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@ -9,6 +9,7 @@
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\acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
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\acro{CBB}[CBB-G250]{Coomassie-Brilliant-Blau G-250}
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\acro{CD}{Circulardichroismus}
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\acro{C. symbiosum}[\textit{C. symbiosum}]{\textit{Chlostridium symbiosum}}
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\acro{CV}{Säulenvolumen, engl. \textit{column volume}}
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\acro{dCTP}{Desoxycytidintriphosphat}
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\acro{ddH2O}[\ce{ddH2O}]{Doppelt destilliertes Wasser}
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@ -18,6 +19,7 @@
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\acro{EDTA}{Ethylendiamintetraessigsäure}
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\acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}}
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\acro{F. trinervia}[\textit{F. trinervia}]{\textit{Flaveria trinervia}}
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\acro{F. brownii}[\textit{F. brownii}]{\textit{Flaveria brownii}}
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%\acro{HCl}[\ce{HCl}]{Salzsäure}
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\acro{HRP}{Meerrettich-Peroxidase, engl. \textit{horseradish peroxidase}}
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\acro{IDA}{Iminodiessigsäure}
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@ -32,21 +34,22 @@
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%\acro{NaHCO3}[\ce{NaHCO3}]{Natriumhydrogencarbonat}
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\acro{NaN3}[\ce{NaN3}]{Natriumazid}
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\acro{OD}{Optische Dichte}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.)}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi}~(lat.)}
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\acro{PAGE}{Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion}
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\acro{PEP}{Phosphoenolpyruvat}
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\acro{PEPCase}{Phosphoenolpyruvat-Carboxylase}
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\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
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\acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
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\acro{rcf}{\textit{relative centrifugal force} (engl.)}
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\acro{rcf}{\textit{relative centrifugal force}~(engl.)}
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\acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat}
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\acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung}
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\acro{SOPMA}{\textit{Self-optimized prediction method} (engl.)}
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\acro{SOPMA}{\textit{Self-optimized prediction method}~(engl.)}
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\acro{TAE}{Tris-Acetat-EDTA}
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\acro{TBS}{\textit{Tris-buffered saline} (engl.)}
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\acro{TBT}{\textit{Tris-buffered Tween} (engl.)}
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\acro{TBS}{\textit{Tris-buffered saline}~(engl.)}
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||||
\acro{TBT}{\textit{Tris-buffered Tween}~(engl.)}
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\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
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\acro{TEV}{\textit{Tobacco etch virus}~(engl.)}
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\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
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\acro{UV}{Ultraviolett}
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\end{acronym}
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@ -1,17 +1,59 @@
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\appendix
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\chapter{Nuklein- und Aminosäuresequenzen}
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\begin{texshade}{./misc/align_seq_ref.aln}
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\chapter{Anhang}
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\section{Nuklein- und Aminosäuresequenzen}
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\microtypesetup{protrusion=false}
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\begin{texshade}{./misc/seq_ref_aln.fa}
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\setsize{names}{scriptsize}
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\setsize{residues}{scriptsize}
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\setsize{features}{tiny}
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\setsize{names}{scriptsize}
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\setfamily{names}{sf}
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\shadingcolors{grays}
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\showruler{1}{top}
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\hidenumbering
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\hideconsensus
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\feature{bottom}{2}{71..71}{restriction}{Nde I}
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\feature{bottom}{2}{2712..2712}{restriction}{BamH I}
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\showcaption{Sequenzalignment der \acs{PPDK}-kodierenden Sequenz im Vektor pETEV-16b-ppdk und der
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Referenzsequenz}
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\shortcaption{Sequenzalignment pETEV-16b-ppdk}
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\end{texshade}
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||||
\chapter{Anhang}
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\clearpage
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\begin{texshade}{./misc/ma_as_aln.fa}
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\shadingmode{similar}
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\threshold[80]{50}
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\nameseq{1}{F. trinervia}
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\nameseq{2}{F. brownii}
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\nameseq{3}{Zea mays}
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\nameseq{4}{C. symbiosum}
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\setsize{names}{scriptsize}
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\setfamily{names}{sf}
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\setsize{residues}{scriptsize}
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\setsize{numbers}{scriptsize}
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\setsize{features}{tiny}
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\setfamily{legend}{sf}
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\setsize{legend}{scriptsize}
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\setsize{featurestyles}{scriptsize}
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\showruler{1}{top}
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\hidenumbering
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\defconsensus{{$\bullet$}}{{$\bullet$}}{{$\bullet$}}
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\showconsensus[ColdHot]{bottom}
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\nameconsensus{conservation}
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% \showlegend
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\showcaption{Multiples Alignment der Aminosäuresequenzen der \acs{PPDK}s aus \acs{F. trinervia}, \acs{F. brownii}, \textit{Zea mays} und
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\acs{C. symbiosum}. Sequenzidentitäten sind farbkodiert dargestellt: \SI{100}{\percent} Identität (violett), \SI{75}{\percent} (blau) und
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\SI{50}{\percent} (rosa).}
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\shortcaption{Multiples Alignment der Primärstrukturen verschiedener PPDKs}
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\end{texshade}
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\microtypesetup{protrusion=true}
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\chapter{Erklärung}
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Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Masterarbeit selbstständig verfasst und keine anderen, als die angegebenen Quellen und
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@ -1 +1,64 @@
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\chapter{Ergebnisse}
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\chapter{Ergebnisse}
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\label{sec:ergebnisse}
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\section{Klonierung}
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\label{sec:erg_klonierung}
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Sie \acs{SLIC}-Klonierung erfolgte wie in \ref{sec:slic} beschrieben. Die mittels \acs{PCR} synthetisierten \textit{Inserts}
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(vgl.~\ref{sec:inserts_slic}), sowie der linearisierte Vektor (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}) wurden auf ein zur Reinigung auf
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Agarosegel aufgetragen (vgl. \ref{sec:agarose_gelelektrophorese}). Es ergab sich das in Abbildung \ref{abb:agarosegel_vektor_insert} gezeigte Auftrennungsmuster.
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
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\centering
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\includegraphics[keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/vektor_linear_text.png}
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% vektor_linear_text.png: 615x551 pixel, 300dpi, 5.21x4.67 cm, bb=0 0 148 132
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\caption{}
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\label{abb:linearisierter_vektor}
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\end{subfigure}
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%
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~
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%
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\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
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\centering
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\includegraphics[keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/insert_pcr_text.png}
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% insert_pcr_text.png: 474x551 pixel, 300dpi, 4.01x4.67 cm, bb=0 0 114 132
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\caption{}
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\label{abb:}
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\end{subfigure}
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\caption[Agarosegel zur Reinigung von Vektor und dem Insert]{Exemplarischer Ausschnitt aus dem Agarosegel zur Reinigung von
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linearisiertem Vektor (a) und dem Insert (b) zur SLIC-Klonierung.
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Aufgetragen wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard und
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je \SI{20}{\micro\liter} Probe. Die erwarteten Größen sind \SI{5720}{\bp} (Vektor)
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und \SI{2691}{\bp} (Insert).}
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\label{abb:agarosegel_vektor_insert}
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\end{figure}
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Sowohl Vektor als auch Insert lagen innerhalb der erwarteten Größenordnung (\SI{5720}{\bp} bzw. \SI{2691}{\bp}) auf, so dass beide wie in \ref{sec:slic}
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beschrieben in den Ligationsansatz gegeben wurden. Zur Amplifikation des Vektors wurden dann \acs{E. coli} Zellen des Stamms XL1-Blue mit diesem transformiert
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(vgl. \ref{sec:transformation}) und auf Agarplatten angezogen. Mit einer Kolonie-PCR (vgl. \ref{sec:kolonie_pcr}) wurde überprüft, ob der untersuchte Klon
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das korrekte Insert trägt. Das enstsprechende Gelbild ist in Abbildung \ref{abb:kolonie_pcr} dargestellt.
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/colony_pcr.png}
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% colony_pcr.png: 1586x1474 pixel, 300dpi, 13.43x12.48 cm, bb=0 0 381 354
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||||
\caption[Agarosegel nach Kolonie-PCR]{Agarosegel nach Kolonie-PCR. Es wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard und je \SI{20}{\micro\liter} Probe aufgetragen.
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Untersucht wurden 24 Klone, von denen fünf (10, 13, 22, 23 und 24) ein Plasmid mit der korrekten Größe tragen.}
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\label{abb:kolonie_pcr}
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\end{figure}
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Von untersuchten 24 Klonen wiesen fünf ein Plasmid auf, das der erwarteten Größe von \SI{8351}{\bp} (Vektor~+~Insert) entspricht. Die fünf positiven Klone
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wurden in \SI{5}{\milli\liter} Kulturrörchen über Nacht angezogen und die Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit nach Herstellerangaben extrahiert.
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Proben der isolierten Plasmid-DNA wurden zur Sequenzierung eingeschickt (StarSEQ GmbH, Mainz). Es konnte gezeigt werden, dass das aus Klon \#22 isolierte
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Plasmid im für die \acs{PPDK} kodierenden Bereich keine Mutation trägt. Eine Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk ist in Abbildung \ref{abb:plasmidkarte}
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aufgeführt.
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/pETEV-16b-ppdk.pdf}
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% pETEV-16b-ppdk.pdf: 611x480 pixel, 72dpi, 21.55x16.93 cm, bb=0 0 611 480
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\caption{Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk}
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\label{abb:plasmidkarte}
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\end{figure}
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@ -132,8 +132,8 @@
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Erkennungssequenz (5'~--~3')}\\
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\midrule
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\textit{BamH}I & New England Biolabs, Frankfurt & CA/TATG\\
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\textit{Nde}I & New England Biolabs, Frankfurt & G/GATCC\\
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\textit{Nde}I & New England Biolabs, Frankfurt & CA/TATG\\
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\textit{BamH}I & New England Biolabs, Frankfurt & G/GATCC\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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@ -168,8 +168,10 @@
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\subsection{Plasmide}
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\label{sec:plasmide}
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Das tatsächlich eingesetzte Plasmid trägt die Bezeichnung pETEV-16b und ist ein Derivat des pET-16b-Vektors,
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das zusätzlich zwischen der für den Hexa-Histidin-Tag kodierenden Sequenz und dem Zielgen eine für die Schnittstelle
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der \acs{TEV}-Protease kodierende Sequenz beinhaltet.
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\begin{samepage}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
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\toprule
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@ -461,6 +463,7 @@ zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs
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\end{table}
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\subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}}
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\label{sec:kolonie_pcr}
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Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden zufällig ausgewählte Kolonien mittels einer Kolonie-PCR
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untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \acs{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
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vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht
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@ -791,7 +794,7 @@ Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen e
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\SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n~\textrightarrow~\textpi$^*$ bzw.
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\textpi~\textrightarrow~\textpi$^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr
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empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{Greenfield2007}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration
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von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und
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von \SI{0,2}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und
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Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.
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\subsection{Aktivitätsassay}
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@ -839,6 +842,16 @@ $\epsilon_{340} = \SI{6,3e3}{\per\Molar\per\centi\meter}$ \citep{McComb1976} und
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\subsection{Analyse von \ac{CD}-Spektren}
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\label{sec:analyse_cd_spektren}
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Die Analyse der aufgenommenen CD-Spektrem (siehe \ref{sec:cd_spektroskopie}) erfolgte mit dem Programmpaket \textit{CDPro} \citep{Sreerama2000}, sowie
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dem Programm \textit{K2D3} \citep{Louis-Jeune2011}. Die Analyse erfolgte jeweils in einem Wellenlängenbereich von \SIrange{190}{240}{\nano\meter}.
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Die berechneten Sekundärstrukturanteile wurden dann mit mit einer \textit{ab initio} Vorhersage, welche mit \acs{SOPMA} \citep{Geourjon1995a}
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berechnet wurde verglichen. Zusätzlich wurden die Sekundärstrukturanteile aus der bereits bekannten \acs{PPDK}-Struktur aus \textit{Zea mays}
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herangezogen.
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\subsection{Alignment von Nuklein- und Aminosäuresequenzen}
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\label{sec:alignment}
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Alignments von Nuklein- und Aminosäuren wurden mit dem Programm \textit{T-Coffee} \citep{Notredame2000,Wallace2006,Moretti2007,DiTommaso2011} erstellt. Das Programm \textit{Bowtie 2}
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\citep{Langmead2012} kam zum Einsatz, um \textit{Reads} aus der Sequenzierung an die Referenzsequenz zu alignieren.
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\subsection{Erstellung von Homologiemodellen}
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\label{sec:erstellung_homologiemodell}
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