Diskussion und Anhang; Zusammenfassung
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5c88437dfd
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pages = {1222}
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@article{geourjon_sopma:_1995,
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title = {{SOPMA:} significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments},
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volume = {11},
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issn = {0266-7061},
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url = {http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8808585},
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abstract = {Recently a new method called the self-optimized prediction method {(SOPM)} has been described to improve the success rate in the prediction of the secondary structure of proteins. In this paper we report improvements brought about by predicting all the sequences of a set of aligned proteins belonging to the same family. This improved {SOPM} method {(SOPMA)} correctly predicts 69.5\% of amino acids for a three-state description of the secondary structure (alpha-helix, beta-sheet and coil) in a whole database containing 126 chains of non-homologous (less than 25\% identity) proteins. Joint prediction with {SOPMA} and a neural networks method {(PHD)} correctly predicts 82.2\% of residues for 74\% of co-predicted amino acids. Predictions are available by Email to deleage@ibcp.fr or on a Web page (http:@www.ibcp.fr/predict.html).},
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number = {6},
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journal = {Computer Applications in the Biosciences: {CABIOS}},
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author = {C Geourjon and G Deléage},
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month = dec,
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year = {1995},
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note = {{PMID:} 8808585},
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keywords = {Databases, Factual, Neural Networks {(Computer),} Proteins, Protein Structure, Secondary, Sequence Alignment, Sequence Homology, Amino Acid, Software},
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pages = {681--684}
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},
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@book{wedler_lehrbuch_2004,
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edition = {5., vollst. überarb. und aktualisierte Aufl.},
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year = {2006}
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@article{yukl_kinetic_2010,
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title = {Kinetic and Spectroscopic Studies of Hemin Acquisition in the Hemophore {HasAp} from Pseudomonas aeruginosa},
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volume = {49},
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issn = {0006-2960},
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url = {http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi100692f},
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doi = {10.1021/bi100692f},
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number = {31},
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journal = {Biochemistry},
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author = {Erik T. Yukl and Grace Jepkorir and Aileen Y. Alontaga and Lawrence Pautsch and Juan C. Rodriguez and Mario Rivera and Pierre {Moenne-Loccoz}},
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year = {2010},
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pages = {6646--6654}
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},
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@article{resnick_involvement_2008,
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title = {Involvement of {RTE1} in conformational changes promoting {ETR1} ethylene receptor signaling in Arabidopsis},
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volume = {56},
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@book{lottspeich_bioanalytik_2006,
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edition = {2. Aufl.},
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title = {Bioanalytik},
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isbn = {9783827415202},
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5
TODO.txt
5
TODO.txt
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- Weitere Kd-Werte angeben (andere Häm-bindende Proteine) -> Verifikation der eigenen Daten (Plausabilität)
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- Abweichung (5 µM zu 25 µM) u.U. durch heteronege Proben und unterschiedliche Präps
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- Ausblick: denat. Reinigung, Bindungsassay etabliert
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- Verwendete Bakterienstämme
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- Weitere Untersuchung mit DTT: Reduktion mit DTT, Modifizierung mit NEM, Entfernung von DTT -> Photometrie und FS
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\onehalfspacing % 1,5facher Zeilenabstand
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\usepackage[draft,kerning,spacing,protrusion=true,expansion,babel=true]{microtype} %Mikrotypographie (erweitertes Kerning, etc.)
|
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|
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\usepackage{acronym} % Abkürzungen und Abkürzungsverzeichnis
|
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\usepackage[alsoload=synchem,locale=DE,loctolang={DE:ngerman},obeyall=true,decimalsymbol={{{,}}},tophrase={{ bis }}]{siunitx} % SI-Einheiten
|
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|
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@ -16,8 +16,10 @@
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\usepackage{longtable} % Seitenüberspannende Tabellen
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@ -79,7 +81,7 @@
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\large
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|
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\vfill
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||||
Zur Erlangung des Bachelorgrades\\ (Bachelor of Science - Biochemistry)
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@ -95,7 +97,9 @@
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%\maketitle
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\tableofcontents
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\onehalfspacing
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265
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\documentclass[a4paper,fontsize=13pt,utf8,titlepage=true,toc=bibliography,captions=tableheading,DIV=12,BCOR=1cm]{scrreprt} %Dokumentenklasse
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\usepackage[utf8]{inputenc} % Eingabekodierung UTF-8
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\usepackage[T1]{fontenc} % Schriftkodierung
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\usepackage{libertine} % Schriftarten 'Linux Libertine' und 'Linux Biolinum'
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||||
\usepackage[ngerman]{babel} % Neue Deutsche Rechtschreibung/Silbentrennung mit griechischen Buchstaben
|
||||
\usepackage{setspace} % Paket für das Setzen des Zeilenabstandes
|
||||
\onehalfspacing % 1,5facher Zeilenabstand
|
||||
\usepackage[draft,kerning,spacing,protrusion=true,expansion,babel=true]{microtype} %Mikrotypographie (erweitertes Kerning, etc.)
|
||||
\usepackage{acronym} % Abkürzungen und Abkürzungsverzeichnis
|
||||
\usepackage[alsoload=synchem,locale=DE,loctolang={DE:ngerman},obeyall=true,decimalsymbol={{{,}}},tophrase={{ bis }}]{siunitx} % SI-Einheiten
|
||||
\newunit{\bp}{bp} % Definition eigener Einheiten: Basenpaare
|
||||
\newunit{\kb}{kb} % Definition eigener Einheiten: Kilo-Basenpaare
|
||||
\newunit{\Unit}{U} % Definition eigener Einheiten: Unit
|
||||
\newunit{\rpm}{rpm} % Definition eigener Einheiten: Umdrehungen/Minute
|
||||
\newunit{\g}{x g} % Definition eigener Einheiten: relative Erdbeschleunigung
|
||||
\newunit{\psi}{psi} % Definition eigener Einheiten: Pounds per inch
|
||||
\newunit{\CV}{CV}
|
||||
\newunit{\AS}{AS}
|
||||
|
||||
\usepackage{cpssp}
|
||||
\usepackage{listings}
|
||||
\lstset{breaklines=true,basicstyle=\footnotesize}
|
||||
\usepackage{tabularx} % Tabellen mit fester Breite
|
||||
\usepackage{longtable} % Seitenüberspannende Tabellen
|
||||
\usepackage{booktabs} % 'Hübsche' Tabellen ohne vertikale Linien
|
||||
\usepackage{multirow} % Mehrzeilige Tabellen
|
||||
\usepackage{graphicx} % Grafikerweiterung
|
||||
\usepackage[caption=false]{subfig} % Unterabbildungen
|
||||
\usepackage[version=3]{mhchem} % Darstellung chemischer Summenformeln
|
||||
\usepackage{natbib} % Naturwissenschaftliche Zitierungsstile
|
||||
%\usepackage[format=hang]{caption}[2008/08/24] % Formatierung von Bildunter-/Tabellenüberschriften
|
||||
\usepackage[format=plain,small]{caption}[2008/08/24]
|
||||
\usepackage[fixlanguage]{babelbib} % Sprachanpassung für Literaturverzeichnis
|
||||
\selectbiblanguage{ngerman} % s.o.
|
||||
\usepackage{hyperref} % PDF-Eigenschaften (s.u.)
|
||||
\hypersetup{
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unicode=true, % non-Latin characters in Acrobat’s bookmarks
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pdftoolbar=true, % show Acrobat’s toolbar?
|
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pdfmenubar=true, % show Acrobat’s menu?
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pdffitwindow=false, % window fit to page when opened
|
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pdfstartview={FitH}, % fits the width of the page to the window
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pdfkeywords={Bachelorarbeit, RTE1, Ethylen, Arabidopsis thaliana}, % list of keywords
|
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pdfnewwindow=true, % links in new window
|
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|
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citecolor=black, % color of links to bibliography
|
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filecolor=black, % color of file links
|
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urlcolor=black % color of external links
|
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||||
|
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%Griechische Buchstaben/Symbole in Hauptschriftart für den Textmodus
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|
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|
||||
|
||||
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|
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\titlehead{\centering \includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.4\textwidth]{./img/hhulogo.png}}
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||||
\subject{Biochemie der Pflanzen\\Abteilung für biochemische Pflanzenphysiologie}
|
||||
\title{Bachelorarbeit}
|
||||
\subtitle{Molekulare Charakterisierung von \acs{RTE1} aus \acl{A. thaliana}}
|
||||
\author{Alexander Ralph Michael Minges}
|
||||
|
||||
\begin{document}
|
||||
|
||||
\begin{titlepage}
|
||||
\begin{center}
|
||||
\large
|
||||
\vspace*{\fill}
|
||||
\includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.4\textwidth]{./img/hhulogo.png}\\
|
||||
Institut für Biochemie der Pflanzen\\ Abteilung für biochemische Pflanzenphysiologie
|
||||
\vfill
|
||||
\Huge
|
||||
\textsf{\textbf{Bachelorarbeit}}
|
||||
|
||||
\normalsize
|
||||
\textsf{\textbf{Molekulare Charakterisierung von \acs{RTE1} aus \acl{A. thaliana}}}
|
||||
\vfill
|
||||
Zur Erlangung des Bachelorgrades\\ (Bachelor of Science - Biochemistry)
|
||||
\vfill
|
||||
vorgelegt von \\ \textbf{Alexander Ralph Michael Minges \\ (1804535)}
|
||||
\vfill
|
||||
im September 2010
|
||||
\vfill \begin{description}
|
||||
\item[Erstprüfer:]{Univ. Prof. Dr. G. Groth\\ Institut für Biochemie der Pflanzen \\ Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf}
|
||||
\item[Zweitprüfer:]{Univ. Prof. Dr. L. Schmitt\\ Institut für Biochemie \\ Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf}
|
||||
\end{description}
|
||||
\end{center}
|
||||
\end{titlepage}
|
||||
|
||||
%\maketitle
|
||||
\tableofcontents
|
||||
\clearpage
|
||||
|
||||
\begin{figure}[htbp]
|
||||
\cpsspLabel{-0.0}{RTE1 SOPMA}
|
||||
\cpsspStartRes{-0.0}{2.5}{1}
|
||||
\cpsspSheet{-0.0}{2.5}{2.75}
|
||||
\cpsspTurn{-0.0}{2.75}{3.75}
|
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\cpsspCoil{-0.0}{3.75}{4.5}
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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\cpsspLabel{-4.5}{RTE1 SABLE}
|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
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|
||||
\cpsspEndRes{-10.5}{3.5}{254}
|
||||
\end{figure}
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||||
|
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|
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\include{./inc/zusammenfassung}
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|
||||
\include{./inc/einleitung}
|
||||
|
||||
\include{./inc/material}
|
||||
|
||||
\include{./inc/ergebnisse}
|
||||
|
||||
\include{./inc/diskussion}
|
||||
|
||||
\listoffigures
|
||||
\addcontentsline{toc}{chapter}{Abbildungsverzeichnis}
|
||||
|
||||
\listoftables
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||||
\addcontentsline{toc}{chapter}{Tabellenverzeichnis}
|
||||
|
||||
\nocite{voet-van-vormizeele_mutants_2008}
|
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\nocite{duncan_heme-binding_1999}
|
||||
\nocite{vincent_protein_1985}
|
||||
\bibliographystyle{natdin}
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\bibliography{./Bibliothek}
|
||||
|
||||
\include{./inc/abkuerzungen}
|
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|
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\include{./inc/anhang}
|
||||
|
||||
\end{document}
|
||||
82
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Normal file
82
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@ -0,0 +1,82 @@
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\cpsspLabel{-4.5}{RTE1 SOPMA}
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\cpsspCoil{-4.5}{13.25}{14.25}
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\cpsspEndRes{-4.5}{15.0}{200}
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|
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\cpsspCoil{-6.0}{3.5}{4.25}
|
||||
\cpsspAlphaHelix{-6.0}{4.25}{4.5}
|
||||
\cpsspSheet{-6.0}{4.5}{7.0}
|
||||
\cpsspTurn{-6.0}{7.0}{7.5}
|
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\cpsspCoil{-6.0}{7.5}{8.25}
|
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\cpsspSheet{-6.0}{8.25}{8.75}
|
||||
\cpsspAlphaHelix{-6.0}{8.75}{12.5}
|
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\cpsspCoil{-6.0}{12.5}{13.5}
|
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\cpsspAlphaHelix{-6.0}{13.5}{13.75}
|
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\cpsspTurn{-6.0}{13.75}{14.25}
|
||||
\cpsspSheet{-6.0}{14.25}{15.0}
|
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\cpsspEndRes{-6.0}{15.0}{250}
|
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\cpsspLabel{-7.5}{RTE1 SOPMA}
|
||||
\cpsspStartRes{-7.5}{2.5}{251}
|
||||
\cpsspCoil{-7.5}{2.5}{3.0}
|
||||
\cpsspTurn{-7.5}{3.0}{3.25}
|
||||
\cpsspSheet{-7.5}{3.25}{3.5}
|
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\cpsspEndRes{-7.5}{3.5}{254}
|
||||
BIN
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Normal file
BIN
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Binary file not shown.
File diff suppressed because one or more lines are too long
|
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Binary file not shown.
File diff suppressed because it is too large
Load diff
|
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Binary file not shown.
File diff suppressed because one or more lines are too long
|
Before Width: | Height: | Size: 113 KiB After Width: | Height: | Size: 145 KiB |
|
|
@ -26,18 +26,23 @@
|
|||
\acro{ERF1}{\textit{ETHYLENE RESPONSE FACTOR 1}}
|
||||
\acro{ETR1}{\textit{ETHYLENE RESISTANT 1}}
|
||||
% \acro{GR}{\textit{GREEN RIPE}}
|
||||
\acro{HasAp}{\textit{HEME-BINDING PROTEIN A} aus \textit{Pseudomonas aeruginosa}}
|
||||
\acro{HBP}{\textit{heme-dinding protein}}
|
||||
\acro{HRP}{\textit{horseradish peroxidase}, Meerrettich-Peroxidase}
|
||||
\acro{IDA}{Im\-in\-o\-di\-es\-sig\-säu\-re}
|
||||
\acro{IPTG}{Isopropyl-$beta$-D-thiogalactopyranosid}
|
||||
\acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
|
||||
\acro{MAP}{\textit{mitogen activated protein}}
|
||||
\acro{MCS}{\textit{multiple cloning site}}
|
||||
\acro{NEM}{N-Ethylmaleinimid}
|
||||
\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
|
||||
\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
|
||||
\acro{RFABG}{\textit{RETINOID- AND FATTY ACID-BINDING GLYCOPROTEIN}}
|
||||
\acro{RAN1}{\textit{RESPONSIVE TO ANTAGONIST 1}}
|
||||
\acro{RTE1}{\textit{REVERSION TO ETHYLENE 1}}
|
||||
\acro{RTH}{\textit{RTE1-HOMOLOG}}
|
||||
\acro{SDS}{\textit{sodium dodecylsulfate}, Natriumdodecylsulfat}
|
||||
\acro{SDS-PAGE}{\textit{sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis}, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese}
|
||||
\acro{SOPMA}{\textit{self-optimized prediction method}}
|
||||
\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
|
||||
\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
|
||||
\end{acronym}
|
||||
|
|
@ -1 +1,67 @@
|
|||
\appendix
|
||||
\appendix
|
||||
\chapter{Ergänzendes Material}
|
||||
\section{Nukleotid- und Aminosäuresequenzen}
|
||||
\begin{figure}[htbp!]
|
||||
\begin{lstlisting}
|
||||
atgtcacgtg gaagaggagt tcctatgatg gacctgaaac gaagttatga
|
||||
tgttgaagac agggtggtgt ccgtgtctat accatcaata atcgaagctg
|
||||
atgaggctga tctgtggcca ctacctgaga ttgataccaa gaagtcgaaa
|
||||
tttccttgct gtatagtttg gactcctctt cctgttgtct cttggttggc
|
||||
tcctttcatt ggtcatattg gactttgcag agaagatgga gtcattttgg
|
||||
actttgctgg atctaacttc atcaatgttg atgattttgc atttggtcct
|
||||
cctgctcgct atctccaact cgatagaacc aagtgttgct taccaccaaa
|
||||
tatgggtgga catacttgca agtatggatt caaacacacc gactttggaa
|
||||
cagcgcgtac atgggataat gcactgagct cgagcacacg tagctttgag
|
||||
cataaaacct acaacatctt cacttgtaac tgccattcgt ttgttgcaaa
|
||||
ctgtttgaac cgtctttgct atggtggctc aatggagtgg aatatggtga
|
||||
atgttgctat tttacttatg atcaaaggga aatggatcaa tggttcatca
|
||||
gtagtccgct cgtttctgcc atgtgctgtg gtcacgtctt tgggggtggt
|
||||
gcttgtcggc tggccattcc tcatcggtct ctcttcgttc tcgctactac
|
||||
tctttgcctg gttcataatt gctacttact gttttaagaa cataattact
|
||||
ggatccggct gctaa
|
||||
\end{lstlisting}
|
||||
\caption[Nukleotidsequenz von \acs{RTE1}]{Nukleotidsequenz von \acs{RTE1} (\SI{765}{\bp})}
|
||||
\end{figure}
|
||||
|
||||
\begin{figure}[htbp!]
|
||||
\begin{lstlisting}
|
||||
MSRGRGVPMM DLKRSYDVED RVVSVSIPSI IEADEADLWP LPEIDTKKSK
|
||||
FPCCIVWTPL PVVSWLAPFI GHIGLCREDG VILDFAGSNF INVDDFAFGP
|
||||
PARYLQLDRT KCCLPPNMGG HTCKYGFKHT DFGTARTWDN ALSSSTRSFE
|
||||
HKTYNIFTCN CHSFVANCLN RLCYGGSMEW NMVNVAILLM IKGKWINGSS
|
||||
VVRSFLPCAV VTSLGVVLVG WPFLIGLSSF SLLLFAWFII ATYCFKNIIT
|
||||
GSGC
|
||||
\end{lstlisting}
|
||||
\caption{Aminosäuresequenz von \acs{RTE1}}
|
||||
\end{figure}
|
||||
|
||||
\clearpage
|
||||
|
||||
\section{Strukturvorhersage}
|
||||
\begin{figure}[htbp!]
|
||||
\centering
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\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd_spektroskopie/vorhersage.png}
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% vorhersage.png: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=1 2 130 89
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\caption[Strukturvorhersage von \ac{RTE1} mit \ac{SOPMA}]{Strukturvorhersage von \ac{RTE1} mit \ac{SOPMA}; In der ersten Zeile befindet sich die Aminosäuresequent, in der zweiten Zeile die Sekundärstruktur: Pfeile kennzeichnen \textbeta-Faltblätter, gezackte Linien \textalpha-Helices und blaue Abschnitte \textit{Random Coils}. Die dritte Zeile gibt die Vorhersagegenauigkeit wieder (größer ist besser). Gelb hinterlegt sind membrandurchspannende Helices.}
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\label{fig:strukturvorhersage}
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\end{figure}
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\chapter{Danksagung}
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Ich bedanke mich zu aller erst bei Herrn Prof. Dr. Georg Groth für das interessante und herausfordernde Thema dieser Arbeit, die freundliche Aufnahme in der Arbeitsgruppe und die Denkanstöße.
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Darüberhinaus gilt mein Dank der gesamten Arbeitsgruppe für jegliche Unterstützung und den freundlichen Umgang, besonders David und Mareike für die vielen aufmunternden und lustigen Gespräche im Labor.
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Insbesondere danke ich Ellie, die schon im F-Praktikum meine -- manchmal wahrscheinlich banalen -- Fragen immer mit einer unglaublichen Geduld und Präzision beantwortet hat und eines der gezeigten CD-Spektren für mich aufgenommen hat. Entsprechend danke ich auch Mel, die das andere Spektrum unter Einsatz ihres Lebens -- zumindest aber der Küvette -- gemessen hat. Benni danke ich für das "`Um eine Ecke mehr als ich"'-Denken.
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Ohne Anuschka hätte es das Thema zumindest in dieser Form für mich nicht gegeben, ebensowenig wie das Expressions- und Reinigungsprotokoll. Danke!
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\chapter{Erklärung}
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Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Bachelorarbeit selbstständig verfasst und keine anderen, als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Alle Stellen, die ich aus den Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommen habe, sind als solche kenntlich gemacht.
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Alexander Ralph Michael Minges \hfill Düsseldorf, \today
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\chapter{Diskussion}
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\chapter{Diskussion}
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\section{Nachweis und Quantifizierung der Häminbindung}
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Die Ergebnisse aller zum Bindungsnachweis eingesetzten Methoden lassen auf eine Häminbindung durch \ac{RTE1} schließen. Zunächst ist aus dem Häminagarose-Assay ersichtlich, dass eine stabile Bindung von \ac{RTE1} an immobilisiertes Hämin zu Stande kommt. Durch einfache Waschschritte mit Puffer konnte \ac{RTE1} nicht mehr vom Säulenmaterial eluiert werden, erst unter denaturierenden Bedingungen oder Einsatz einer Häminlösung kam es zur Elution. Dies deutet auf eine relativ stabile Bindung von \ac{RTE1} an die Häminagarose hin.
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Beim photometrischen Bindungsassay (siehe \ref{sec:ergebnis_photometrie}) zeigt sich das Zustandekommen einer Bindung in der Absorptionszunahme im Soretband, sowie der Verschiebung der Absorptionsmaxima. Vergleichbares wurde auch von \citet{vincent_protein_1985}, sowie \citet{duncan_heme-binding_1999} bei ihren Untersuchungen von Häm-bindenden Proteinen beobachtet, so dass das Auftreten von Absorptionszunahme im Soretband und Verschiebung der Maxima als Charakteristikum einer Häminbindung angesehen werden kann.
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Die Fluoreszenzspektroskopie zeigte einen sehr deutlichen Quench bei Häminzugabe. Ähnliche Untersuchungen an einem anderen Häm-bindenden Protein wurden von \citet{vincent_protein_1985} durchgeführt. Auch in diesem Fall kann davon ausgegangen werden, dass der Quench durch die Interaktion zwischen \ac{RTE1} und Hämin zu Stande kommt. Im Unterschied zu \citet{vincent_protein_1985} konnte aber bei Anregung mit \SI{278}{\nano\meter} kein Emissionspeak von Tyrosin bei \SI{305}{\nano\meter} festgestellt werden. Stattdessen zeigte sich eine Tryptophanfluoreszenz mit einem Maximum bei \SI{350}{\nano\meter}, welche letztlich auch für die Messung genutzt wurde.
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Sehr deutlich ist die Änderung in der Sekundärstruktur von \ac{RTE1} bei Zugabe von Hämin. Der \textalpha-helikale Anteil verdoppelt sich nahezu, während der Anteil an \textbeta-Faltblättern stark zurückgeht. Eine Änderung in der Sekundärstruktur bei der Zugabe eines Liganden kann als Hinweis auf eine Bindung gedeutet werden. Die Aussagekraft der Daten aus der \ac{CD}-Spektroskopie wird allerdings dadurch gemindert, dass hierbei die Spektren aus zwei unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1} miteinander verglichen wurden. Es ist dabei nicht auszuschließen, dass präparationsbedingte Unterschiede -- beispielsweise durch Variationen in Reinheit und Konzentration von \ac{RTE1} oder der Konzentration verschiedener Ionen -- die Messung direkt oder indirekt beeinflusst haben. Somit sollte diese Messreihe mit Proteinproben aus derselben Präparation wiederholt werden.
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Die Quantifizierung der Häminbindung ergab ausgehend von der photometrischen Messung einen K$_\text{d}$-Wert von bei \SI[seperr]{7,24(223)}{\micro\Molar} bei pH 7,5. Ein ähnlicher K$_\text{d}$ von \SI[seperr]{8,40(104)}{\micro\Molar} wurde für pH 8,5 bestimmt. Unter Berücksichtigung der Standardabweichung sind beide als nahezu identisch zu bewerten. Der K$_\text{d}$ bei pH 6,5 lag um eine Größenordnung höher bei \SI[seperr]{79,6(127)}{\micro\Molar}. Bei der Interpretation dieser Daten ist zu beachten, dass bei pH 6,5 die Sättigung nicht annähernd erreicht wurde und somit die Regression relativ ungenau ist. Hierauf deutet vor allem die viel zu hohe Kapazität hin, während durch die Normierung ein Wert von eins zu erwarten wäre. Trotzdem zeigt sich, dass die Bindung von Hämin an \ac{RTE1} bei saurem pH deutlich schwächer ist, als bei physiologischem oder leicht alkalischem pH.
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Die in der photometrischen Messung erhobenen Daten lassen sich durch die Fluoreszenzspektroskopie bestätigen. Hierbei ergab sich ein K$_\text{d}$ von \SI[seperr]{4,90(23)}{\micro\Molar} bei pH 7,5. Dieser Wert entspricht nahezu dem photometrisch bestimmten K$_\text{d}$-Wert in seinem unteren Grenzwert. Allgemein betrachtet besitzt die Fluoreszenzspektroskopie im Vergleich zur UV-Vis-Spektroskopie die höhere Aussagekraft, da die Fluoreszenzsignale mit höherer Sensitivität detektiert werden können, während bei der UV-Vis-Spektroskopie bei zunehmender Absorption Störeffekte auftreten. Daher konnte auch bei höheren Häminkonzentrationen gemessen werden, als beim photometrischen Bindungsassay.
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Des Weiteren muss auch hier beachtet werden, dass beim photometrischen Bindungsassay und der Fluoreszenzspektroskopie \ac{RTE1} aus unterschiedlichen Präparationen zum Einsatz kam. Auch hier kann nicht ausgeschlossen werden, dass präparationsbedingte Unterschiede die Ergebnisse beeinflusst haben. So wäre denkbar, dass verschiedene lösliche \ac{RTE1}-Spezies mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften in variablen Konzentrationen vorlagen, oder aber unterschiedliche Ionenkonzentrationen -- beispielsweise \ce{K^+} -- die Affinität von \ac{RTE1} zu Hämin beeinflusst haben. Somit sollte auch hier zur Verifizierung eine gemeinsame Messreihe mit \ac{RTE1} aus derselben Präparation durchgeführt werden.
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Andere Häm-bindende Proteine weisen K$_\text{d}$-Werte im mikromolaren bis oberen nanomolaren Bereich auf (Tabelle \ref{tab:haemin_kinetik}). Insofern scheinen die ermittelten K$_\text{d}$-Werte für \ac{RTE1} in einem für Häm-bindende Proteine realistischen Bereich zu liegen.
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\begin{table}[ht]
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\centering
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\caption[K$_\text{d}$ verschiedener Häm-bindender Proteine im Vergleich zu \ac{RTE1}]{K$_\text{d}$ verschiedener Häm-bindender Proteine im Vergleich zu \ac{RTE1}. Für \ac{RTE1} ist der K$_\text{d}$ aus der Fluoreszenzspektroskopie bzw. in Klammern aus dem photometrischen Bindungsassay angegeben.}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{Xcl}
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\toprule
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\textbf{Protein} & \textbf{K$_\text{d}$ [\si{\micro\Molar}]} & \textbf{Literatur}\\
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\ac{RFABG} & 0,38 & \citet{duncan_heme-binding_1999}\\
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\ac{HBP} & 0,43 & \citet{vincent_protein_1985}\\
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\ac{HasAp} & 35 & \citet{yukl_kinetic_2010}\\
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\midrule
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\ac{RTE1} & \num[seperr]{4,90(23)} (\num[seperr]{7,24(223)}) & \\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\label{tab:haemin_kinetik}
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\end{table}
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\section{Spezifität der Häminbindung}
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Dass es sich bei der im Häminagarose-Assay beobachteten Bindung von \ac{RTE1} an das Säulenmaterial (vgl. \ref{sec:ergebnis_haeminagarose}) um eine spezifische Bindung handelt, kann als gesichert betrachtet werden, da eine Elution nicht nur unter denaturierenden Bedingungen -- mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen -- sondern auch durch Waschen mit einer Häminlösung erfolgt. Unspezifisch an die Trägermatrix gebundenes Protein ließe sich hierdurch nicht eluieren. Bei einer spezifischen Bindung an das an der Matrix immobilisierte Hämin kann dieses als Bindungspartner durch das freie Hämin in der Lösung verdrängt werden, wodurch das Protein eluiert.
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\citet{tsutsui_affinity_1982} beschreiben eine Möglichkeit das immobilisierte Hämin durch Natronlauge weitestgehend von der Agarosematrix zu lösen. Die damit erhaltenen Agarosebeads ohne gebundenes Hämin könnten dann zur Quantifizierung einer möglichen unspezifischen Bindung an die Matrix dienen. Hierdurch ließe sich in zukünftigen Versuchen der Anteil des spezifisch bindenden Proteins bestimmen.
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\section{Ausblick}
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Es konnten Bindungsassays für die Häminbindung von \ac{RTE1} etabliert werden, welche rein qualitativ (Häminagarose) oder auch quantitativ (UV-Vis-Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie) eingesetzt werden können. Sollte die Häminbindung ein Charakteristikum eines funktionell gefalteten \ac{RTE1} sein, so ließe sich mit Hilfe dieser Assays überprüfen, ob ein denaturierend gereinigtes \ac{RTE1} wieder erfolgreich renaturiert werden kann. Wie in Kapitel \ref{sec:ergebnis_denaturierende_reinigung} beschrieben, ergeben sich aus der denaturierenden Reinigung durch die Solubilisierung von \textit{Inclusion Bodies} weitaus höhere Proteinausbeuten. Sollte die Rückfaltung gelingen, ließe sich genügend Protein für Kristallisationsansätze gewinnen, welche letztlich eine Vorbereitung zur Strukturaufklärung mittels Röntgenkristallographie wären.
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Darüberhinaus zeigt sich, dass die Häminbindung nicht ein Alleinstellungsmerkmal des humanen \ac{RTE1}-Homologs ist, sondern auch in \ac{A. thaliana} und möglicherweise auch anderen pflanzlichen und tierischen \ac{RTE1}-Homologen zu finden ist. Damit stellt sich die Frage nach der Funktion dieser Bindung, oder ob diese in Pflanzen ohne funktionellen Hintergrund zufällig entstand und erst in tierischen Organismen ohne Ethylensignalweg eine biologisch signifikante Funktion erhielt. Möglicherweise liegt hier auch die Erklärung weshalb \ac{RTE1}-Homologe konserviert in einer Vielzahl von Eukaryoten mit Ausnahme der Pile zu finden sind, von denen -- abgesehen von den Pflanzen -- keine einen bekannten Ethylensignalweg aufweisen.
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Weitere Versuche könnten außerdem zum Einfluss des Redoxstatus auf die Bindungseigenschaften durchgeführt werden. Hierfür könnten Disulfidbrücken in \ac{RTE1} zunächst mit \ac{DTT} reduziert und die Cysteine mit \ac{NEM} als Schutzgruppe modifiziert werden. \ac{DTT} würde entfernt, um nicht mit dem zugesetzten oder an die Häminagarose gebundenen Hämin zu reagieren. Der weitere Verlauf entspräche dann den hier beschriebenen Bindungsassays. In diesem Zusammenhang wäre zunächst auch die Kenntnis über den Anteil an freien Sulfhydrylgruppen im Protein von Interesse, welche nach Ellmann \citep{riener_quick_2002} bestimmt werden kann.
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Zur Optimierung des photometrischen Bindungsassays könnte ein \textit{NanoDrop}-Spektralphotometer zum Einsatz kommen. Da hier bei einem Probenvolumen von etwa \SI{1}{\micro\liter} eine Schichtdicke von \SI{1}{\milli\meter} erreicht wird, können Proben bis zu einer Absorption von 300 vermessen werden. Somit könnten auch höhere Häminkonzentrationen eingesetzt werden, wie sie beispielsweise nötig wären, um bei pH 6,5 eine Sättigung zu erreichen. Gleichzeitig würde nur ein Bruchteil der bisher benötigten Proteinmenge verbraucht.
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@ -30,28 +30,28 @@ In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS
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\section{\acs{RTE1} im Ethylensignalweg}
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Bei \ac{RTE1} handelt es sich um ein Homodimer, welches kolokalisiert mit \ac{ETR1} in der Membran des Golgi-Apparates bzw. des \ac{ER} vorliegt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Entdeckt wurde es bei der Suche nach zusätzlichen Komponenten des Ethylensignalweges. Die Ethylen-insensitiven Mutante \textit{etr1-2} zeigt bei Anwesenheit von Ethylen und Wachstum im Dunkeln \textit{nicht} den üblichen Phänotyp der Dreifachantwort: Verdickung und Verkürzung des Hypokotyls, Hemmung des Wurzelwachstums und Krümmung des Apikalhakens. Bei \textit{etr1-2} beruht die Insensitivität gegenüber Ethylen im Gegensatz zu \textit{etr1-1} nicht auf dem Unvermögen den für die Ethylenbindung erforderlichen Kofaktor Kupfer zu binden, sondern auf der Blockade der Weiterleitung des Ethylensignals zur Signaldomäne des Rezeptors. Es wird vermutet, dass die auf die Ethylenbindung folgende Konformationsänderung verhindert wird. \citep{resnick_involvement_2008}.
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Bei \ac{RTE1} handelt es sich um ein Homodimer -- Molekulargewicht der Monomere: \SI{28}{\kilo\dalton}), welches kolokalisiert mit \ac{ETR1} in der Membran des Golgi-Apparates bzw. des \ac{ER} vorliegt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Entdeckt wurde es bei der Suche nach zusätzlichen Komponenten des Ethylensignalweges. Die Ethylen-insensitiven Mutante \textit{etr1-2} zeigt bei Anwesenheit von Ethylen und Wachstum im Dunkeln \textit{nicht} den üblichen Phänotyp der Dreifachantwort: Verdickung und Verkürzung des Hypokotyls, Hemmung des Wurzelwachstums und Krümmung des Apikalhakens. Bei \textit{etr1-2} beruht die Insensitivität gegenüber Ethylen im Gegensatz zu \textit{etr1-1} nicht auf dem Unvermögen den für die Ethylenbindung erforderlichen Kofaktor Kupfer zu binden, sondern auf der Blockade der Weiterleitung des Ethylensignals zur Signaldomäne des Rezeptors. Es wird vermutet, dass die auf die Ethylenbindung folgende Konformationsänderung verhindert wird \citep{resnick_involvement_2008}.
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Durch Mutagenese wurden Individuen aus dieser \textit{etr1-2}-Population erzeugt, welche wieder die Dreifachantwort \textit{zeigten}. Durch Komplementierungsversuche wurden die Mutanten \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} als allelisch identifiziert. Da beide Mutanten eine Ethylenantwort ähnlich der des Wildtyps aufwiesen, konnte darauf geschlossen werden, dass ein funktionelles \ac{RTE1} für die Insensitivität der \textit{etr1-2}-Mutanten notwendig ist. Folglich muss \ac{RTE1} zu einem frühen Zeitpunkt innerhalb des Ethylensignalweges gemeinsam mit \ac{ETR1} wirksam sein. Ein weiteres Allel \textit{rte1-3} wurde nach Analyse der Gensequenz von \ac{RTE1} identifiziert. Alle \ac{RTE1}-Mutanten zeigten einen ähnlichen Phänotyp, woraus geschlossen wurde, dass \textit{rte1-2} und \textit{rte1-2} \textit{loss-of-function}-Allele darstellen. Bei \textit{rte1-3} handelt es sich vermutlich um eine Nullmutation \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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Durch Mutagenese wurden Individuen aus dieser \textit{etr1-2}-Population erzeugt, welche wieder die Dreifachantwort \textit{zeigten}. Durch Komplementierungsversuche wurden die Mutanten \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} als allelisch identifiziert. Da beide Mutanten eine Ethylenantwort ähnlich der des Wildtyps aufwiesen, konnte darauf geschlossen werden, dass ein funktionelles \ac{RTE1} für die Insensitivität der \textit{etr1-2}-Mutanten notwendig ist. Folglich muss \ac{RTE1} zu einem frühen Zeitpunkt innerhalb des Ethylensignalweges gemeinsam mit \ac{ETR1} wirksam sein. Ein weiteres Allel \textit{rte1-3} wurde nach Analyse der Gensequenz von \ac{RTE1} identifiziert. Alle \ac{RTE1}-Mutanten zeigten einen ähnlichen Phänotyp, woraus geschlossen wurde, dass \textit{rte1-1} und \textit{rte1-2} \textit{loss-of-function}-Allele darstellen. Bei \textit{rte1-3} handelt es sich vermutlich um eine Nullmutation \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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\textit{rte1-2} ist in der Lage, eine Reihe von Mutationen in \ac{ETR1} zu unterdrücken, beispielsweise \textit{etr1-2}, allerdings nur bei Mutationen, welche die eigentliche Ethylenbindung nicht oder zumindest nicht vollständig verhindern \citep{resnick_involvement_2008}.
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\textit{rte1-2} ist in der Lage, eine Reihe von Mutationen in \ac{ETR1} zu unterdrücken -- beispielsweise \textit{etr1-2} -- allerdings nur bei Mutationen, welche die eigentliche Ethylenbindung nicht oder zumindest nicht vollständig verhindern \citep{resnick_involvement_2008}.
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Weitere Versuche zeigten, dass eine Überexpression von \ac{RTE1} im Wildtyp zu einer verminderten Ethylensensitivität führt, was die Annahme stützte, dass es sich bei \ac{RTE1} um einen negativen Regulator der Ethylenantwort handelt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Ebenso konnte durch die Analyse des Phänotyps von Doppel- und Dreifachmutanten mit \textit{etr1-2}, \textit{rte1-2} und \textit{ran1-3} gezeigt werden, dass \ac{RTE1} unabhängig von \ac{RAN1} auf die Ethylensignalkaskade wirkt \citep{resnick_involvement_2008}. So ist die Funktion von \ac{ETR1} im Wildtyp sowohl von \ac{RTE1} als auch von \ac{RAN1} abhängig, \textit{etr1-2} hingegen nur von \ac{RTE1}. Hiervon ausgehend wurde das nachfolgend dargestellte Modell zum Signalzustand von \ac{ETR1} vorgeschlagen \citep{resnick_involvement_2008}.
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Weitere Versuche zeigten, dass eine Überexpression von \ac{RTE1} im Wildtyp zu einer verminderten Ethylensensitivität führt, was die Annahme stützte, dass es sich bei \ac{RTE1} um einen negativen Regulator der Ethylenantwort handelt \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Ebenso konnte durch die Analyse des Phänotyps von Doppel- und Dreifachmutanten mit \textit{etr1-2}, \textit{rte1-2} und \textit{ran1-3} gezeigt werden, dass \ac{RTE1} unabhängig von \ac{RAN1} auf die Ethylensignalkaskade wirkt \citep{resnick_involvement_2008}. So ist die Funktion von \ac{ETR1} im Wildtyp sowohl von \ac{RTE1} als auch von \ac{RAN1} abhängig, in \textit{etr1-2} hingegen nur von \ac{RTE1}. Hiervon ausgehend wurde das nachfolgend dargestellte (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}) Modell zum Signalzustand von \ac{ETR1} vorgeschlagen \citep{resnick_involvement_2008}.
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\ac{RTE1} reguliert die Ethylenantwort über eine Konformationsänderung der Ethylen-Bindedomäne des Rezeptors ETR1 (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}). ETR1 geht hierbei von einer nicht-funktionellen Konformation mit Hilfe von RTE1 in eine funktionelle Konformation über, in welchem der Rezeptor sich in seinem "`an"'-Zustand befindet und die Ethylenantwort unterdrückt. In diesem Zustand kann nun auch Ethylen gebunden werden, wobei ETR1 in eine semi-stabile Konformation übergeht, welche ebenfalls den "`an"'-Zustand repräsentiert und schließlich durch eine Konformationsänderung in den "`aus"'-Zustand wechselt, wodurch die Ethylensignalkaskade ausgelöst wird. Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand kann wiederum nur mit Hilfe von RTE1 erfolgen \citep{resnick_involvement_2008}.
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\ac{RTE1} reguliert die Ethylenantwort über eine Konformationsänderung der Ethylen"=Bindedomäne des Rezeptors ETR1 (Abbildung \ref{fig:etr1_zustaende}). ETR1 geht hierbei von einer nicht-funktionellen Konformation mit Hilfe von RTE1 in eine funktionelle Konformation über, in welchem der Rezeptor sich in seinem "`an"'-Zustand befindet und die Ethylenantwort unterdrückt. In diesem Zustand kann nun auch Ethylen gebunden werden, wobei ETR1 in eine semi-stabile Konformation übergeht, welche ebenfalls den "`an"'-Zustand repräsentiert und schließlich durch eine Konformationsänderung in den "`aus"'-Zustand wechselt, wodurch die Ethylensignalkaskade ausgelöst wird. Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand kann wiederum nur mit Hilfe von RTE1 erfolgen \citep{resnick_involvement_2008}.
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\begin{figure}[htbp!]
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\centering
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\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/ETR1-Zustaende.pdf}
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% ETR1-Zustaende.pdf: 870x309 pixel, 72dpi, 30.69x10.90 cm, bb=0 0 870 309
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\caption[Modell des Signalzustandes von ETR1]{Modell des Signalzustandes von ETR1 \citep[eigene Abbildung nach][]{resnick_involvement_2008}\\\ac{RTE1} bewirkt den Übergang von \ac{ETR1} von einer nicht-funktionellen (I) in eine funktionelle Konformation (II). Diese spiegelt den "`an"'-Zustand des Rezeptors wider. Wird Ethylen gebunden, geht der Rezeptor in eine semi-stabile Konformation (III) über, welche ebenfalls noch dem "`an"'-Zustand entspricht. Aus dieser Konformation wechselt \ac{ETR1} in den "`aus"'-Zustand (IV). Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand erfolgt wiederum mit Hilfe von \ac{RTE1}.}
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\caption[Modell des Signalzustandes von ETR1]{Modell des Signalzustandes von ETR1 \citep[eigene Abbildung nach][]{resnick_involvement_2008}; \ac{RTE1} bewirkt den Übergang von \ac{ETR1} von einer nicht-funktionellen (I) in eine funktionelle Konformation (II). Diese spiegelt den "`an"'-Zustand des Rezeptors wider. Wird Ethylen gebunden, geht der Rezeptor in eine semi-stabile Konformation (III) über, welche ebenfalls noch dem "`an"'-Zustand entspricht. Aus dieser Konformation wechselt \ac{ETR1} in den "`aus"'-Zustand (IV). Der erneute Übergang in den "`an"'-Zustand erfolgt wiederum mit Hilfe von \ac{RTE1}.}
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\label{fig:etr1_zustaende}
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\end{figure}
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Homologe zu \ac{RTE1} wurden in einer Vielzahl weiterer Eukaryoten mit Ausnahme der Pilze gefunden, beispielsweise in \textit{Homo sapiens}, \textit{Drosophila melanogatser}, \textit{Caenorhabditis elegans} und \textit{Plasmodium}. Das menschliche Homolog weist eine Sequenzidentität im Vergleich zu \ac{RTE1} aus \ac{A. thaliana} von \SI{40,5}{\percent} auf \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Nach bisherigem Kenntnisstand verfügen die genannten Spezies über jeweils eine Kopie des Gens, mit Ausnahme von \ac{A. thaliana}, bei welcher sich eine zweite Kopie -- \ac{RTH} -- mit \SI{51}{\percent} Sequenzidentität findet \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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Homologe zu \ac{RTE1} wurden in einer Vielzahl weiterer Eukaryoten mit Ausnahme der Pilze gefunden, beispielsweise in \textit{Homo sapiens}, \textit{Drosophila melanogaster}, \textit{Caenorhabditis elegans} und \textit{Plasmodium}. Das menschliche Homolog weist eine Sequenzidentität im Vergleich zu \ac{RTE1} aus \ac{A. thaliana} von \SI{40,5}{\percent} auf \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Nach bisherigem Kenntnisstand verfügen die genannten Spezies über jeweils eine Kopie des Gens, mit Ausnahme von \ac{A. thaliana}, bei welcher sich eine zweite Kopie -- \ac{RTH} -- mit \SI{51}{\percent} Sequenzidentität findet \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies ohne Ethylenrezeptoren \citep{resnick_involvement_2008} lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Durch Sequenz-Alignments konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cystein- und Histidinreste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-1} ist Cys$^\text{161}$ durch ein Tyrosin ersetzt. Darüberhinaus zeigen sequenzbasierte Vorhersagen, dass pflanzliche \ac{RTE1}-Homologe zwei bis vier Transmembrandomänen besitzen, eine nahe des N-Terminus sowie zwei bis drei am C-Terminus. In \textit{rte1-2} sind durch einen von einer \textit{missense}-Mutation hervorgerufenen \textit{frameshift} die letzten 27 Aminosäurereste, welche sich in einer vorhergesagten Transmembrandomäne befinden, durch 15 inkorrekte Reste ersetzt worden, was vermutlich zu einer falschen Ausrichtung des Proteins in der Membran führt. Tierische Homologe zeigen in der Sequenzanalyse die ersten drei Transmembrandomänen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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Abseits der Pflanzen ist keine biologische Funktion der \ac{RTE1}-Homologe bekannt, noch weisen sie bekannte Sequenzmotive auf. Die Tatsache ihrer weit verbreiteten Existenz in einer Vielzahl von Spezies ohne Ethylenrezeptoren \citep{resnick_involvement_2008} lässt jedoch auf eine essenzielle, konservierte Funktion schließen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}. Durch Sequenz-\textit{Alignments} konnten zwei hochkonservierte Abschnitte identifiziert werden, welche konservierte Cystein- und Histidinreste aufweisen (Cys$^\text{54}$, His$^\text{72}$, Cys$^\text{161}$). Bei \textit{rte1-1} ist Cys$^\text{161}$ durch ein Tyrosin ersetzt. Darüberhinaus zeigen sequenzbasierte Vorhersagen, dass pflanzliche \ac{RTE1}-Homologe zwei bis vier Transmembrandomänen besitzen, eine nahe des N-Terminus sowie zwei bis drei am C-Terminus. In \textit{rte1-2} sind durch einen von einer \textit{missense}-Mutation hervorgerufenen \textit{Frameshift} die letzten 27 Aminosäurereste, welche sich in einer vorhergesagten Transmembrandomäne befinden, durch 15 inkorrekte Reste ersetzt worden, was vermutlich zu einer falschen Ausrichtung des Proteins in der Membran führt. Tierische Homologe zeigen in der Sequenzanalyse die ersten drei Transmembrandomänen \citep{resnick_reversion--ethylene_2006}.
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\section{Zielsetzung}
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In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Eigenschaften von \ac{RTE1} näher charakterisiert werden. Da für das humane Homolog von \ac{RTE1} eine Hämin-Bindung bereits nachgewiesen werden konnte \citep{chang_2009}, sollte der Fokus dieser Arbeit auf dem Nachweis und wenn möglich auch Quantifizierung einer Hämin-Bindung liegen.
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In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Eigenschaften von \ac{RTE1} näher charakterisiert werden. Da für das humane Homolog von \ac{RTE1} eine Häminbindung bereits nachgewiesen werden konnte \citep{chang_2009}, sollte der Fokus dieser Arbeit auf dem Nachweis und wenn möglich auch Quantifizierung einer Häminbindung liegen.
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@ -1,9 +1,9 @@
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\chapter{Ergebnisse}
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\section{Native Reinigung von \ac{RTE1}}
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\section{Native Reinigung von \acs{RTE1}}
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\label{sec:ergebnis_native_reinigung}
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Die native Reinigung nach dem angepassten Protokoll (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) zeigte vergleichbare Ergebnisse zum ursprünglichen Reinigungsprotokoll \citep{malach_expression_2009}, so dass auf Grund der einfacheren Verfahrensweise dieses auch im weiteren Verlauf der Arbeit angewandt wurde.
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Sowohl Westernblot (Abbildung \ref{fig:blot_reinigung}), als auch SDS-PAGE (Abbildung \ref{fig:sds-page_reinigung}) zeigen einen großen Anteil nicht solubilisierten Proteins im Größenbereich um \SI{28}{\kilo\dalton}. Darüberhinaus zeigen sich Multimere unterschiedlicher Molekularität. In der Regel ließen sich aus \SI{4}{\gram} Zellen etwa \SI{0,75}{\milli\gram} Protein reinigen.
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Sowohl Westernblot (Abbildung \ref{fig:blot_reinigung}), als auch SDS-PAGE (Abbildung \ref{fig:sds-page_reinigung}) zeigen einen großen Anteil nicht solubilisierten Proteins im Größenbereich um \SI{28}{\kilo\dalton}. Darüberhinaus zeigen sich Multimere unterschiedlicher Molekularität. Durchschnittlich ließen sich aus \SI{4}{\gram} Zellen etwa \SI{0,75}{\milli\gram} Protein reinigen.
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\begin{figure}[htbp!]
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@ -22,6 +22,7 @@ Sowohl Westernblot (Abbildung \ref{fig:blot_reinigung}), als auch SDS-PAGE (Abbi
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\end{figure}
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\section{Denaturierende Reinigung}
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\label{sec:ergebnis_denaturierende_reinigung}
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In der Regel konnte unter nativen Bedingungen \ac{RTE1} in ausreichender Menge für die nachfolgenden Versuche präpariert werden. In einigen Fällen schlug die Solubilisierung von \ac{RTE1} allerdings fehl, so dass die Möglichkeit einer denaturierenden Reinigung in Hinblick auf zukünftige Experimente untersucht wurde.
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Unter denaturierenden Bedingungen konnten weitaus größere Mengen \ac{RTE1} gereinigt werden, als mit der nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:ergebnis_native_reinigung}). Das SDS-Gel zeigt entsprechend kräftigere Banden in den Elutionsfraktionen (Abbildung \ref{fig:sds-page_denaturierende_reinigung}).
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@ -36,9 +37,9 @@ Unter denaturierenden Bedingungen konnten weitaus größere Mengen \ac{RTE1} ger
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\section{Häminagarose-Assay}
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\label{sec:ergebnis_haeminagarose}
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Die SDS-PAGE der Proben aus dem Häminagarose-Assay zeigt in der Elutionsfraktion eine Bande bei \SI{28}{\kilo\dalton}. Eine entsprechende Bande zeigt sich im aufgetragenen Proteinkonzentrat. Im Durchlauf ist nur ein sehr schwaches Signal zu erkennen, die Waschfraktionen weisen keine sichtbaren Banden auf (Abbildung \ref{fig:haeminagarose}.
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Die SDS-PAGE der Proben aus dem Häminagarose-Assay zeigt in der Elutionsfraktion eine Bande bei \SI{28}{\kilo\dalton}. Eine entsprechende Bande zeigt sich im aufgetragenen Proteinkonzentrat. Im Durchlauf ist nur ein sehr schwaches Signal zu erkennen, die Waschfraktionen weisen keine sichtbaren Banden auf (Abbildung \ref{fig:haeminagarose}).
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Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elution eine Lösung von freiem Hämin (\SI{11,1}{\milli\Molar}) eingesetzt. Auch hier zeigte sich eine -- allerdings schwächere -- Bande in der Elutionsfraktion. Danach noch gebundenes Protein wurde wie zuvor mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen eluiert.
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Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elution eine Lösung von freiem Hämin (\SI{11}{\milli\Molar}) eingesetzt. Auch hier zeigte sich eine -- allerdings schwächere -- Bande in der Elutionsfraktion. Danach noch gebundenes Protein wurde wie zuvor mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen eluiert.
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\begin{figure}[htbp!]
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@ -56,6 +57,7 @@ Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elut
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\label{fig:haeminagarose}
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\end{figure}
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\section{Photometrischer Bindungsassay}
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\label{sec:ergebnis_photometrie}
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Zur Analyse der Bindungseigenschaften von \ac{RTE1} an Hämin wurden drei Messreihen bei unterschiedlichen pH-Werten -- pH 6,5; pH 7,5; pH 8,5 -- durchgeführt. Hierfür wurden Aliquots der gereinigten Proteinlösung mit einem Volumen von jeweils \SI{2,5}{\milli\liter} wie in \ref{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie} beschrieben in die Waschpuffer pH 6,5, pH 7,5 und pH 8,5 umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden die Proteinlösungen dann auf eine Konzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} verdünnt und in die Messung eingesetzt. Die Obergrenze der eingesetzten Häminkonzentration von \SI{40}{\micro\Molar} ergab sich durch die Spezifikationen des verwendeten Photometers. Eine \SI{50}{\micro\Molar} Häminlösung weist bereits eine maximale Absorption von über 3 auf, der Obergrenze laut Herstellerangaben.
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@ -69,20 +71,20 @@ Zur Analyse der Bindungseigenschaften von \ac{RTE1} an Hämin wurden drei Messre
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\label{fig:spektren_uv_vis}
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\end{figure}
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Zur Bestimmung des K$_\text{d}$-Werts der Bindung wurde die Verschiebung der Absorptionsmaxima $\Delta A$ zueinander gegen die größte gemessene Verschiebung normiert und gegen die tatsächlich vorliegende Häminkonzentration $c$ aufgetragen. Letztere wurde über den Absorptionskoeffizienten von Hämin aus den aufgenommenen Pufferspektren bestimmt. Anschließend wurde eine Sättigungsfunktion über eine nichtlineare Regression angepasst:
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Zur Bestimmung des K$_\text{d}$-Werts der Bindung wurde die Verschiebung der Absorptionsmaxima \textDelta A zueinander gegen die größte gemessene Verschiebung normiert und gegen die tatsächlich vorliegende Häminkonzentration c aufgetragen. Letztere wurde über den Absorptionskoeffizienten von Hämin aus den aufgenommenen Pufferspektren bestimmt. Anschließend wurde eine Sättigungsfunktion über eine nichtlineare Regression angepasst:
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\begin{equation}
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\Delta A = \frac{a \cdot c}{K_d + c}
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\end{equation}
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a sei hierbei die Kapazität. Die entsprechenden Auftragungen und Sättingungsfunktionen sind in Abbildung \ref{fig:fit_uv_vis} dargestellt.
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a sei hierbei die Kapazität. Die entsprechenden Auftragungen und Sättingungsfunktionen sind in Abbildung \ref{fig:fit_uv_vis} dargestellt. Es ergaben sich K$_\text{d}$-Werte von \SI[seperr]{79,60(1272)}{\micro\Molar} (pH 6,5), \SI[seperr]{7,24(223)}{\micro\Molar} (pH 7,5) und \SI[seperr]{8,40(104)}{\micro\Molar} (pH 8,5), wobei jedoch zu beachten ist, dass bei pH 6,5 die Sättigung deutlich nicht erreicht wurde. Bei pH 8,5 streuen hingegen die Messwerte im Vergleich zu pH 7,5 relativ stark.
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\begin{figure}[htbp!]
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%\centering
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\subfloat[pH 6,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph65_binding.pdf}}
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\subfloat[pH 7,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph75_binding.pdf}}\\
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\subfloat[pH 8,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph85_binding.pdf}}
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\caption[Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima]{Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima; Bei pH 7,5 und 8,5 ist eine beginnende Sättigung zu erkennen, die Kapaziät liegt hierbei jeweils um 1, die K$_\text{d}$-Werte sind unter Berücksichtigung der Standardabweichung annähernd identisch. Bei pH 8,5 fallen die großen Standardabweichungen der Messwerte, sowie die zu hohe Kapazität auf. Letztere sollte durch die Normierung eigentlich 1 betragen. Darüberhinaus ist keine deutliche Sättigung sichtbar.}
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\caption[Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima]{Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima; Bei pH 7,5 und 8,5 ist eine beginnende Sättigung zu erkennen, die Kapaziät liegt hierbei jeweils um 1, die K$_\text{d}$-Werte sind unter Berücksichtigung der Standardabweichung annähernd identisch. Bei pH 8,5 fallen die großen Standardabweichungen der Messwerte, bei pH 6,5 die zu hohe Kapazität auf. Letztere sollte durch die Normierung eigentlich 1 betragen. Darüberhinaus ist bei pH 6,5 die Sättigung noch nicht erreicht.}
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\label{fig:fit_uv_vis}
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\end{figure}
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@ -90,7 +92,7 @@ a sei hierbei die Kapazität. Die entsprechenden Auftragungen und Sättingungsfu
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\section{Fluoreszenzspektroskopie}
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\label{sec:ergebnis_fluoreszenzspektroskopie}
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Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei einem pH von 7,5 zeigte, wurde diese Bedingung auch für die Fluoreszenzspektroskopie gewählt. Nach Anregung bei einer Wellenlänge von \SI{280}{\nano\meter} und Abzug des Pufferspektrums ergaben sich die in Abbildung \ref{fig:fluoreszenz_spektrum} dargestellten Emissionsspektren. Es zeigte sich ein deutlicher Quench bei zunehmender Häminkonzentration, der seine volle Ausprägung bei einer Häminkonzentration von \SIrange{20}{40}{\micro\Molar} erreichte.
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Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei einem pH von 7,5 zeigte, wurde diese Bedingung auch für die Fluoreszenzspektroskopie gewählt. Nach Anregung bei einer Wellenlänge von \SI{280}{\nano\meter} und Abzug des Pufferspektrums ergaben sich die in Abbildung \ref{fig:fluoreszenz_spektrum} dargestellten Emissionsspektren. Es zeigte sich ein deutlicher Quench bei zunehmender Häminkonzentration, der seine volle Ausprägung bei einer Häminkonzentration von \SIrange{20}{40}{\micro\Molar} erreichte. Die Analyse der Daten ergibt einen K$_\text{d}$-Wert von \SI{4,9}{\micro\Molar}.
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\begin{figure}[htbp!]
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@ -121,10 +123,23 @@ Die Daten der \ac{CD}-Spektren von \ac{RTE1} mit und ohne Hämin stammen aus unt
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\label{fig:cd_spektrum}
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\end{figure}
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Anhand der \ac{CD}-Spektren wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit \textit{CONTINLL} \citep{provencher_estimation_1981} durchgeführt. Sie ergab für \ac{RTE1} ohne Häminzugabe einen Sekundärstrukturanteil von \SI{18}{\percent} \textalpha-Helix, \SI{30}{\percent} \textbeta-Faltblatt, \SI{22}{\percent} \textbeta-Schleife und \SI{30}{\percent} \textit{Random Coil}. Bei Zugabe von Hämin ergibt die Strukturvorhersage Anteile von \SI{44}{\percent} \textalpha-Helix, \SI{6}{\percent} \textbeta-Faltblatt, \SI{25}{\percent} \textbeta-Schleife und \SI{25}{\percent} \textit{Random Coil}. Es zeigt sich also ein höherer Anteil von \textalpha-Helices und ein geringerer Anteil \textbeta-Faltblättern.
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Anhand der \ac{CD}-Spektren wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit CONTINLL \citep{provencher_estimation_1981} durchgeführt. Sie ergab für \ac{RTE1} ohne Häminzugabe einen Sekundärstrukturanteil von \SI{18}{\percent} \textalpha-Helix, \SI{30}{\percent} \textbeta-Faltblatt, \SI{22}{\percent} \textbeta-Schleife und \SI{30}{\percent} \textit{Random Coil}. Bei Zugabe von Hämin ergibt die Strukturvorhersage Anteile von \SI{44}{\percent} \textalpha-Helix, \SI{6}{\percent} \textbeta-Faltblatt, \SI{25}{\percent} \textbeta-Schleife und \SI{25}{\percent} \textit{Random Coil}. Zusätzlich wurde die Sekundärstruktur von \ac{RTE1} ohne Häminzugabe aus der Aminosäuresequenz mit \acs{SOPMA} berechnet \citep{geourjon_sopma:_1995}. Hierbei wurden \SI{27}{\percent} \textalpha-Helix, \SI{23}{\percent} \textbeta-Faltblatt, \SI{8}{\percent} \textbeta-Schleife und \SI{42}{\percent} \textit{Random Coil} vorhergesagt (Abbildung \ref{fig:strukturvorhersage}). Eine Gegenüberstellung der Sekundärstrukturanteile findet sich in Tabelle \ref{tab:sekundaerstruktur}.
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Bei Zugabe von Hämin zeigt sich also ein höherer Anteil von \textalpha-Helices und ein geringerer Anteil \textbeta-Faltblättern.
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\begin{table}[ht]
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\centering
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\small
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\caption[Sekundärstrukturanteile]{Sekundärstrukturanteile; Vergleich zwischen Vorhersage aus Aminosäuresequenz und \ac{CD}-Daten}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{Xllll}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{\textalpha-Helix [\si{\percent}]} & \textbf{\textbeta-Faltblatt [\si{\percent}]} & \textbf{\textbeta-Schleife [\si{\percent}]} & \textbf{\textit{Random Coil} [\si{\percent}]}\\
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\midrule
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\ac{RTE1} (\ac{SOPMA}) & 27 & 23 & 8 & 42\\
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\midrule
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\ac{RTE1} & 18 & 30 & 22 & 30 \\
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\ac{RTE1}/Hämin & 44 & 6 & 25 & 25 \\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\label{tab:sekundaerstruktur}
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\end{table}
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@ -42,7 +42,7 @@
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\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{lX}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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@ -50,7 +50,7 @@
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Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Greiner-Bio One, Frickenhausen\\
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Größenausschlusschromatographie PD-10 & GE-Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, SK\\
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Halbmikroküvetten & Hartenstein, Würzburg\\
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Häminagarose & Sigma-Aldrich, München\\
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Häminagarose & Sigma-Aldrich, München\\
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Ni-IDA & Macherey-Nagel, Düren\\
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Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
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Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
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@ -64,7 +64,7 @@
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\label{sec:standards}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{lX}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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@ -181,7 +181,7 @@
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\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid
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\end{description}
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\subsubsection{Puffer für den Zellaufschluss}
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\subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
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\begin{description}
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\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
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\SI{30}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl} pH 7,5\\
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@ -316,7 +316,7 @@
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\section{Methoden}
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\label{sec:methoden}
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Die Expression und Reinigung von \ac{RTE1} wurde bereits am Institut im Rahmen einer Diplomarbeit \citep{malach_expression_2009} etabliert. Im Verlauf dieser Arbeit wurden aber am Reinigungsprotokoll (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) Optimierungen vorgenommen.
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Die Expression und Reinigung von \ac{RTE1} wurde bereits am Institut im Rahmen einer Diplomarbeit \citep{malach_expression_2009} etabliert. In der vorliegenden Arbeit wurden aber am Reinigungsprotokoll (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) Optimierungen vorgenommen.
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\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
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\label{sec:transformation}
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@ -332,7 +332,7 @@ Als Selektionsmarker vermittelt pET-15b eine Ampicillinresistenz. Das Konstrukt
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\label{fig:vektor}
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\end{figure}
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Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation: \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetente Zellen wrden auf Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-Lösung versetzt. Anschließend werden die Zellen für \SI{10}{\minute} auf Eis inkubiert. Es erfolgt ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} für \SI{90}{\second}. Die Zellen für \SI{2}{\minute} auf Eis und nach Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} 2YT-Medium für \SI{1}{\hour} unter leichtem Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
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Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation: \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetente Zellen werden auf Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-Lösung versetzt. Anschließend werden die Zellen wurden für \SI{10}{\minute} auf Eis inkubiert. Es erfolgt ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} für \SI{90}{\second}. Die Zellen für \SI{2}{\minute} auf Eis und nach Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} 2YT-Medium für \SI{1}{\hour} unter leichtem Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
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Der Ansatz wurde dann auf 2YT-Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
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@ -356,9 +356,9 @@ Die Inkubation im Schüttler erfolgte bis zur Induktion bei einer Temperatur von
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Mit einem Poly-Histidin-Tag markierte Proteine lassen sich über eine Metallchelat"=Affinitätschromatographie aus einem Proteingemisch isolieren. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Säulenmaterial handelt es sich um \ac{IDA}, welche an Agarose immobilisiert ist. \ce{Ni^{2+}}-Ionen werden von \ac{IDA} dreifach koordinativ komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion der Poly-Histidin-markierten Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni^{2+}}-Ionen zur Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu Histidin in der Lage ist, dieses aus der Bindung mit \ce{Ni^{2+}} zu verdrängen.
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Die aufgeschlossenen Zellen (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurden bei \SI{230000}{\g} für \SI{20}{\minute} in einer auf \SI{4}{\celsius} gekühlten Ultrazentrifuge abzentrifugiert und das Pellet in \SI{10}{\milli\liter} Solubilisierungspuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde mit \SI{1}{\percent} (w/v) Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 versetzt.
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Das ursprüngliche Reinigungsprotokoll \citep[vgl.][]{malach_expression_2009} sah eine Solubilisierung über einen Zeitraum von \SI{10}{\minute} bei Raumtemperatur im Ultraschallbad vor. Hierfür musste das Lysat auf mehrere \SI{1,5}{\milli\liter}-Reaktionsgefäße aufgeteilt werden. Um die Anzahl der Arbeitsschritte zu verringern und die Kühlkette nicht bei der Solubilisierung abbrechen zu lassen, erfolgte die Solubilisierung im Rahmen dieser Arbeit über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
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Das ursprüngliche Reinigungsprotokoll \citep[vgl.][]{malach_expression_2009} sah eine Solubilisierung über einen Zeitraum von \SI{10}{\minute} bei Raumtemperatur im Ultraschallbad vor. Hierfür musste das Lysat auf mehrere \SI{1,5}{\milli\liter}-Reaktionsgefäße aufgeteilt werden. Um die Anzahl der Arbeitsschritte zu verringern und die Kühlkette nicht bei der Solubilisierung abbrechen zu lassen, erfolgte die diese im Rahmen dieser Arbeit über einen Zeitraum von \SI{30}{\minute} im Eisbad mittels eines Ultraschalldesintegrators.
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Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Scrhitten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
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Das Solubilisat wurde einer erneuten Ultrazentrifugation bei \SI{230000}{\g} und \SI{4}{\celsius} für \SI{20}{\minute} unterzogen. Der Überstand wurde in die nachfolgenden Reinigungsschritte eingesetzt. Zwei Tropfsäulchen wurden mit jeweils \SI{0,6}{\milli\liter} Ni-IDA befüllt. Es wurden nacheinander je \SI{5}{\CV} Nickelsulfatlösung und \SI{5}{\CV} Milli-Q-Wasser auf die Säulen gegeben. Anschließend wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation auf beide Säulen verteilt. Es folgten zwei Waschschritte mit je \SI{20}{\CV} Waschpuffer bzw. Waschpuffer + \SI{75}{\milli\Molar} Imidazol. Die Elution erfolgte mit \SI{8}{\CV} Waschpuffer + \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Für die spätere Analyse wurden von allen Schritten der Reinigung Proben genommen und später auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
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Auch für die eigentliche Reinigung wurde das ursprüngliche Protokoll vereinfacht. Es sah unter anderem die Verwendung von sechs Tropfsäulchen mit jeweils \SI{0,2}{\milli\liter} Säulenmaterial, sowie zwei weitere Waschschritte mit \SI{20}{\milli\Molar} bzw. \SI{50}{\milli\Molar} Imidazol \citep{malach_expression_2009} vor.
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@ -366,13 +366,13 @@ Das Säulenmaterial wurde gemäß den Herstellerangaben vor der Wiederverwendung
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\subsection{Denaturierende Reinigung}
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\label{sec:denaturierende_reinigung}
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Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt Fos-Cholin$^\text{\textregistered}$ 16 \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
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Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt {Fos"=Cholin$^\text{\textregistered}$ 16} \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den Membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
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Wasch- und Elutionspuffer enthielten ebenfalls \SI{8}{\Molar} Harnstoff.
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\subsection{\acs{SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\label{sec:sds_page}
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Die Proteinproben wurden auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen und dort nach ihrer Masse aufgetrennt \citep{laemmli_cleavage_1970}.
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Durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat \acs{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einer negativen Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Die Wanderungsgeschwindigkeit im dann angelegten elektrischen Feld durch das Gel ist somit allein von der Proteinmasse abhängig.
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Durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat (\acs{SDS}) werden die Proteine denaturiert und mit einer negativen Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Die Wanderungsgeschwindigkeit im dann angelegten elektrischen Feld durch das Gel ist somit allein von der Proteinmasse abhängig.
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Vor dem Auftrag auf das Gel wurden die Proben mit 4x-Probenpuffer versetzt. Expressionsproben wurden vor dem Auftragen für \SI{10}{\minute} auf \SI{95}{\celsius} erhitzt. Das Auftragsvolumen berechnete sich dann wie folgt:
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\begin{align}
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@ -434,7 +434,7 @@ Anschließend wurde das Gel mit Entwicklerlösung überschichtet und bis zur gen
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Bei Gelen, welche für einen Westernblot vorgesehen waren, kam ein gefärbter Proteingrößenstandard zum Einsatz. Das Gel wurde für etwa \SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die benötigten Filterpapiere, sowie die Nitrozellulosemembran wurden ebenfalls kurz in Transferpuffer getränkt.
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Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von \SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.
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Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolgt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von \SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.
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Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit TBT und einer mit TBS zu jeweils \SI{10}{\minute} an.
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@ -448,7 +448,7 @@ Die Proteinkonzentration in einer Lösung kann über einen \acl{BCA}-Assay ermi
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Im Rahmen dieser Arbeit wurden Proteinbestimmungen mit dem "`BCA Protein Assay Kit"' durchgeführt. Das \ac{BCA}-Reagenz wurde gemäß den Herstellerangaben angesetzt. Anschließend wurden die in den Tabellen \ref{tab:bca_ansaetze_kalibrierung} und \ref{tab:bca_ansaetze_proben} aufgeführten Ansätze in Halbmikroküvetten pipettiert und gevortext.
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Es folgte eine Inkubation bei \SI{37}{\celsius} für \SI{30}{\minute} im Brutschrank, woran die Absorptionsmessung anschloss. Bei der Berechnung der Proteinkonzentration in den Proben ist zu berücksichtigen, dass die Proben für die Kalibriergeraden im Vergleich zu den Proben um den Faktor 10 verdünnt wurden. Es wurden jeweils Dreifachbestimmungen durchgeführt.
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Es folgte eine Inkubation bei \SI{37}{\celsius} für \SI{30}{\minute} im Brutschrank, woran die Absorptionsmessung anschloss. Bei der Berechnung der Proteinkonzentration in den Proben ist zu berücksichtigen, dass die Standards für die Kalibriergerade im Vergleich zu den Proben um den Faktor 10 verdünnt wurden. Die Messung der Proben erfolgte als Dreifachbestimmung.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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@ -490,7 +490,7 @@ Bei Häminen handelt es sich um Komplexverbindungen der Häme, wobei das Eisenio
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\label{fig:haemin_struktur}
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\end{figure}
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Für den Nachweis einer Häminbindung durch \ac{RTE1} kamen vier unterschiedliche Methoden zum Einsatz: Eine Affinitätschromatographie mit Häminagarose, ein Photometrischer Nachweis über die Zugabe von freiem Hämin, der Nachweis über einen Tyrosin-Quench bei Zugabe von freiem Hämin sowie der Nachweis einer Sekundärstrukturänderung bei Häminzugabe über eine \ac{CD}-Spektroskopie. Für jede Methode kam jeweils frisch präpariertes \ac{RTE1} zum Einsatz.
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Für den Nachweis einer Häminbindung durch \ac{RTE1} kamen vier unterschiedliche Methoden zum Einsatz: Eine Affinitätschromatographie mit Häminagarose, ein photometrischer Nachweis über die Zugabe von freiem Hämin, der Nachweis über einen Tryptophan-Quench bei Zugabe von freiem Hämin sowie der Nachweis einer Sekundärstrukturänderung bei Häminzugabe über eine \ac{CD}-Spektroskopie. Für jede Methode kam jeweils frisch präpariertes \ac{RTE1} zum Einsatz.
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\subsubsection{Affinitätschromatographie mit Häminagarose}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet}
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@ -502,9 +502,9 @@ Nach dem Äquilibrieren wurden \SI{50}{\micro\liter} Proteinlösung auf die Bead
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\subsubsection{Photometrie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie}
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Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei in vielen Fällen eine Blauverschiebung des Soret-Peaks zu beobachten, da das Protein bzw. der Protein-Häm-Komplex unterschiedliche Absorptionsmaxima aufweisen \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bzw. ihrer relativen Verschiebung zueinander bestimmt werden.
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Häm-bindende Proteine zeigen, wenn ein Häm gebunden ist, häufig ein charakteristisches Absorptionsmaximum im so genannten Soret-Band um \SI{400}{\nano\meter}. Außerdem ist hierbei in vielen Fällen eine Verschiebung des Soret-Peaks zu beobachten, da das Protein bzw. der Protein-Häm-Komplex unterschiedliche Absorptionsmaxima aufweisen \citep{duncan_heme-binding_1999}. Die Bindung von Hämin an ein Protein kann also durch Beobachtung der Absorptionsmaxima im Soret-Band bzw. ihrer relativen Verschiebung zueinander bestimmt werden.
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Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag und in eine Quarzglasküvette überführt. Anschließend wurde ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}, je Messreihe wurden sechs Spektren aufgenommen.
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Hierfür wurde \ac{RTE1} nach der Reinigung über eine PD10-Säule in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann mit Waschpuffer soweit verdünnt, dass in einem Endvolumen von \SI{500}{\micro\liter} eine Proteinkonzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} vorlag. Die Lösung wurde in eine Quarzglasküvette überführt und ein Absorptionsspektrum im Bereich von \SIrange{300}{500}{\nano\meter} aufgenommen. Hämin wurde hinzutitriert, so dass die in Tabelle \ref{tab:haemin_konzentration_photometrie} aufgeführten Endkonzentrationen erreicht wurden. Alle Messungen erfolgten bei \SI{25}{\celsius}, je Messreihe wurden sechs Spektren aufgenommen.
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Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Häminzugabe. Zur Ermittlung der tatsächlich in der Küvette vorliegenden Häminkonzentration wurde die Küvette mit \SI{500}{\micro\liter} \SI{1}{\Molar} \ce{NaOH} befüllt, Häminstammlösung hinzutitriert und Absorptionsspektren aufgenommen. Aus diesen konnte mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten von Hämin (Datenblatt des Herstellers) die Konzentration in der Küvette bestimmt werden. %Aus den Pufferspektren wurden dann über den Exktionktionskoeffizienten (Datenblatt des Herstellers) die tatsächliche Hämin-Konzentration in der Küvette bestimmt. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren.
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\begin{table}[ht]
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@ -529,7 +529,7 @@ Zusätzlich wurden Pufferspektren aufgenommen, sowohl ohne als auch mit Häminzu
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\subsubsection{Fluoreszenzspektroskopie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_fluoreszenz}
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Bei der Anregung eines Fluorophors mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, kommt es zu einer Stokes-verschobenen Lichtemission bei einer für das Fluorophor spezifischen Wellenlänge. Bei Zugabe eines Quenchers tritt eine Fluoreszenzauslöschung (Quench) auf. Hierfür können unterschiedliche Effekte verantwortlich sein, allen gemein ist aber, dass sie entweder den Übergang des Fluorophors von seinem Grund- in den angeregten Zustand verhindern, oder den angeregten Zustand strahlungslos zurück in den Grundzustand überführen. Beispielsweise kann dies über eine Stoßdeaktivierung -- eine Kollision zwischen Fluorophor und Quencher -- oder einen Resonanzenergietransfer vom Fluorophor auf den Quencher erfolgen \citep{atkins_physikalische_2006}. In der Proteinanalytik wird häufig Tryptophan angeregt, dessen Absorptionsmaximum bei \SI{280}{\nano\meter} liegt und ein Emissionsmaximum im Bereich zwischen \SIrange{300}{350}{\nano\meter} aufweist \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}.
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Bei der Anregung eines Fluorophors mit Licht einer bestimmten Wellenlänge kommt es zu einer Stokes-verschobenen Lichtemission bei einer für das Fluorophor spezifischen Wellenlänge. Bei Zugabe eines Quenchers tritt eine Fluoreszenzauslöschung (Quench) auf. Hierfür können unterschiedliche Effekte verantwortlich sein, allen gemein ist aber, dass sie entweder den Übergang des Fluorophors von seinem Grund- in den angeregten Zustand verhindern, oder den angeregten Zustand strahlungslos zurück in den Grundzustand überführen. Beispielsweise kann dies über eine Stoßdeaktivierung -- eine Kollision zwischen Fluorophor und Quencher -- oder einen Resonanzenergietransfer vom Fluorophor auf den Quencher erfolgen \citep{atkins_physikalische_2006}. In der Proteinanalytik wird häufig Tryptophan angeregt, dessen Absorptionsmaximum bei \SI{280}{\nano\meter} liegt und ein Emissionsmaximum im Bereich zwischen \SIrange{300}{350}{\nano\meter} aufweist \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}.
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Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Tryptophane in \ac{RTE1} bei \SI{280}{\nano\meter} angeregt und das Emissionsspektrum zwischen \SIrange{300}{400}{\nano\meter} aufgenommen. Hierfür wurde zunächst \ac{RTE1} nach der Reinigung in Waschpuffer pH 7,5 ohne Imidazol über eine PD10-Säule umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden \SI{500}{\micro\liter} mit einer Proteinkonzentration von \SI{2,5}{\micro\Molar} in die Messung eingesetzt. Im Verlauf der Messung wurde Hämin bis zu einer Endkonzentration von \SI{60}{\micro\Molar} hinzutitriert. Es wurden drei Messreihen durchgeführt, wobei jedes aufgenommene Spektrum zehnfach akkumuliert wurde. Zusätzlich wurde ein Pufferspektrum mit entsprechender Häminkonzentration aufgenommen. Die Auswertung erfolgte über die Differenzspektren.
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@ -565,7 +565,7 @@ Wie beim photometrischen Bindungsnachweis erfolgte die Bestimmung der tatsächli
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\subsubsection{\acs{CD}-Spektroskopie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
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Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$, wobei letztlich ihre Differenz \textDelta\textepsilon gemessen und als Elliptizität \texttheta~angegeben -- d sei die Schichtdicke und c die Konzentration \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}:
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Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$ auf, wobei letztlich ihre Differenz \textDelta\textepsilon~gemessen und als Elliptizität \texttheta~angegeben wird -- d sei die Schichtdicke und c die Konzentration \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}:
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\begin{equation}
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\theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
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@ -1 +1,13 @@
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\chapter{Zusammenfassung}
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\chapter{Zusammenfassung}
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Ziel dieser Arbeit war es, eine Häminbindung von \ac{RTE1}, einem negativen Regulator der Ethylenantwort in \ac{A. thaliana} nachzuweisen und zu quantifizieren. Es konnten verschiedene Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung der Häminbindung etabliert werden.
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Hierfür wurde der \ac{RTE1}-kodierende Genabschnitt in einen aus pET-15b abgeleiteten Vektor kloniert, in den \ac{E. coli} Stamm BL21-Gold (DE) transformiert und in diesem expremiert. Das rekombinant hergestellte \ac{RTE1} konnte dann über einen His-Tag affinitätschromatographisch gereinigt werden.
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Zum Nachweis einer Häminbindung kam zunächst ein Häminagaroseassay zum Einsatz. Hämin ist hierbei an einer Agarosematrix immobilisiert und kann mit \ac{RTE1} in Lösung interagieren. Die Elution von gebundenem \ac{RTE1} erfolgte denaturierend oder unter Zugabe von freiem Hämin. In beiden Fällen ließ sich eine Bindung nachweisen.
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Darüberhinaus wurden Messungen im UV-Vis-Spektrophotometer durchgeführt. \ac{RTE1} mit gebundenem Hämin zeigt hier einen Absorptionsanstieg im Soret-Band bei gleichzeitiger Blauverschiebung, wobei letztere für die Bestimmung eines K$_\text{d}$-Wertes herangezogen wurde. Im Fluoreszenzspektrometer führt die Zugabe von Hämin zu einem Quench der Tryptophanfluoreszenz, welcher ebenfalls zur K$_\text{d}$-Bestimmung ausgewertet wurde. Beide Methoden ergaben für pH 7,5 einen K$_\text{d}$ von \SI[seperr]{7,24(223)}{\micro\Molar} (UV-Vis) bzw. \SI[seperr]{4,90(23)}{\micro\Molar} (Fluoreszenz). Es zeigte sich auch, dass die Bindungsaffinität bei saurem pH deutlich geringer ist, als bei physiologischem oder leicht alkalischen pH.
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Schließlich konnte mit einer \ac{CD}-Spektroskopie gezeigt werden, dass die Zugabe von Hämin eine Veränderung der Sekundärstruktur hin zu deutlich höherem \textalpha-helikalem Strukturanteil zur Folge hat.
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Die etablierten Bindungsassays können in zukünftigen Versuchen Hinweise -- beispielsweise zur erfolgreichen Renaturierung von denaturierend gereinigtem \ac{RTE1} -- liefern.
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