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bachelorarbeit.tex

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  \end{center}
 \end{titlepage}
 
+% Widmung
+\thispagestyle{empty}
+\vspace*{\fill}
+\begin{center}
+ \Large Meinem Großvater
+\end{center}
+\vspace*{\fill}
+\clearpage
+
 %\maketitle
 \singlespacing
 \tableofcontents

inc/abkuerzungen.tex

@@ -9,7 +9,7 @@
  \acro{BisTris}{Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan}
  \acro{BCA}{Bicinchoninsäure}
  \acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
- \acro{CD}{Circulardichronismus}
+ \acro{CD}{Circulardichroismus}
  \acro{cmc}{\textit{critical micelle concentration}, kritische Mizellenkonzentration}
  \acro{CTR1}{\textit{CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE 1}}
  \acro{CV}{\textit{column volume}, Säulenvolumen}

inc/anhang.tex

@@ -1,5 +1,6 @@
 \appendix
 \chapter{Ergänzendes Material}
+
 \section{Nukleotid- und Aminosäuresequenzen}
 \begin{figure}[htbp!]
 \begin{lstlisting}
@@ -46,14 +47,12 @@ GSGC
  \label{fig:strukturvorhersage}
 \end{figure}
 
-
-
 \chapter{Danksagung}
 Ich bedanke mich zu aller erst bei Herrn Prof. Dr. Georg Groth für das interessante und herausfordernde Thema dieser Arbeit, die freundliche Aufnahme in der Arbeitsgruppe und die Denkanstöße.
 
 Darüberhinaus gilt mein Dank der gesamten Arbeitsgruppe für jegliche Unterstützung und den freundlichen Umgang, besonders David und Mareike für die vielen aufmunternden und lustigen Gespräche im Labor.
 
-Insbesondere danke ich Ellie, die schon im F-Praktikum meine -- manchmal wahrscheinlich banalen -- Fragen immer mit einer unglaublichen Geduld und Präzision beantwortet hat und eines der gezeigten CD-Spektren für mich aufgenommen hat. Entsprechend danke ich auch Mel, die das andere Spektrum unter Einsatz ihres Lebens -- zumindest aber der Küvette -- gemessen hat. Benni danke ich für das "`Um eine Ecke mehr als ich"'-Denken.
+Insbesondere danke ich Ellie, die schon im F-Praktikum meine -- manchmal wahrscheinlich banalen -- Fragen immer mit einer unglaublichen Geduld und Präzision beantwortet hat und eines der gezeigten CD-Spektren für mich aufgenommen hat. Entsprechend danke ich auch Mel, die das andere Spektrum -- unter tragischem Verlust der Küvette -- gemessen hat. Benni danke ich für das "`Um eine Ecke mehr als ich"'-Denken.
 
 Ohne Anuschka hätte es das Thema zumindest in dieser Form für mich nicht gegeben, ebensowenig wie das Expressions- und Reinigungsprotokoll. Danke!
 

inc/ergebnisse.tex

@@ -40,7 +40,7 @@ Unter denaturierenden Bedingungen lassen sich auch \textit{Inclusion-Bodies} sol
 \label{sec:ergebnis_haeminagarose}
 Das gereinigte \ac{RTE1} wurde wie unter \ref{sec:nachweis_haemin_bindung_affinitaet} beschrieben mit Häminagarose inkubiert. Gebundenes \ac{RTE1} wurde mittels Erhitzen in 2x SDS-Probenpuffer oder über die Zugabe von Hämin eluiert. Die \acs{SDS-PAGE} der Proben aus dem Häminagarose-Assay zeigt in der Elutionsfraktion eine Bande bei \SI{28}{\kilo\dalton}. Eine entsprechende Bande zeigt sich im aufgetragenen Proteinkonzentrat. Im Durchlauf ist nur ein sehr schwaches Signal zu erkennen, die Waschfraktionen weisen keine sichtbaren Banden auf (Abbildung \ref{fig:haeminagarose}).
 
-Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elution eine Lösung von freiem Hämin (\SI{11}{\milli\Molar}) eingesetzt. Auch hier zeigte sich eine -- allerdings schwächere -- Bande in der Elutionsfraktion. Danach noch gebundenes Protein wurde wie zuvor mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen eluiert.
+Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elution eine Lösung von freiem Hämin (\SI{11}{\milli\Molar}) eingesetzt. Auch hier zeigte sich eine -- allerdings schwächere -- Bande in der Elutionsfraktion. Danach noch gebundenes Protein wurde wie zuvor mit SDS-Probenpuffer und Erhitzen eluiert (Abbildung \ref{fig:haeminagarose_2}).
 
 \begin{figure}[htbp!]
  \centering
@@ -55,7 +55,7 @@ Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elut
  \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/haeminagarose_assay/haemin_agarose_batch_11_08_10_2_beschriftet.pdf}
  % haemin_agarose_batch_11_08_10_beschriftet.pdf: 683x621 pixel, 72dpi, 24.09x21.91 cm, bb=0 0 683 621
  \caption[Spezifität der Hämin-Bindung]{Spezifität der Hämin-Bindung; Von links nach rechts: Marker (M), Proteinkonzentrat (K), Durchlauf (D), Waschschritte (W1-3), Elutionen (E1, E2); E1 wurde mit \SI{11}{\milli\Molar} freiem Hämin, E2 im Anschluss an E1 mit 2x SDS-Probenpuffer und Erhitzen auf \SI{99}{\celsius} eluiert. Die \ac{RTE1}-Banden sind durch Pfeile markiert. Die durchgängige Hintergrundfärbung von E1 und E2 und insbesondere die starke Färbung im Bereich unterhalb von \SI{15}{\kilo\dalton} wird durch das freie Hämin hervorgerufen. Beim Auftragen wurden die Verdünnungsfaktoren berücksichtigt. }
- \label{fig:haeminagarose}
+ \label{fig:haeminagarose_2}
 \end{figure}
 
 \clearpage
@@ -63,15 +63,23 @@ Um die Spezifität der Bindung nachzuweisen wurde in weiteren Versuchen zur Elut
 \label{sec:ergebnis_photometrie}
 Zur Analyse der Bindungseigenschaften von Hämin an \ac{RTE1} wurden drei Messreihen bei unterschiedlichen pH-Werten -- pH 6,5; pH 7,5; pH 8,5 -- durchgeführt. Hierfür wurden Aliquots der gereinigten Proteinlösung mit einem Volumen von jeweils \SI{2,5}{\milli\liter} wie in \ref{sec:nachweis_haemin_bindung_photometrie} beschrieben in die Waschpuffer pH 6,5, pH 7,5 und pH 8,5 umgepuffert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden die Proteinlösungen dann auf eine Konzentration von \SI{1,5}{\micro\Molar} verdünnt und in die Messung eingesetzt. Die Obergrenze der eingesetzten Häminkonzentration von \SI{40}{\micro\Molar} ergab sich durch die Spezifikationen des verwendeten Photometers. Eine \SI{50}{\micro\Molar} Häminlösung weist bereits eine maximale Absorption von über 3 auf, der Obergrenze laut Herstellerangaben.
 
-\begin{figure}[htbp!]
+%\begin{figure}[htbp!]
  %\centering
- \subfloat[pH 6,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph65_spektrum_klein.pdf}}
- \subfloat[pH 7,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph75_spektrum_klein.pdf}}\\
- \subfloat[pH 8,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph85_spektrum_klein.pdf}}
- \caption[Differenzspektren des photometrischen Bindungsassays]{Differenzspektren des photometrischen Bindungsassays; Insbesondere bei pH 6,5 (a) und pH 7,5 (b) ist deutlich eine Verschiebung der Absorptionsmaxima bei höheren Häminkonzentrationen hin zu kürzeren Wellenlängen sichtbar.}
+% \subfloat[pH 6,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph65_spektrum_klein.pdf}}
+% \subfloat[pH 7,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph75_spektrum_klein.pdf}}\\
+% \subfloat[pH 8,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph85_spektrum_klein.pdf}}
+% \caption[Differenzspektren des photometrischen Bindungsassays]{Differenzspektren des photometrischen Bindungsassays; Insbesondere bei pH 6,5 (a) und pH 7,5 (b) ist deutlich eine Verschiebung der Absorptionsmaxima bei höheren Häminkonzentrationen hin zu kürzeren Wellenlängen sichtbar.}
+% \label{fig:spektren_uv_vis}
+%\end{figure}
+
+\begin{figure}[htbp!]
+ \centering
+ \includegraphics[height=0.9\textheight,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/spektren_kombiniert.pdf}
+ \caption[Differenzspektren des photometrischen Bindungsassays]{Differenzspektren des photometrischen Bindungsassays bei unterschiedlichem pH-Wert: pH 6,5 (A), pH 7,5 (B) und pH 8,5 (C); Insbesondere bei pH 6,5 (A) und pH 7,5 (B) ist deutlich eine Verschiebung der Absorptionsmaxima bei höheren Häminkonzentrationen hin zu kürzeren Wellenlängen sichtbar.}
  \label{fig:spektren_uv_vis}
 \end{figure}
 
+
 Zur Bestimmung des K$_\text{d}$-Werts der Bindung wurde die Verschiebung der Absorptionsmaxima \textDelta A zueinander gegen die größte gemessene Verschiebung normiert und gegen die tatsächlich vorliegende Häminkonzentration c aufgetragen. Letztere wurde über den Absorptionskoeffizienten von Hämin aus den aufgenommenen Pufferspektren bestimmt. Anschließend wurde eine Sättigungsfunktion über eine nichtlineare Regression angepasst:
 
 \begin{equation}
@@ -82,14 +90,21 @@ Zur Bestimmung des K$_\text{d}$-Werts der Bindung wurde die Verschiebung der Abs
 a sei hierbei die Kapazität. Die entsprechenden Auftragungen und Sättingungsfunktionen sind in Abbildung \ref{fig:fit_uv_vis} dargestellt. Es ergaben sich K$_\text{d}$-Werte von \SI[seperr]{79,60(1272)}{\micro\Molar} (pH 6,5), \SI[seperr]{7,24(223)}{\micro\Molar} (pH 7,5) und \SI[seperr]{8,40(104)}{\micro\Molar} (pH 8,5), wobei jedoch zu beachten ist, dass bei pH 6,5 die Sättigung deutlich nicht erreicht wurde. Bei pH 8,5 streuen hingegen die Messwerte im Vergleich zu pH 7,5 relativ stark.
 
 \begin{figure}[htbp!]
- %\centering
- \subfloat[pH 6,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph65_binding.pdf}}
- \subfloat[pH 7,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph75_binding.pdf}}\\
- \subfloat[pH 8,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph85_binding.pdf}}
- \caption[Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima]{Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima; Bei pH 7,5 und 8,5 ist eine beginnende Sättigung zu erkennen, die Kapaziät liegt hierbei jeweils um 1, die K$_\text{d}$-Werte sind unter Berücksichtigung der Standardabweichung annähernd identisch. Bei pH 8,5 fallen die großen Standardabweichungen der Messwerte, bei pH 6,5 die zu hohe Kapazität auf. Letztere sollte durch die Normierung eigentlich 1 betragen. Darüberhinaus ist bei pH 6,5 die Sättigung noch nicht erreicht.}
+ \centering
+ \includegraphics[height=0.9\textheight,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/binding_kombiniert.pdf}
+ \caption[Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima]{Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima; Bei pH 7,5 (B) und 8,5 (C) ist eine beginnende Sättigung zu erkennen, die Kapaziät liegt hierbei jeweils um 1, die K$_\text{d}$-Werte sind unter Berücksichtigung der Standardabweichung annähernd identisch. Bei pH 8,5 fallen die großen Standardabweichungen der Messwerte, bei pH 6,5 (A) die zu hohe Kapazität auf. Letztere sollte durch die Normierung eigentlich 1 betragen. Darüberhinaus ist bei pH 6,5 die Sättigung noch nicht erreicht.}
  \label{fig:fit_uv_vis}
 \end{figure}
 
+%\begin{figure}[htbp!]
+ %\centering
+% \subfloat[pH 6,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph65_binding.pdf}}
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+% \subfloat[pH 8,5]{\includegraphics[width=0.45\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/photometrischer_assay/ph85_binding.pdf}}
+% \caption[Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima]{Relative Verschiebung der Absorptionsmaxima; Bei pH 7,5 und 8,5 ist eine beginnende Sättigung zu erkennen, die Kapaziät liegt hierbei jeweils um 1, die K$_\text{d}$-Werte sind unter Berücksichtigung der Standardabweichung annähernd identisch. Bei pH 8,5 fallen die großen Standardabweichungen der Messwerte, bei pH 6,5 die zu hohe Kapazität auf. Letztere sollte durch die Normierung eigentlich 1 betragen. Darüberhinaus ist bei pH 6,5 die Sättigung noch nicht erreicht.}
+% \label{fig:fit_uv_vis}
+%\end{figure}
+
 \clearpage
 \section{Fluoreszenzspektroskopischer Nachweis der Häminbindung}
 \label{sec:ergebnis_fluoreszenzspektroskopie}
@@ -98,7 +113,7 @@ Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei
 
 \begin{figure}[htbp!]
  \centering
- \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/fluoreszenz_assay/spektrum.pdf}
+ \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/fluoreszenz_assay/spektrum.pdf}
  % spektrum.pdf: 428x377 pixel, 72dpi, 15.10x13.30 cm, bb=0 0 428 377
  \caption[Emissionsspektrum des Fluoreszenz-Assays]{Emissionsspektrum des Fluoreszenz-Assays nach Abzug des Pufferspektrums; Die Anregung erfolgte bei \SI{280}{\nano\meter}. Es ist ein deutlicher Quench bei zunehmender Häminkonzentration zu erkennen. Der Quench ist bei etwa \SIrange{20}{40}{\micro\Molar} Hämin vollständig.}
  \label{fig:fluoreszenz_spektrum}
@@ -106,9 +121,9 @@ Nachdem sich im photometrischen Bindungsassay der kleinste K$_\text{d}$-Wert bei
 
 \begin{figure}[htbp!]
  \centering
- \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/fluoreszenz_assay/binding_inset.pdf}
+ \includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/fluoreszenz_assay/binding_inset.pdf}
  % spektrum.pdf: 428x377 pixel, 72dpi, 15.10x13.30 cm, bb=0 0 428 377
- \caption[Häminbindung im Fluoreszenz-Assay]{Häminbindung im Fluoreszenz-Assay; Aufgetragen sind die relative Intensität des Fluoreszenzsignals gegen die Häminkonzentration. Letztere wurde aus einer Absorptionsmessung mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten ermittelt. F$_\text{0}$ ist die Intensität des Fluoreszenzsignals von \ac{RTE1} bei einer Wellenlänge von \SI{353}{\nano\meter} ohne Häminzugabe, F$_\text{0}$ die entsprechende Intensität bei Zugabe von Hämin. Das Inset zeigt eine halblogarithmische Auftragung der Daten.  In beiden Auftragungen zeigt sich das Erreichen der Sättigung.}
+ \caption[Häminbindung im Fluoreszenz-Assay]{Häminbindung im Fluoreszenz-Assay; Aufgetragen sind die relative Intensität des Fluoreszenzsignals gegen die Häminkonzentration. Letztere wurde aus einer Absorptionsmessung mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten ermittelt. F$_\text{0}$ ist die Intensität des Fluoreszenzsignals von \ac{RTE1} bei einer Wellenlänge von \SI{353}{\nano\meter} ohne Häminzugabe, F die entsprechende Intensität bei Zugabe von Hämin. Das Inset zeigt eine halblogarithmische Auftragung der Daten.  In beiden Auftragungen zeigt sich das Erreichen der Sättigung.}
  \label{fig:fluoreszenz_bindung}
 \end{figure}
 \clearpage
@@ -119,7 +134,7 @@ Die Daten der \ac{CD}-Spektren von \ac{RTE1} mit und ohne Hämin stammen aus unt
 
 \begin{figure}[htbp!]
  \centering
- \includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd_spektroskopie/spektrum.pdf}
+ \includegraphics[width=0.9\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd_spektroskopie/spektrum.pdf}
  % spektrum.pdf: 548x427 pixel, 72dpi, 19.33x15.06 cm, bb=0 0 548 427
  \caption[\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}]{\ac{CD}-Spektren von gereinigtem \ac{RTE1}; Die Daten stammen von unterschiedlichen Präparationen von \ac{RTE1}. \ac{RTE1} wurde in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat-Puffer mit \SI{0,003}{\percent} (w/v) Fos-Cholin 16 gelöst. Die Proteinkonzentration betrug \SI{0,05}{\milli\gram\per\milli\liter}. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von \SI{0,5}{\nano\meter} (\ac{RTE1} + Hämin) bzw. \SI{1}{\nano\meter} (\ac{RTE1}) und \SI{20}{\nano\meter\per\minute} aufgenommen. Es wurden jeweils 15 Spektren akkumuliert. Deutlich ist in beiden Fällen ein negativer Cotton-Effekt bei etwa \SI{207}{\nano\meter} zu erkennen, welcher charakteristisch für \textalpha-helikale Strukturanteile ist. Der \textalpha-helikale Anteil ist bei Häminzugabe deutlich erhöht. }
  \label{fig:cd_spektrum}

inc/material.tex

@@ -366,7 +366,7 @@ Das Säulenmaterial wurde gemäß den Herstellerangaben vor der Wiederverwendung
 
 \subsection{Denaturierende Reinigung}
 \label{sec:denaturierende_reinigung}
-Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt {Fos"=Cholin 16} \linebreak \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den Membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
+Die denaturierende Reinigung wurde analog zur nativen Reinigung (vgl. \ref{sec:native_reinigung}) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Solubilisierungspuffer statt \linebreak {Fos"=Cholin 16} \SI{8}{\Molar} Harnstoff enthielt. Durch die Zugabe von Harnstoff werden die im Zelllysat enthaltenen Proteine denaturiert, was dazu führt, dass membranintegrale bzw. -gebundene Proteine aus den Membranen gelöst werden. Durch die Denaturierung steht darüber hinaus der His-Tag vollständig für die Bindung an das Säulenmaterial zur Verfügung. Das Pellet wurde in diesem Puffer über einen Zeitraum von einer halben Stunde mittels eines Magnetrührers resuspendiert. Es erfolgte eine erneute Ultrazentrifugation, nach welcher der Überstand auf die mit Ni-\ac{IDA} befüllten Säulen verteilt wurde.
 Wasch- und Elutionspuffer enthielten ebenfalls \SI{8}{\Molar} Harnstoff.
 
 \subsection{\acs{SDS}-Polyacrylamidgelelektrophorese}