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Alexander Minges 2012-07-23 21:57:55 +02:00
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@ -11,7 +11,7 @@
Autoklav & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
\acs{CD}-Spektrometer J-715 & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
Chromatographiesystem \newlineÄKTAprime plus & GE Healthcare, Freiburg \\
Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus & GE Healthcare, Freiburg \\
DNA-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
@ -251,6 +251,7 @@ nach Herstellerangaben.
\subsection{Restriktionsverdau von \acs{DNA}}
\label{sec:restriktionsverdau_dna}
\begin{samepage}
Im Zuge der Klonierung wurde der Zielvektor pET-16b über die beiden Restriktionsenzyme \textit{BamH}I und \textit{Nde}I linearisiert.
Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}{\celsius} über einen Zeitraum von \SI{2}{\hour}.
\begin{description}
@ -261,6 +262,7 @@ Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}
\SI{10}{\Unit} \textit{Nde}I\\
ad \SI{25}{\micro\liter} \ce{dH2O}
\end{description}
\end{samepage}
\subsection{\acl{PCR}}
@ -280,10 +282,11 @@ vervielfacht werden.
\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
\label{sec:inserts_slic}
\begin{samepage}
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl. \ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach folgendem
Ansatz durchgeführt:
\begin{description}
\item[\ac{PCR}-Ansatz (\SI{50}{\micro\liter})] \hfill \\
\item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\
\SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
\SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
\SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
@ -292,11 +295,12 @@ Ansatz durchgeführt:
\SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
ad \SI{50}{\micro\liter} dH2O
\end{description}
\end{samepage}
Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
des zum \ac{PPDK}-Gen homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
des zum \acs{PPDK}-kodierenden Bereich homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.
\begin{table}
\begin{table}[hbt]
\centering
\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
\begin{tabular}{ccc}
@ -330,7 +334,7 @@ Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Ins
\begin{description}
\item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~\textequiv~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
\SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
\SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
\SI{1}{\Unit} T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
@ -345,8 +349,8 @@ In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowi
\begin{description}
\item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} \textequiv~\SI{150}{\nano\gram}\\
y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} \textequiv~\SI{141}{\nano\gram}\\
x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} ~\SI{150}{\nano\gram}\\
y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} ~\SI{141}{\nano\gram}\\
\SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{dH2O}
\end{description}