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\chapter{Diskussion}
\section{Expression und Reinigung der \acs{PPDK}}
Die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} konnte erfolgreich in \acs{E. coli} BL21 (DE3) exprimiert werden. Sowohl in einer vierstündigen Expression,
als auch in einer Expression über Nacht zeigten sich in der differentiellen Zentrifugation nur geringe unlösliche Anteile, gemessen an der
Gesamtmenge Protein (vgl. \ref{sec:ergebnisse_dz}). Dies spricht dafür, dass nur in geringem Maße \textit{Inclusion Bodies} gebildet wurden und legt die
Vermutung nahe, das der lösliche Proteinanteil nativ gefaltet ist.

Dies konnte durch die \acs{CD}-Spektroskopie gestützt werden. Es konnten Sekundärstrukturanteile nachgewiesen werden, welche sich mit 
Sequenz basierten \textit{ab initio} Vorhersagen, sowie bekannten Strukturdaten decken (vgl. Tabelle \ref{tab:cd}). In einem letzten Schritt konnte die tatsächlich funktionelle
Faltung der rekombinanten \acs{PPDK} in einem Aktivitätsassay gezeigt werden.

Im Rahmen der Reinigung konnten mit steigender Imidazolkonzentration insgesamt drei Fraktionen \acs{PPDK} gewonnen werden, die eine jeweils hohe Reinheit aufweisen (vgl. \ref{abb:reinigung_sds} und sich 
durch ihre Dispersität unterscheiden (siehe Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}). Der Oligomerisierungsgrad beeinflusst offenbar die Bindungsaffinität der \acs{PPDK} an die Säule, 
was zu einem unterschiedlichen Elutionsverhalten führt. Ursächlich könnte eine zunehmende Maskierung des Hexa-Histidin-Tags in den Oligomeren sein. Eine zuverlässige Größenzuordnung
konnte in der Größenausschluschromatographie aufgrund der sehr eng zusammen liegenden Elutionsvolumina nicht vorgenommen werden. Es konnte aber gezeigt werden, dass
die bei \SI{250}{\milli\Molar} gewonnene Fraktion monodispers vorliegt und sich somit gut für zukünftige Kristallisationsexperimente eignet.

Die Proteinausbeute liegt -- betrachtet man nur die monodispers gereinigte Fraktion -- bei etwa \SI{47}{\milli\gram\per\liter} Kulturmedium und ist somit als
hoch einzuschätzen. Der in der Literatur beschriebene Effekt der ausgeprägten Kältelabilität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Burnell1990},
welcher zum Zerfall der funktionellen Tetramere in Monomere führt, ließe sich unter Umständen zur Erhöhung der effektiv nutzbaren Ausbeute einsetzen. Durch eine 
Vereinigung aller gereinigter PPDK-Fraktionen und anschließender Kältebehandlung sollte zu einer einheitlichen Population der PPDK-Monomere führen. Die Ausbeute
beträgt dann etwa \SI{118}{\milli\gram\per\liter} Kultur.

\section{Aktivität der gereinigten PPDK}
Die spezifische Aktivität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} liegt mit \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram} in der \acs{PEP}-bildenden Richtung in der Größenordnung
von Literaturwerten für \textit{Zea mays} \citep{Hatch1975}. In ähnlicher Weise stimmen auch die bestimmten \ce{K_m}-Werte für ATP \SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} und
Pyruvat \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar} mit bekannten Literaturwerten von \textit{Zea mays} und \textit{F. brownii} überein \citep{Hatch1975,Ohta1997}, die ebenfalls
im zwei- bis dreistelligen mikromolaren Bereich liegen. Ein Vergleich der experimentellen Daten mit Literaturwerten ist in Tabelle \ref{tab:literatur} aufgeführt.
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\begin{table}[htb]
 \centering
 \begin{threeparttable}
 \caption[Vergleich der kinetischen Parameter mit Literaturwerten]{Vergleich der kinetischen Parameter mit Literaturwerten der PPDK aus \textit{F. bidentis}, \textit{F. brownii} und \textit{Zea mays}.
          Die Literaturwerte beziehen sich jeweils auf die \acs{PEP}-bildende Reaktion.}
 \label{tab:literatur}
 
 \begin{tabular}{llll}
  \toprule
  \multirow{2}{*}{\textbf{Spezies}} & \multicolumn{2}{c}{\textbf{\ce{K_m} [\si{\micro\Molar}]}} & \multirow{2}{*}{\textbf{spez. Aktivität [\si{\Unit\per\milli\gram}]}} \\
                                    & \textbf{ATP} & \textbf{Pyruvat} & \\
  \midrule
  \acs{F. trinervia}   & \num[seperr]{50(9)}  & \num[seperr]{270(44)} & \num[seperr]{ 0,99(9)}          \\
  \midrule
  \textit{F. bidentis} & 25\tnote{2}     & 73\tnote{2}     &                  \\
  \textit{F. brownii}  & 88\tnote{2}     & 67\tnote{2}     &                  \\
  \textit{Zea mays}    & 95\tnote{2}     & 158\tnote{2}     & 1,2\tnote{1}     \\
  \bottomrule
 \end{tabular}
 \begin{tablenotes}
  \item[1] \citet{Hatch1975}
  \item[2] \citet{Ohta1997}
 \end{tablenotes}

\end{threeparttable}
\end{table}

\ce{V_{max}} wurde im Rahmen der nichtlinearen Regression für \acs{ATP} und Pyruvat bestimmt. Unter Berücksichtigung der Standardabweichung sind die beiden Werte 
-- \SI[seperr]{0,095(5)}{\milli\Molar\per\minute} (ATP) und \SI[seperr]{0,093(5)}{\milli\Molar\per\minute} (Pyruvat) -- als identisch anzusehen. Dies entspricht der
Erwartung, da die maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung in beiden Fällen identisch sein sollte.

Der beobachtete Abfalls der gemessenen Reaktionsgeschwindigkeit bei einer \acs{ATP}-Konzentration von \SI{2,5}{\milli\Molar} (Abbildung \ref{abb:kinetik_atp}) ist auf
die inhibitorische Wirkung von \acs{ATP}, \acs{ADP} und \acs{AMP} auf die als letzte Stufe des gekoppelten Enzymassays eingesetzte \acs{MDH} zurückzuführen \citep{Harris}. Bei einer \acs{ATP}-Konzentration 
von \SI{2,5}{\milli\Molar} ist nicht mehr die Pyruvat-Bildung durch die \acs{PPDK}, sondern die Umsetzung des Oxalacetats durch die \acs{MDH} der geschwindigkeitsbestimmende Schritt.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Aktivität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} in etwa vergleichbar mit anderen bekannten PPDKs ist.

\section{Homologiemodelle}
Die erstellten Homologiemodelle weisen nach einer Analyse mit PROCHECK keine auffälligen Anomalien auf, so dass die Modelle als hinreichend korrekt angesehen werden können.
Da die \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} zudem eine hohe Sequenzidentität von \SI{79}{\percent} zur \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} aufweist, bietet das hierauf basierende
Modell eine gute Annäherung an die tatsächliche dreidimensionale Struktur der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}, insbesondere in Hinblick auf die räumliche Ausrichtung
der Seitenketten in der \acs{PEP}-Bindetasche. In Kombination mit der Identifikation hoch konservierter Sequenzabschnitte können einige für die \acs{PEP}-Bindung und
Umsetzung wichtige Reste identifiziert werden \citep{Nakanishi2005}: Arg562, Arg619, Arg669, Glu748, Asp772 und Asn771, sowie Cys834, welches als Protonen-Donor fungiert (Abbildung \ref{abb:substratbindetasche}).
Durch gezielte Mutation dieser Reste kann in zukünftigen Experimenten ihr Einfluss auf die Aktivität und Stabilität der \acs{PPDK} untersucht werden.

\section{Ausblick}
Die im Rahmen dieser Arbeit gereinigte \acs{PPDK} liegt in hoher Konzentration, monodispers und hoher Reinheit vor, so dass sie in Kristallisationsexperimente eingesetzt
werden kann. Eine erfolgreiche Kristallisation ist dann notwendig für die Strukturaufklärung mittels Röntgenkristallographie. Zusätzlich können anhand der erstellten
Homologiemodelle \textit{in silico} Analysen durchgeführt werden. Beispielsweise kann nach Bindetaschen für Effektoren gesucht werden, welche das \textit{Domain-Swiveling}
in distinkten Zwischenstadien halten. Sobald Kristallisationsbedingungen für die wildtypische Form etabliert sind, können diese für die Co-Kristallisation mit den gefundenen
Effektoren adaptiert werden. Letztere können darüber hinaus direkt mit Hilfe des etablierten Aktivitätsassays auf ihren Einfluss auf die \acs{PPDK}-Aktivität hin untersucht werden. 
Aus den resultierenden Strukturdaten ließen sich dann intermediäre Konformationen ableiten, die zu einem genaueren Verständnis der Funktionalität
der \acs{PPDK} führen können. Mittels einer Netzwerkanalyse ließen sich zusätzlich Regionen innerhalb der \acs{PPDK} identifizieren, welche für die Flexibilität der zentralen
Phospho"=Histidin"=Domäne verantwortlich sind. Hier bietet sich ein weiterer Ansatzpunkt um beispielsweise über \textit{Cross-Linking} Zwischenkonformationen zu stabilieren.