Umstellung auf XeLaTeX; Ergänzungen und Korrekturen
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7e01866ef2
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%\usepackage[utf8x]{inputenc} % Eingabekodierung UTF-8
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%\usepackage[T1]{fontenc} % Schriftkodierung
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%\usepackage{tipa} % Phonetische Symbole (z.B. %textbeta)
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%\usepackage{tipa} % Phonetische Symbole (z.B. %textbeta)
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\usepackage{libertine} % Schriftarten 'Linux Libertine' und 'Linux Biolinum'
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\usepackage[ngerman]{babel} % Neue Deutsche Rechtschreibung/Silbentrennung mit griechischen Buchstaben
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\usepackage[]{libertine} % Schriftarten 'Linux Libertine' und 'Linux Biolinum'
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%\usepackage[ngerman]{babel} % Neue Deutsche Rechtschreibung/Silbentrennung mit griechischen Buchstaben
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\usepackage{setspace} % Paket für das Setzen des Zeilenabstandes
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\usepackage{setspace} % Paket für das Setzen des Zeilenabstandes
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\onehalfspacing
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\onehalfspacing
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\usepackage{acronym} % Abkürzungen und Abkürzungsverzeichnis
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\usepackage{acronym} % Abkürzungen und Abkürzungsverzeichnis
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\usepackage[alsoload=synchem,locale=DE,loctolang={DE:ngerman},obeyall=true,decimalsymbol={{{,}}},tophrase={{ bis }}]{siunitx} % SI-Einheiten
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\usepackage[alsoload=synchem,locale=DE,loctolang={DE:german},obeyall=true,decimalsymbol={{{,}}},tophrase={{ bis }}]{siunitx} % SI-Einheiten
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\newunit{\bp}{bp} % Definition eigener Einheiten: Basenpaare
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\newunit{\bp}{bp} % Definition eigener Einheiten: Basenpaare
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\newunit{\kb}{kb} % Definition eigener Einheiten: Kilo-Basenpaare
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\newunit{\kb}{kb} % Definition eigener Einheiten: Kilo-Basenpaare
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\newunit{\Unit}{U} % Definition eigener Einheiten: Unit
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\newunit{\Unit}{U} % Definition eigener Einheiten: Unit
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@ -17,8 +22,11 @@
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\newunit{\psi}{psi} % Definition eigener Einheiten: Pounds per inch
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\newunit{\psi}{psi} % Definition eigener Einheiten: Pounds per inch
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\newunit{\CV}{CV}
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\newunit{\CV}{CV}
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\usepackage{tabularx} % Tabellen mit fester Breite
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\usepackage{tabularx} % Tabellen mit fester Breite
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\usepackage{longtable}
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\usepackage{longtable}
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\usepackage{booktabs} % 'Hübsche' Tabellen ohne vertikale Linien
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\usepackage{booktabs} % 'Hübsche' Tabellen ohne vertikale Linien
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@ -29,8 +37,8 @@
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\usepackage{natbib} % Naturwissenschaftliche Zitierungsstile
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\usepackage{natbib} % Naturwissenschaftliche Zitierungsstile
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%\usepackage[format=hang]{caption}[2008/08/24] % Formatierung von Bildunter-/Tabellenüberschriften
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%\usepackage[format=hang]{caption}[2008/08/24] % Formatierung von Bildunter-/Tabellenüberschriften
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\usepackage[format=plain,small]{caption}[2008/08/24]
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\usepackage[format=plain,small]{caption}[2008/08/24]
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\usepackage[fixlanguage]{babelbib} % Sprachanpassung für Literaturverzeichnis
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%\usepackage[fixlanguage]{babelbib} % Sprachanpassung für Literaturverzeichnis
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\selectbiblanguage{ngerman} % s.o.
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%\selectbiblanguage{german} % s.o.
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\usepackage{hyperref} % PDF-Eigenschaften (s.u.)
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\usepackage{hyperref} % PDF-Eigenschaften (s.u.)
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\hypersetup{
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\hypersetup{
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unicode=true, % non-Latin characters in Acrobat’s bookmarks
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unicode=true, % non-Latin characters in Acrobat’s bookmarks
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@ -28,7 +28,7 @@
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% \acro{GR}{\textit{GREEN RIPE}}
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% \acro{GR}{\textit{GREEN RIPE}}
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\acro{HRP}{\textit{horseradish peroxidase}, Meerrettich-Peroxidase}
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\acro{HRP}{\textit{horseradish peroxidase}, Meerrettich-Peroxidase}
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\acro{IDA}{Im\-in\-o\-di\-es\-sig\-säu\-re}
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\acro{IDA}{Im\-in\-o\-di\-es\-sig\-säu\-re}
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\acro{IPTG}{Isopropyl-$beta$-D-thiogalactopyranosid}
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\acro{IPTG}{Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid}
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\acro{MAP}{\textit{mitogen activated protein}}
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\acro{MAP}{\textit{mitogen activated protein}}
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\acro{MCS}{\textit{multiple cloning site}}
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\acro{MCS}{\textit{multiple cloning site}}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.), für die Analyse}
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\section{Das Phytohormon Ethylen}
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\section{Das Phytohormon Ethylen}
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Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanzen viele Aspekte von Entwicklung, Wachstum und Stressantwort reguliert \citep{kendrick_ethylene_2008}.
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Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanzen viele Aspekte von Entwicklung, Wachstum und Stressantwort reguliert \citep{kendrick_ethylene_2008}.
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\textit{In vivo} wird Ethylen aus der Aminosäure Methionin synthetisiert, welche über \ac{AdoMet} und \ac{ACC} in Ethylen umgewandelt wird. Dies geschieht unter ATP-Verbrauch im Cytoplasma, wobei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, die Umwandlung von \ac{AdoMet} zu \ac{ACC}, von der \ac{ACC}-Synthase katalysiert wird. Aus dem freiwerdenden 5'-Methylthioadenosin wird im Yang-Zyklus Methionin regeneriert (vgl. Abbildung \ref{fig:yang_zyklus}).
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\textit{In vivo} wird Ethylen aus der Aminosäure Methionin synthetisiert, welche über \ac{AdoMet} und \ac{ACC} in Ethylen umgewandelt wird. Dies geschieht unter ATP-Verbrauch im Cytoplasma, wobei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, die Umwandlung von \ac{AdoMet} zu \ac{ACC}, von der \ac{ACC}-Synthase katalysiert wird. Aus dem freiwerdenden 5'"=Methylthioadenosin wird im Yang-Zyklus Methionin regeneriert (vgl. Abbildung \ref{fig:yang_zyklus}).
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\begin{figure}[htbp!]
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@ -15,7 +15,7 @@ Ethylen (\ce{C2H4}) ist ein gasförmiges Phytohormon, welches in höheren Pflanz
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\section{Ethylensignalweg}
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\section{Ethylensignalweg}
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Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Hierdurch wird die nachgeschaltete \acs{MAP}-Kinase-Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).
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Die Ethylenwahrnehmung geschieht über in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (\acsu{ER}) integrierte Ethylenrezeptoren, welche dort Homo- und Heterodimere ausbilden können. Als kleines, hydrophobes Molekül kann Ethylen die Zellmembran durchqueren und bindet über den Kofaktor Kupfer innerhalb der Transmembrandomäne dieser Rezeptoren. Hierdurch wird die nachgeschaltete \acs{MAP}"=Kinase"=Kinase \ac{CTR1} inaktiviert. Für die Lokalisierung des Kofaktors Kupfer zeichnet \ac{RAN1}, ein Kupfertransporter, verantwortlich. Hierdurch kann die Signalweiterleitung über \ac{EIN2} erfolgen. \ac{EIN2} selbst reguliert die von \ac{EIN3} und \ac{EIL1} initiierte Transkription des \ac{ERF1}, welcher wiederum die Transkription von Ethylenantwortgenen induziert (vgl. Abbildung \ref{fig:ethylen_signalweg}).
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In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4) welche mit prokaryotischen Zwei-Komponenten-Histidinkinasen verwandt sind \citep{voet-van-vormizeele_mutants_2008}. Diese Rezeptoren zeigen eine funktionelle Redundanz und sind negative Regulatoren der Ethylenantwort \citep{resnick_involvement_2008}.
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In \ac{A. thaliana} existieren fünf homologe Ethylenrezeptoren (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4) welche mit prokaryotischen Zwei-Komponenten-Histidinkinasen verwandt sind \citep{voet-van-vormizeele_mutants_2008}. Diese Rezeptoren zeigen eine funktionelle Redundanz und sind negative Regulatoren der Ethylenantwort \citep{resnick_involvement_2008}.
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@ -117,11 +117,11 @@ Die Daten der \ac{CD}-Spektren von \ac{RTE1} mit und ohne Hämin stammen aus unt
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\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd_spektroskopie/spektrum.pdf}
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\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd_spektroskopie/spektrum.pdf}
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% spektrum.pdf: 548x427 pixel, 72dpi, 19.33x15.06 cm, bb=0 0 548 427
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% spektrum.pdf: 548x427 pixel, 72dpi, 19.33x15.06 cm, bb=0 0 548 427
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\caption[\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}]{\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}; Die Daten stammen von unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1}. \ac{RTE1} wurde in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16${^\text{\textregistered}}$ gelöst. Die Proteinkonzentration betrug \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von \SI{0,5}{\nano\meter} (\ac{RTE1} + Hämin) bzw. \SI{1}{\nano\meter} (\ac{RTE1}) und \SI{20}{\nano\meter\per\minute} aufgenommen. Es wurden jeweils 15 Spektren akkumuliert. Deutlich ist in beiden Fällen ein negativer Cotton-Effekt bei etwa \SI{207}{\nano\meter} zu erkennen, welcher charakteristisch für $\alpha$-helikale Strukturanteile ist. Der $\alpha$-helikale Anteil ist bei Häminzugabe deutlich erhöht. }
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\caption[\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}]{\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}; Die Daten stammen von unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1}. \ac{RTE1} wurde in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16${^\text{\textregistered}}$ gelöst. Die Proteinkonzentration betrug \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von \SI{0,5}{\nano\meter} (\ac{RTE1} + Hämin) bzw. \SI{1}{\nano\meter} (\ac{RTE1}) und \SI{20}{\nano\meter\per\minute} aufgenommen. Es wurden jeweils 15 Spektren akkumuliert. Deutlich ist in beiden Fällen ein negativer Cotton-Effekt bei etwa \SI{207}{\nano\meter} zu erkennen, welcher charakteristisch für α-helikale Strukturanteile ist. Der α-helikale Anteil ist bei Häminzugabe deutlich erhöht. }
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\label{fig:cd_spektrum}
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\label{fig:cd_spektrum}
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\end{figure}
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\end{figure}
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Anhand der \ac{CD}-Spektren wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit \textit{CONTINLL} \citep{provencher_estimation_1981} durchgeführt. Sie ergab für \ac{RTE1} ohne Häminzugabe einen Sekundärstrukturanteil von \SI{18}{\percent} $\alpha$-Helix, \SI{30}{\percent} $\beta$-Faltblatt, \SI{22}{\percent} $\beta$-Schleife und \SI{30}{\percent} \textit{Random Coil}. Bei Zugabe von Hämin ergibt die Strukturvorhersage Anteile von \SI{44}{\percent} $\alpha$-Helix, \SI{6}{\percent} $\beta$-Faltblatt, \SI{25}{\percent} $\beta$-Schleife und \SI{25}{\percent} \textit{Random Coil}. Es zeigt sich also ein höherer Anteil von $\alpha$-Helices und ein geringerer Anteil $\beta$-Faltblättern.
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Anhand der \ac{CD}-Spektren wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit \textit{CONTINLL} \citep{provencher_estimation_1981} durchgeführt. Sie ergab für \ac{RTE1} ohne Häminzugabe einen Sekundärstrukturanteil von \SI{18}{\percent} α-Helix, \SI{30}{\percent} β-Faltblatt, \SI{22}{\percent} β-Schleife und \SI{30}{\percent} \textit{Random Coil}. Bei Zugabe von Hämin ergibt die Strukturvorhersage Anteile von \SI{44}{\percent} α-Helix, \SI{6}{\percent} β-Faltblatt, \SI{25}{\percent} β-Schleife und \SI{25}{\percent} \textit{Random Coil}. Es zeigt sich also ein höherer Anteil von α-Helices und ein geringerer Anteil β-Faltblättern.
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\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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%\begin{center}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{Xl}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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\midrule
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@ -42,7 +42,7 @@
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\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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%\begin{center}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{ll}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{Xl}
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\toprule
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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@ -565,10 +565,10 @@ Wie beim photometrischen Bindungsnachweis erfolgte die Bestimmung der tatsächli
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\subsubsection{\acs{CD}-Spektroskopie}
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\subsubsection{\acs{CD}-Spektroskopie}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
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\label{sec:nachweis_haemin_bindung_cd}
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Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten $\epsilon_\text{L}$ und $\epsilon_\text{R}$, wobei letztlich ihre Differenz $\Delta\varepsilon$ gemessen und als Elliptizität $\theta$ angegeben. $d$ sei die Schichtdicke und $c$ die Konzentration $c$ angegeben \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}:
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Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten ε$_\text{L}$ und ε$_\text{R}$, wobei letztlich ihre Differenz Δε gemessen und als Elliptizität θ angegeben. d sei die Schichtdicke und c die Konzentration \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}:
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\begin{equation}
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\begin{equation}
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\theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
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\theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
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\end{equation}
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\end{equation}
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Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von \SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die $n \rightarrow \pi^*$ bzw. $\pi \rightarrow \pi^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration von \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und Molekulargewicht in molaren \ac{CD} ($\Delta\varepsilon$) umgerechnet.
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Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von \SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n → π$^\text{*}$ bzw. π → π$^\text{*}$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{lottspeich_bioanalytik_2006}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration von \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (Δε) umgerechnet.
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