Plasmiden erfolgte aus \SI{5}{\milli\liter} Übernachtkulturen mit Hilfe des
|
|
"`QIAprep$^\text{\textregistered}$ Spin Miniprep"'-Kits nach Herstellerangaben.
|
|
Die isolierte Plasmid-\acs{DNA} wurde in \SI{10}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl} pH 8,5 bei bei
|
|
\SI{-20}{\celsius} gelagert.
|
|
|
|
\subsection{Restriktionsverdau von \acs{DNA}}
|
|
\label{sec:restriktionsverdau_dna}
|
|
\begin{samepage}
|
|
Im Zuge der Klonierung wurde der Zielvektor pET-16b über die beiden Restriktionsenzyme \textit{BamH}I und \textit{Nde}I linearisiert.
|
|
Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}{\celsius} über einen Zeitraum von \SI{2}{\hour}.
|
|
\begin{description}
|
|
\item[Ansatz Restriktionsverdau] \hfill \\
|
|
\SI{4}{\micro\gram} Vektor-DNA\\
|
|
\SI{3}{\micro\liter} NEBuffer 4 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
|
\SI{10}{\Unit} \textit{BamH}I \\
|
|
\SI{10}{\Unit} \textit{Nde}I\\
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ad \SI{25}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
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\end{description}
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\end{samepage}
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\subsection{Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von \acs{DNA}}
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\label{sec:agarose_gelelektrophorese}
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Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe wurde die Agarose"=Gelelektrophorese eingesetzt.
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Hierbei wandern die durch das Phosphatrückrat negativ geladenen Nukleinsäuren im elektrischen Feld durch ein
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Agarose"=Gel zur Anode. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist hierbei abhängig von der Größe, es resultiert
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eine entsprechende Auftrennung im Gel.
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Eine \SI{1}{\percent}ige~(w/v) Lösung von Agarose in \ac{TAE}-Puffer wurde etwa \SI{1}{\centi\meter} hoch auf den
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Gelträger der Elektrophoresekammer gefüllt, mit Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von \SI{0,5}{\micro\gram\per\milli\liter} versetzt
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und durch Schwenken homogen verteilt.
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Das erstarrte Gel wurde anschließend mit \acs{TAE}-Puffer überschichtet und mit \SI{5}{\micro\liter} Marker, sowie den zu analysierenden
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Proben beladen. Die Laufzeit betrug bei \SI{150}{\volt} \SIrange{30}{45}{\minute}.
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Die Dokumentation der \acs{DNA}"=Banden erfolgte fotografisch im \acs{UV}"=Transilluminator.
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\subsection{Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen}
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\label{sec:extraktion_dna_agarosegel}
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Die Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen erfolgte mit dem "`illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"'
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nach Herstellerangaben.
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\subsection{\acl{PCR}}
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\label{sec:pcr}
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Mit Hilfe der \ac{PCR} können Nukleinsäurefragmente gezielt
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vervielfältigt werden. Die Spezifität der Reaktion ist hierbei durch die Auswahl der
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eingesetzten Primer gegeben.
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Eine PCR gliedert sich grundsätzlich in drei aufeinanderfolgende Phasen: Während
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der Denaturierung bei \SI{95}{\celsius} wird der Doppelstrang in die beiden Einzelstränge
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aufgespalten. Das Annealing bei \SIrange{50}{60}{\celsius} führt zur Anlagerung der Primer an die
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komplementären Sequenzabschnitte der Einzelstränge des Templates. Die exakte
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Temperatur ist hierbei von den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer abhängig.
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Während der Elongationsphase erfolgt die Synthese neuer Komplementärstränge
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ausgehend von den Primern durch eine DNA-Polymerase.
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Durch eine mehrfache Wiederholung kann die Ziel-DNA in kurzer Zeit exponentiell
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vervielfacht werden.
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\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
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\label{sec:inserts_slic}
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Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl.~\ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
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Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz. Diese
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wurden so gewählt, dass jeweils \SI{30}{\bp} zum Zielvektor und \SI{20}{\bp} zum Zielgen homolog waren.
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\begin{samepage}
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\begin{description}
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\item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\
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\SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
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\SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
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\SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
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\SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
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|
\SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (\SI{1}{\Unit\per\micro\liter}, peqlab, Erlangen) \\
|
|
\SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
|
|
\SI{50}[ad~]{\micro\liter} \acs{ddH2O}
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|
\end{description}
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\end{samepage}
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%
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\begin{table}[hbt]
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\centering
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\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
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\begin{tabular}{ccc}
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\toprule
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\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit [\si{\minute}]} & \textbf{Zyklen}\\
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\midrule
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95 & 5 & \multirow{4}{*}{10} \\
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95 & 1 & \\
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46 & 1 & \\
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|
72 & 5 & \\
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|
\midrule
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95 & 1 & \multirow{3}{*}{20} \\
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|
65 & 1 & \\
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|
72 & 5 & \\
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|
\midrule
|
|
95 & 10 & 1 \\
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|
\bottomrule
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|
\end{tabular}
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|
\label{tab:slic_cycler}
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|
\end{table}
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%
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Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
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der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
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des zum \acs{PPDK}-kodierenden Bereich homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
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zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.
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\subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}}
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\label{sec:kolonie_pcr}
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Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden zufällig ausgewählte Kolonien mittels einer Kolonie-PCR
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untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \acs{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
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vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht
|
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und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \acs{2YT}-Medium verwendet.
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%
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\begin{samepage}
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\begin{description}
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\item[Kolonie-PCR-Ansatz] \hfill \\
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\SI{1}{\micro\liter} T7-Pro-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
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\SI{1}{\micro\liter} T7-Ter-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
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|
\SI{2,5}{\micro\liter} 10x~Thermo-Pol-Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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|
\SI{0,5}{\Unit} Taq-Polymerase (\SI{5}{\Unit\per\micro\liter}, New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
|
\SI{0,25}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar})\\
|
|
\SI{25}[ad~]{\micro\liter} \acs{ddH2O}
|
|
\end{description}
|
|
\end{samepage}
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%
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|
Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt.
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\begin{table}[hbt]
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\centering
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|
\caption[Cyclerprogramm Kolonie-\acs{PCR}]{Cyclerprogramm für die Kolonie-\acs{PCR}}
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\begin{tabular}{ccc}
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|
\toprule
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|
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit} & \textbf{Zyklen}\\
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\midrule
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95 & \SI{5}{\minute} & \multirow{4}{*}{30} \\
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|
95 & \SI{30}{\second} & \\
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48 & \SI{30}{\second} & \\
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|
72 & \SI{40}[\SI{2}{\minute}~]{\second} & \\
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|
\midrule
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|
72 & \SI{5}{\minute} & 1 \\
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|
\bottomrule
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\end{tabular}
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\label{tab:kolonie_pcr_cycler}
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\end{table}
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\subsection{\acf{SLIC}}
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\label{sec:slic}
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Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren,
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welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
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Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor
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wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl.~\ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die
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für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
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Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
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\begin{description}
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|
\item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
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x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~≡~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
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|
\SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
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|
\SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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|
\SI{1}{\Unit} T4-\acs{DNA}-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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ad \SI{35}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
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|
\end{description}
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%
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Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase von
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\SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde
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durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.
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In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert-\acs{DNA} (\SI{2691}{\bp}) im zweifachen molaren Verhältnis eingesetzt:
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%
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\begin{description}
|
|
\item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
|
|
x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} ≡~\SI{150}{\nano\gram}\\
|
|
y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} ≡~\SI{141}{\nano\gram}\\
|
|
\SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
|
ad \SI{10}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
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|
\end{description}
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%
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Der Ansatz wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{37}{\celsius} inkubiert. \SI{5}{\micro\liter} der Ansätze wurden für die
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Transformation von \acs{E. coli} XL1-Blue eingesetzt.
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\section{Mikrobiologische Methoden}
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\label{sec:mikrobiologische_methoden}
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\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
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\label{sec:transformation}
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Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation. \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetenter Zellen wurden auf
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Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-\acs{DNA} versetzt. Anschließend wurden die Zellen für \SI{15}{\minute} auf Eis inkubiert.
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Es folgte ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} von \SI{90}{\second} Dauer. Nach einer erneuten Inkubation auf Eis
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für \SI{2}{\minute} und der Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} \acs{2YT}-Medium wurden die Zellen für \SI{1}{\hour} unter leichtem
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Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
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Der \SI{150}{\micro\liter} des Ansatzes wurde anschließend auf \acs{2YT}"=Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin
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ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
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\subsection{Stammhaltung}
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\label{sec:stammhaltung}
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Die Stammhaltung erfolgte in \SI{20}{\percent}igen Glycerinkulturen bei \SI{-80}{\celsius}. Hierfür wurden \SI{800}{\micro\liter} einer Übernachtkultur
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(vgl.~\ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren.
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\subsection{Heterologe Expression in \acs{E. coli}}
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\label{sec:expression_ecoli}
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Die Transformation kompetenter Zellen erfolgte wie in \ref{sec:transformation} beschrieben. Die Anzucht erfolgte in \acs{2YT}-Medium
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mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin.
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\subsubsection{Expressionsstudien}
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\label{sec:expression_ecoli_studien}
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Die optimalen Bedingungen zur heterologen Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} wurden durch Expressionsstudien evaluiert, bei denen
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unterschiedliche Konzentrationen von \ac{IPTG} zur Induktion verwendet wurden. Es kamen hierbei die \acs{E. coli}"=Stämme BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3)
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zum Einsatz.
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Von den Agarplatten (vgl.~\ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
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\SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt.
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Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
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und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer
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\acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar}, \SI{0,5}{\milli\Molar} und \SI{1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
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Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Vier Stunden nach der Induktion bzw. am nächsten Tag
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wurden die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet.
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\subsubsection{Präparative Expression}
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\label{sec:praeparative_expression}
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Die heterologe Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} erfolgte mit den in den Expressionsstudien als besonders geeignet explorierten Bedingungen.
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Als Expressionsstamm kam \acs{E. coli} BL21 (DE3) zum Einsatz.
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Von den Agarplatten wurden Vorkulturen mit einem Volumen von \SI{100}{\milli\liter} in unschikanierten \SI{250}{\milli\liter}-Kolben angesetzt. Die
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Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der
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Hauptkulturen eingesetzt.
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Hierfür wurden \SI{2}{\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{500}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
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und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer
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\acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
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Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Am nächsten Tag wurden
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die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet. Die Zellpellets wurden in \SI{4}{\gram}-Aliquots
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in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für weitere Versuche bei \SI{-80}{\celsius} gelagert.
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\section{Präparative Methoden}
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\label{sec:praeparative_methoden}
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Aufgrund der Kältelabilität der \acs{PPDK} (vgl. \ref{sec:kaelte}), welche bei der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} besonder ausgeprägt ist \citep{Burnell1990}, wurden alle
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Schritte des Zellaufschlusses und der Reinigung -- wenn nicht abweichend angegeben -- bei Raumtemperatur durchgeführt.
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\subsection{Zellaufschluss}
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\label{sec:zellaufschluss}
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Ein Aliquot eingefrorener Zellen (siehe~\ref{sec:praeparative_expression}) wurde bei Raumtemperatur mit \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer,
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sowie einer Spatelspitze DNAse I (Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt und durch Vortexen resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch Hochdruckdispersion
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bei einem Druck von \SI{1,35}{\kilo\bar} und einer Temperatur von \SI{15}{\celsius}.
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\subsection{Proteinaufreinigung durch Affinitätschromatographie}
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\label{sec:affinitaetschromatographie}
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Proteine, die mit einem Poly-Histidin-Tag markiert sind, lassen sich über eine \acf{IMAC} aus
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einem Proteingemisch isolieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden HisTrap$^\text{\textregistered}$ HP-Säulen mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter}
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eingesetzt. Als Säulenmaterial dient quervernetzte Agarose an welche \acf{IDA} immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \acs{IDA} dreifach koordinativ
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komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion Poly-Histidin-markierter Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur
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Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über die Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu
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Histidin in der Lage ist, dieses kompetitiv aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen. Das nachfolgend beschriebene Reinigungsprotokoll wurde nach \citet{Nakanishi2003,Chastain1996}
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adaptiert.
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Die wie in \ref{sec:zellaufschluss} beschrieben aufgeschlossenen Zellen wurden zunächst bei \SI{10000}{\xg} und \SI{15}{\celsius} für \SI{30}{\minute}
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zentrifugiert um Zelltrümmer und \textit{Inclusion-Bodies} zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{100000}{\xg} und \SI{15}{\celsius}
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ulrazentrifugiert um lediglich lösliche Proteine im Überstand zu halten und Membranfragmente zu präzipitieren.
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Die mit \ce{Ni^{2+}} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \acs{ddH2O} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende
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\ce{Ni^{2+}} von der Säule zu eluieren und die Bildung von amorphem Nickel bei der nachfolgenden Benutzung der Puffer mit reduzierend wirksamen \acs{DTT}
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zu minimieren.
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Die Säule wurde mit Waschpuffer äquilibriert und das Zelllysat mit einer Flussrate von \SI{1,5}{\milli\liter\per\minute} auf die Säule geladen. Unspezifisch bindende Proteine wurden im Anschluss mit \SI{20}{\CV} Waschpuffer + \SI{50}{\milli\Molar} Imidazol von der Säule gelöst. Die Elution der \acs{PPDK} erfolgte dann mit je \SI{10}{\CV} Waschpuffer + \SI{150}{\milli\Molar}, \SI{200}{\milli\Molar} und \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Es wurden Fraktionen
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mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} gesammelt und ggf. vereinigt. Zur Detektion der Proteinfraktionen wurde die Absorption bei \SI{280}{\nano\meter} verfolgt.
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Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt und neu mit \ce{Ni^{2+}} beladen.
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\subsection{Konzentrierung von Proteinlösungen}
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\label{sec:konzentrierung}
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Proteinlösungen wurden durch zentrifugale Ultrafiltration bei \SI{20}{\celsius} und \SI{5000}{\xg} aufkonzentriert. Hierbei kamen Konzentratoren mit einer Ausschlussgröße
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von \SI{30}{\kilo\dalton} zu Einsatz.
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\subsection{Entsalzung von Proteinlösungen}
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\label{sec:entsalzung}
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Nach der Reinigung wurden Fraktionen, welche die \acs{PPDK} enthielten mittels Ultrafiltration (vgl.~\ref{sec:konzentrierung}) auf ein Volumen
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von etwa \SI{2,5}{\milli\liter} eingeengt. Zur Umpufferung des Konzentrats in Lagerungspuffer kam eine PD-10-Säule zum Einsatz. Es handelt sich
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hierbei um eine Größenauschlusschromatographie-Säule, bei welcher die Proteinanteile der Lösung eine wesentlich geringere Retentionszeit aufweisen,
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als die gelösten Salzionen und somit mit einem geringeren Volumen von der Säule eluieren.
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Die Säule wurde mit \SI{25}{\milli\liter} Lagerungspuffer äquilibriert und anschließend mit der konzentrierten Probe beladen. Anschließend wurde die
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Differenz des Probenvolumens zu \SI{2,5}{\milli\liter} durch Lagerungspuffer ausgeglichen. Die Elution erfolgte mit \SI{3,5}{\milli\liter}
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Lagerungspuffer. Die entsalzten Proben wurden erneut aufkonzentriert (vgl.~\ref{sec:konzentrierung}).
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\subsection{Lagerung von PPDK-Konzentraten}
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\label{sec:lagerung}
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Die kurzfristige Lagerung (max.~\SI{24}{\hour}) entsalzter \acs{PPDK}-Konzentrate (vgl.~\ref{sec:entsalzung}) erfolgte nach Zugabe von \SI{1}{\percent}iger
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\ac{NaN3}-Lösung im Verhältnis 1:1000 bei Raumtemperatur.
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Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v) Glycerin bei \SI{-20}{\celsius} gelagert.
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\section{Analytische Methoden}
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\label{sec:analytische_methoden}
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\subsection{Differentielle Zentrifugation}
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\label{sec:differentielle_zentrifugation}
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Nach dem Zellaufschluss (vgl.~\ref{sec:zellaufschluss}) wurde eine Probe von \SI{10}{\micro\liter} aus dem Zelllysat als Kontrolle entnommen. Anschließend wurde das Zelllysat bei \SI{2000}{\xg} für \SI{15}{\minute} bei \SI{15}{\celsius} zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde im gleichen Volumen Aufschlusspuffer unter Zusatz von \SI{0,1}{\percent} (w/v) \acs{SDS} bei Raumtemperatur und unter Rühren rückgelöst.
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Sowohl vom Überstand, als auch vom resuspendierten Pellet wurden jeweils weitere Proben von \SI{10}{\micro\liter} Volumen entnommen. Diese wurden mit \SI{25}{\micro\liter} \acs{SDS}-Probenpuffer und \SI{65}{\micro\liter} \acs{ddH2O} versetzt. Alle weiteren Zentrifugationsschritte erfolgten hierzu analog und sind in Tabelle \ref{tab:differentielle_zentrifugation} aufgeführt.
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%
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption{Zentrifugationsschritte der differentiellen Zentrifugation}
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\begin{tabularx}{0.85\textwidth}{rcX}
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\toprule
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\textbf{\acs{rcf} [\si{\xg}]} & \textbf{Dauer [\si{\minute}]} & \textbf{Sediment}\\
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\midrule
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2000 & 15 & Nicht aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer\\
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10000 & 30 & Aggregierte Proteine (\textit{Inclusion Bodies})\\
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30000 & 30 & Große Membransysteme und assoziierte Proteine\\
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100000 & 60 & Kleine Membransysteme und assoziierte Proteine\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\label{tab:differentielle_zentrifugation}
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\end{table}
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\subsection{Größenauschlusschromatographie}
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\label{sec:groessenausschluss}
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Um die Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmen, wurde ein entsalztes Konzentrat (vgl.~\ref{sec:entsalzung}) nach der Reinigung mittels
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\acs{IMAC} (vgl.~\ref{sec:affinitaetschromatographie}) einer analytischen Größenausschlusschromatographie unterzogen. Hierbei dient die Säulenmatrix
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als Molekularsieb. Höhermolekulare Anteile eluieren hierbei schneller von der Säule, als niedermolekulare Anteile, da letztere in die Poren des
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Säulenmaterials eindringen können.
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In dieser Arbeit wurde eine Superdex 200 5/150 GL-Säule der Firma GE Healthcare (Uppsala, SE) mit einem Säulenvolumen von \SI{3}{\milli\liter}
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eingesetzt.
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Die Säule wurde mit \SI{5}{\CV} Lagerungspuffer äquilibriert und anschließend mit \SI{50}{\micro\liter} Probe in Lagerungspuffer beladen. Die
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Detektion erfolgte durch Absorptionsmessung bei \SI{280}{\nano\meter}. Eluiert wurde mit \SI{2}{\CV} Lagerungspuffer bei einer Flussrate von
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\SI{0,2}{\milli\liter\per\minute}.
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\subsection{SDS-\acl{PAGE}}
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\label{sec:sds_page}
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Die Proteinproben wurden auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen und dort nach ihrer Masse aufgetrennt
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\citep{Laemmli1970}. Durch die Zugabe von \ac{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einer negativen
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Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Somit ist die Wanderungsgeschwindigkeit
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im elektrischen Feld allein von der Proteinmasse abhängig. Vor dem Auftragen auf das Geld wurden alle Proben mit
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4\texttimes-Probenpuffer versetzt. Expressionsproben wurden darüber hinaus für \SI{10}{\minute} auf \SI{95}{\celsius} erhitzt.
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Im Falle der Expressionsproben errechnete sich das Auftragungsvolumen für große bzw. kleine Gele nach Gleichung \eqref{eq:page_gross} und \eqref{eq:page_klein}.
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\begin{align}
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\label{eq:page_gross}
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V_\text{groß}~[\si{\micro\liter}] &= \frac{15}{OD_{600}}\\
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\label{eq:page_klein}
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V_\text{klein}~[\si{\micro\liter}] &= \frac{15}{OD_{600}} \ \cdot 0,75
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\end{align}
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%
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Für die Elektrophorese wurden \SI{10}{\percent}ige Gele eingesetzt. Tabelle \ref{tab:pipettierschema_sds_page} zeigt exemplarisch eine
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Pipettierschema für drei kleine Gele (\SI{9}{\centi\meter}~\texttimes~\SI{10}{\centi\meter}).
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
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\begin{tabular}{lSsSs}
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\toprule
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& \multicolumn{2}{c}{\textbf{Trenngel}} & \multicolumn{2}{c}{\textbf{Sammelgel}}\\
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\midrule
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\acs{AA/BAA} 30 & 10,9 & \milli\liter & 2 & \milli\liter \\
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Trenn-/Sammelgelpuffer & 13,2 & \milli\liter & 2,5 & \milli\liter \\
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\acs{ddH2O} & 8,6 & \milli\liter & 7,4 & \milli\liter \\
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\acs{TEMED} & 16,5 & \micro\liter & 12,3 & \micro\liter \\
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\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & 112,2 & \micro\liter & 129 & \micro\liter \\
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\bottomrule
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% \toprule
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% & {\textbf{Trenngel}} & & {\textbf{Sammelgel}} & \\
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% \midrule
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% \acs{AA/BAA} 30 & 10,9 & \milli\liter & 2 & \milli\liter}\\
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% Trenn-/Sammelgelpuffer & 13,2 & \milli\liter & 2,5 & \milli\liter}\\
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% \acs{ddH2O} & 8,6 & \milli\liter & 7,4 & \milli\liter}\\
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% \acs{TEMED} & 16,5 & \micro\liter & 12,3 & \micro\liter}\\
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% \acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & 112,2 & \micro\liter & 129 & \micro\liter}\\
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% \bottomrule
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\end{tabular}
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\label{tab:pipettierschema_sds_page}
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\end{table}
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Um die Größenzuordnung der Proteinbanden zu gewährleisten, wurden die in \ref{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren} genannten
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Standards eingesetzt. Bei kleinen Gelen wurde nach dem Beladen für \SI{1}{\hour} eine Stromstärke von \SI{35}{\milli\ampere} je Gel angelegt.
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Große Gele liefen über Nacht bei \SI{50}{\milli\ampere}.
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\subsection{Kolloidale Coomassie-Färbung}
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\label{sec:faerbung_coomassie}
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Mit der kolloidalen Coomassie-Färbung nach \citet{Kang2002} lassen sich Proteine in Polyacrylamid-Gelen bis zu einer Nachweisgrenze von etwa \SI{1}{\nano\gram}
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detektieren. Sie ist damit ähnlich sensitiv wie eine Silberfärbung.
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Die Gele wurden drei Mal für jeweils \SI{10}{\minute} in \acs{ddH2O} gewaschen und anschließend für mindestens \SI{2}{\hour} in der Färbelösung
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inkubiert. Nach dieser Zeit sind etwa \SI{90}{\percent} der maximalen Farbintensität erreicht \citep{Kang2002}. Eine Entfärbung des Hintergrunds kann durch mehrfaches
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Waschen mit \acs{ddH2O} erreicht werden.
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\subsection{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen}
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\label{sec:westernblot}
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Über einen Westernblot können Proteine aus einem SDS-Gel elektrophoretisch auf einen Membran übertragen und dort fixiert werden.
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Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteine auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das
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Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.
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Es wurde ein gefärbter Proteingrößenstandard bei Gelen verwendet, welche für einen Westernblot vorgesehen waren. Das Gel wurde für etwa
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\SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die Nitrozellulosemembran und, sowie die Filterpapiere wurden ebemfalls
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kurz mit Transferpuffer getränkt.
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Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolgt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen
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Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von
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\SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.
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Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in \acs{TBS} auf einem
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Rotationsschüttler inkubiert. Im Anschluss erfolgten zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute}.
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Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-\acs{HRP}-Antikörper im Verhältnis 1:10000
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enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten
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wiederum zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper konnte dann über die gekoppelte
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Meerrettich-Peroxidase (\acs{HRP}) mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. Die \acs{HRP} oxidiert in Anwesenheit von
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Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es zu einer Lichtemission kommt.
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Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor (LAS 4000 mini, Fujifilm) eingesetzt.
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\clearpage
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\subsection{Konzentrationsbestimmung von Proteinen}
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\label{sec:konzentrationsbestimmung_proteine}
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Die Konzentration von Proteinen wurde nach \citet{Bradford1976} bestimmt. Hierzu wurde in einer Mikrotiterplatte \SI{50}{\micro\liter} einer
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Verdünnung der zu vermessenden Proteinlösung mit \SI{200}{\micro\liter} Bradford-Reagenz aus dem Roti$^{\text{\textregistered}}$-Quant-Kit versetzt.
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Die Probe wurde für \SI{5}{\minute} bei Raumtemperatur inkubiert und die Absorption bei \SI{595}{\nano\meter} gemessen.
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Die Berechnung der Proteinkonzentration erfolgte anhand einer mit bovinem Serumalbumin \acs{BSA} erstellten Kalibriergeraden. Alle Messungen erfolgten in Dreifachbestimmung.
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\subsection{\acl{CD}-Spektroskopie}
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\label{sec:cd_spektroskopie}
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Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken
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ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen
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weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$
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auf, wobei letztlich ihre Differenz \textDelta\textepsilon~gemessen und als Elliptizität \texttheta~angegeben wird -- d sei die Schichtdicke und c
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die Konzentration \citep{Greenfield2007}:
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\begin{equation}
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\theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
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\end{equation}
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Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von
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\SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n~\textrightarrow~\textpi$^*$ bzw.
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\textpi~\textrightarrow~\textpi$^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr
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empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{Greenfield2007}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration
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von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und
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Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.
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\subsection{Aktivitätstest}
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\label{sec:aktivitaetsassay}
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Um die Aktivität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmten, wurde ein Aktivitätstest \citep{Salahas1990} durchgeführt. Hierbei wurde die \ac{PEP}-Bildung
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in einem gekoppelten Enzymtest über den \acs{NADH}"=Verbrauch verfolgt. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist in diesem Fall die Umsetzung
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von Pyruvat, anorganischem Phosphat und \acs{ATP} zu \acl{PEP}, \acs{AMP} und Pyrophosphat \eqref{eq:aktivitaet_1}. Nachfolgend wird \acl{PEP} durch
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die \acl{PEPCase} über eine \textbeta-Carboxylierung mit Hydrogencarbonat zu Oxalacetat umgesetzt \eqref{eq:aktivitaet_2}. Letzteres wird durch eine
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NAD-abhängige Malatdehydrogenase zu Malat reduziert \eqref{eq:aktivitaet_3}. Die Reaktionsabfolge entspricht somit einem Teil des Reaktionszyklus zur \ce{CO2}"=Fixierung in \ce{C_4}"=Pflanzen (vgl. \ref{sec:c4_ppdk}).
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\begin{align}
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\cee{
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\label{eq:aktivitaet_1}
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\text{Pyruvat} + ATP + P_i <=>[PPDK] PEP + AMP + PPi\\
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\label{eq:aktivitaet_2}
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PEP + HCO3- ->[PEPCase] \text{Oxalacetat} + Pi \\
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\label{eq:aktivitaet_3}
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\text{Oxalacetat} + NADH <=>[NAD-MDH] \text{Malat} + NAD
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}
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\end{align}
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%
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Der \acs{NADH}-Verbrauch kann photometrisch über die Abnahme der \acs{NADH}"=spezifischen Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} verfolgt werden. Da der
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Verbrauch eines \acs{NADH}"=Moleküls gleichbedeutend ist mit der Bildung eines \ac{PEP}-Moleküls durch die \acs{PPDK}, kann aus dem Verbrauch an
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\acs{NADH} direkt auf die Bildungsrate von \ac{PEP} und somit auf die Aktivität der \acs{PPDK} geschlossen werden.
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Der Reaktionsansatz nach \citet{Salahas1990} wurde mit \SI{0,5}{\micro\liter} gereinigtem und entsalztem
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\acs{PPDK}-Konzentrat versetzt (vgl.~\ref{sec:puffer_aktivitaetsassay}). Die \acs{PPDK}-Lösung wurde zuvor für \SI{30}{\minute} bei \SI{30}{\celsius} inkubiert, um eine möglichst vollständige
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Aktivierung zu erreichen \citep{Ashton1990}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{2,5}{\milli\liter} einer \SI{100}{\milli\Molar} \acs{ATP}-Lösung
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(Endkonzentration: \SI{1,25}{\milli\Molar}) gestartet und die Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} über einen Zeitraum von \SI{3}{\minute} bei \SI{30}{\celsius}
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aufgezeichnet.
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Der Verbrauch an \acs{NADH} kann über das Lambert-Beer'sche Gesetz in Gleichung \eqref{eq:lambert_beer} aus der gemessenen Extinktion mit Hilfe des molaren Extinktionskoeffizienten für NADH
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$\epsilon_{340} = \SI{6,3e3}{\per\Molar\per\centi\meter}$ \citep{McComb1976} und der Schichtdicke berechnet werden.
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%
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\begin{samepage}
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\begin{align}
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\label{eq:lambert_beer}
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E = \epsilon \cdot c \cdot d
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\intertext{$\epsilon$: molarer Extinktionskoeffizient \newline $c$: Konzentration \newline $d$: Schichtdicke}\nonumber
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\end{align}
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\end{samepage}
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\section{Bioinformatische Methoden}
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\label{sec:bioinformatische_methoden}
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\subsection{Analyse von \ac{CD}-Spektren}
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\label{sec:analyse_cd_spektren}
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Aufgenommene CD-Spektrem (siehe \ref{sec:cd_spektroskopie}) wurden mit dem Programmpaket \textit{CDPro} \citep{Sreerama2000}, sowie
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dem Programm \textit{K2D3} \citep{Louis-Jeune2011} untersucht. Die Analyse erfolgte jeweils in einem Wellenlängenbereich von \SIrange{190}{240}{\nano\meter}.
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Für das Programmpaket \textit{CDPro} wurde die Datenbank SMP56 mit 43 löslichen und 13 Membranproteinen als Grundlage der Vorhersage verwendet.
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Die berechneten Sekundärstrukturanteile wurden dann mit mit einer \textit{ab initio} Vorhersage, welche mit \acs{SOPMA} \citep{Geourjon1995a}
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berechnet wurde verglichen. Zusätzlich wurden die Sekundärstrukturanteile aus der bereits bekannten \acs{PPDK}-Struktur aus \textit{Zea mays}
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herangezogen.
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\subsection{Alignment von Nuklein- und Aminosäuresequenzen}
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\label{sec:alignment}
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Alignments von Nuklein- und Aminosäuren wurden mit dem Programm \textit{T-Coffee} \citep{Notredame2000,Wallace2006,Moretti2007,DiTommaso2011} erstellt. Das Programm \textit{Bowtie 2}
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\citep{Langmead2012} kam zum Einsatz, um \textit{Reads} aus der Sequenzierung an die Referenzsequenz zu alignieren.
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\subsection{Erstellung von Homologiemodellen}
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\label{sec:erstellung_homologiemodell}
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Zur Visualisierung der wahrscheinlichen dreidimensionalen Struktur der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} und zur Vorbereitung zukünftiger Analysen
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wurden Homologiemodelle erstellt. Diese basieren auf den aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBG/1VBH) und \textit{Chlostridium symbiosum} (PDB: 1KBL) bekannten
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Extremkonformationen des putativen \textit{Domain-swiveling}-Mechanismus.
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Jeweils fünf Homologiemodelle wurden mit dem Programm \textit{Modeller} \citep{Sali1993a} aus den jeweiligen Templaten und der Primärstruktur der
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\acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Rosche1990} generiert. Im Falle des von \textit{Zea mays} abgeleiteten Modells wurde als Vorlage die Pyruvat gebundene Struktur
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verwendet (PDB: 1VBH). Lücken in der dreidimensionalen Struktur wurden anhand der ungebundenen Struktur (PDB: 1VBG) ergänzt. Um die Substratbindetasche möglichst
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exakt zu nachzubilden, wurde das in der Kristallstruktur 1VBH vorhandene \acs{PEP}-Molekül, sowie das \ce{Mg^{2+}}-Ion beim Modellieren berücksichtigt.
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Die Evaluation der erstellten Modelle erfolgte mit dem Programmpaket \textit{PROCHECK} \citep{Laskowski1993,Laskowski1996}.
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