Material und Methoden; Alignment hinzugefügt

inc/anhang.tex

@@ -1,4 +1,16 @@
 \appendix
+\chapter{Nuklein- und Aminosäuresequenzen}
+\begin{texshade}{./misc/align_seq_ref.aln}
+\setsize{names}{scriptsize}
+\setsize{residues}{scriptsize}
+\showruler{1}{top}
+\hidenumbering
+\hideconsensus
+\showcaption{Sequenzalignment der \acs{PPDK}-kodierenden Sequenz im Vektor pETEV-16b-ppdk und der
+         Referenzsequenz}
+\shortcaption{Sequenzalignment pETEV-16b-ppdk}
+\end{texshade}
+
 \chapter{Anhang}
 
 \chapter{Erklärung}

inc/material.tex

@@ -420,7 +420,7 @@ vervielfacht werden.
 \subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
 \label{sec:inserts_slic}
 \begin{samepage}
-Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl. \ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
+Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl.~\ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
 Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz.
 \begin{description}
  \item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\
@@ -501,8 +501,8 @@ Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cyc
 Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren, 
 welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
 
-Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl. \ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor 
+Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor 
-wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl. \ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die 
+wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl.~\ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die 
 für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
 Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
 %
@@ -549,7 +549,7 @@ ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
 \subsection{Stammhaltung}
 \label{sec:stammhaltung}
 Die Stammhaltung erfolgte in \SI{20}{\percent}igen Glycerinkulturen bei \SI{-80}{\celsius}. Hierfür wurden \SI{800}{\micro\liter} einer Übernachtkultur 
-(vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren.
+(vgl.~\ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren.
 
 \subsection{Heterologe Expression in \acs{E. coli}}
 \label{sec:expression_ecoli}
@@ -562,7 +562,7 @@ Die optimalen Bedingungen zur heterologen Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. c
 unterschiedliche Konzentrationen von \ac{IPTG} zur Induktion verwendet wurden. Es kamen hierbei die \acs{E. coli}"=Stämme BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3)
 zum Einsatz.
 
-Von den Agarplatten (vgl. \ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
+Von den Agarplatten (vgl.~\ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
 \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt.
 
 Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
@@ -592,9 +592,12 @@ in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für weitere Versuche bei \SI{-80}{\
 \section{Präparative Methoden}
 \label{sec:praeparative_methoden}
 
+Aufgrund der Kältelabilität der \acs{PPDK}, welche bei der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} besonder ausgeprägt ist \citep{Burnell1990}, wurden alle
+Schritte des Zellaufschlusses und der Reinigung -- wenn nicht abweichend angegeben -- bei Raumtemperatur durchgeführt.
+
 \subsection{Zellaufschluss}
 \label{sec:zellaufschluss}
-Ein Aliquot eingefrorener Zellen (siehe \ref{sec:praeparative_expression}) wurde bei Raumtemperatur mit \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer, 
+Ein Aliquot eingefrorener Zellen (siehe~\ref{sec:praeparative_expression}) wurde bei Raumtemperatur mit \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer, 
 sowie einer Spatelspitze DNAse I (Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt und durch Vortexen resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch Hochdruckdispersion
 bei einem Druck von \SI{1,35}{\kilo\bar} und einer Temperatur von \SI{15}{\celsius}.
 
@@ -628,18 +631,18 @@ von \SI{30}{\kilo\dalton} zu Einsatz.
 
 \subsection{Entsalzung von Proteinlösungen}
 \label{sec:entsalzung}
-Nach der Reinigung wurden Fraktionen, welche die \acs{PPDK} enthielten mittels Ultrafiltration (vgl. \ref{sec:konzentrierung}) auf ein Volumen
+Nach der Reinigung wurden Fraktionen, welche die \acs{PPDK} enthielten mittels Ultrafiltration (vgl.~\ref{sec:konzentrierung}) auf ein Volumen
 von etwa \SI{2,5}{\milli\liter} eingeengt. Zur Umpufferung des Konzentrats in Lagerungspuffer kam eine PD-10-Säule zum Einsatz. Es handelt sich
 hierbei um eine Größenauschlusschromatographie-Säule, bei welcher die Proteinanteile der Lösung eine wesentlich geringere Retentionszeit aufweisen,
 als die gelösten Salzionen und somit mit einem geringeren Volumen von der Säule eluieren.
 
 Die Säule wurde mit \SI{25}{\milli\liter} Lagerungspuffer äquilibriert und anschließend mit der konzentrierten Probe beladen. Anschließend wurde die 
 Differenz des Probenvolumens zu \SI{2,5}{\milli\liter} durch Lagerungspuffer ausgeglichen. Die Elution erfolgte mit \SI{3,5}{\milli\liter} 
-Lagerungspuffer. Die entsalzten Proben wurden erneut aufkonzentriert (vgl. \ref{sec:konzentrierung}).
+Lagerungspuffer. Die entsalzten Proben wurden erneut aufkonzentriert (vgl.~\ref{sec:konzentrierung}).
 
 \subsection{Lagerung von PPDK-Konzentraten}
 \label{sec:lagerung}
-Die kurzfristige Lagerung (max \SI{24}{\hour}) entsalzter \acs{PPDK}-Konzentrate (vgl. \ref{sec:entsalzung}) erfolgte nach Zugabe von \SI{1}{\percent}iger
+Die kurzfristige Lagerung (max.~\SI{24}{\hour}) entsalzter \acs{PPDK}-Konzentrate (vgl.~\ref{sec:entsalzung}) erfolgte nach Zugabe von \SI{1}{\percent}iger
 \ac{NaN3}-Lösung im Verhältnis 1:1000 bei Raumtemperatur.
 
 Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v) Glycerin bei \SI{-20}{\celsius} gelagert.
@@ -650,7 +653,7 @@ Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v)
 \subsection{Differentielle Zentrifugation}
 \label{sec:differentielle_zentrifugation}
 
- Nach dem Zellaufschluss (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurde eine Probe von \SI{10}{\micro\liter} aus dem Homogenisat als Kontrolle entnommen.
+ Nach dem Zellaufschluss (vgl.~\ref{sec:zellaufschluss}) wurde eine Probe von \SI{10}{\micro\liter} aus dem Homogenisat als Kontrolle entnommen.
  Anschließend wurde das Homogenisat bei \SI{2000}{\xg} für \SI{15}{\minute} bei \SI{15}{\celsius} zentrifugiert. Das resultierende Pellet 
  wurde im gleichen Volumen Aufschlusspuffer unter Zusatz von \SI{0,1}{\percent} (w/v) \acs{SDS} bei Raumtemperatur und unter Rühren rückgelöst.
 
@@ -676,8 +679,8 @@ Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v)
 
 \subsection{Größenauschlusschromatographie}
 \label{sec:groessenausschluss}
-Um die Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmen, wurde ein entsalztes Konzentrat (vgl. \ref{sec:entsalzung}) nach der Reinigung mittels 
+Um die Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmen, wurde ein entsalztes Konzentrat (vgl.~\ref{sec:entsalzung}) nach der Reinigung mittels 
-\acs{IMAC} (vgl. \ref{sec:affinitaetschromatographie}) einer analytischen Größenausschlusschromatographie unterzogen. Hierbei dient die Säulenmatrix
+\acs{IMAC} (vgl.~\ref{sec:affinitaetschromatographie}) einer analytischen Größenausschlusschromatographie unterzogen. Hierbei dient die Säulenmatrix
 als Molekularsieb. Höhermolekulare Anteile eluieren hierbei schneller von der Säule, als niedermolekulare Anteile, da letztere in die Poren des
 Säulenmaterials eindringen können.
 
@@ -712,13 +715,13 @@ Pipettierschema für drei kleine Gele (\SI{9}{\centi\meter}~\texttimes~\SI{10}{\
 \caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
 \begin{tabular}{lll}
 \toprule
-                                  & \textbf{Trenngel}       & \textbf{Sammelgel}\\
+                                  & {\textbf{Trenngel}}       & {\textbf{Sammelgel}}\\
 \midrule
 \acs{AA/BAA} 30                   & \SI{10,9}{\milli\liter} & \SI{2}{\milli\liter}\\
-Trenn-/Sammelgelpuffer            & \SI{9,2}{\milli\liter}  & \SI{2,6}{\milli\liter}\\
+Trenn-/Sammelgelpuffer            & \SI{13,2}{\milli\liter}  & \SI{2,5}{\milli\liter}\\
-\acs{ddH2O}                       & \SI{3,6}{\milli\liter}  & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
+\acs{ddH2O}                       & \SI{8,6}{\milli\liter}  & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
 \acs{TEMED}                       & \SI{16,5}{\micro\liter} & \SI{12,3}{\micro\liter}\\
-\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112}{\micro\liter}  & \SI{129}{\micro\liter}\\
+\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112,2}{\micro\liter}  & \SI{129}{\micro\liter}\\
 \bottomrule
 \end{tabular}
 \label{tab:pipettierschema_sds_page}
@@ -814,9 +817,11 @@ Der \acs{NADH}-Verbrauch kann photometrisch über die Abnahme der \acs{NADH}-spe
 Verbrauch eines \acs{NADH}-Moleküls gleichbedeutend ist mit der Bildung eines \acl{PEP}-Moleküls durch die \acs{PPDK}, kann aus dem Verbrauch an
 \acs{NADH} direkt auf die Bildungsrate von \acl{PEP} und somit auf die Aktivität der \acs{PPDK} geschlossen werden.
 
-Der Reaktionsansatz nach \citet{Salahas1990} (vgl. \ref{sec:puffer_aktivitaetsassay}) wurde mit \SI{0,5}{\micro\liter} gereinigtem und entsalztem 
+Der Reaktionsansatz nach \citet{Salahas1990} (vgl.~\ref{sec:puffer_aktivitaetsassay}) wurde mit \SI{0,5}{\micro\liter} gereinigtem und entsalztem 
-\acs{PPDK}-Konzentrat versetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{2,5}{\milli\liter} einer \SI{100}{\milli\Molar} \acs{ATP}-Lösung 
+\acs{PPDK}-Konzentrat versetzt. Die \acs{PPDK}-Lösung wurde zuvor für \SI{30}{\minute} bei \SI{30}{\celsius} inkubiert, um eine möglichst vollständige
-(Endkonzentration: \SI{1,25}{\milli\Molar}) gestartet und die Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} über einen Zeitraum von \SI{3}{\minute} aufgezeichnet.
+Aktivierung zu erreichen \citep{Ashton1990}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{2,5}{\milli\liter} einer \SI{100}{\milli\Molar} \acs{ATP}-Lösung 
+(Endkonzentration: \SI{1,25}{\milli\Molar}) gestartet und die Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} über einen Zeitraum von \SI{3}{\minute} bei \SI{30}{\celsius}
+aufgezeichnet.
 
 Der Verbrauch an \acs{NADH} kann über das Lambert-Beer'sche Gesetz in Gleichung \eqref{eq:lambert_beer} aus der gemessenen Extinktion mit Hilfe des molaren Extinktionskoeffizienten für NADH 
 $\epsilon_{340} = \SI{6,3e3}{\per\Molar\per\centi\meter}$ \citep{McComb1976} und der Schichtdicke berechnet werden.
@@ -837,3 +842,12 @@ $\epsilon_{340} = \SI{6,3e3}{\per\Molar\per\centi\meter}$ \citep{McComb1976} und
 
 \subsection{Erstellung von Homologiemodellen}
 \label{sec:erstellung_homologiemodell}
+Zur Visualisierung der wahrscheinlichen dreidimensionalen Struktur der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} und zur Vorbereitung zukünftiger Analysen
+wurden Homologiemodelle erstellt. Diese basieren auf den aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBG/1VBH) und \textit{Chlostridium symbiosum} (PDB: 1KBL) bekannten 
+Extremkonformationen des putativen \textit{Domain-swiveling}-Mechanismus.
+
+Die Homologiemodelle wurden mit dem Programm \textit{Modeller} \citep{Sali1993a} aus den jeweiligen Templaten und der Primärstruktur der 
+\acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Rosche1990} generiert. Im Falle des von \textit{Zea mays} abgeleiteten Modells wurde als Vorlage die Pyruvat gebundene Struktur
+verwendet (PDB: 1VBH). Lücken in der dreidimensionalen Struktur wurden anhand der ungebundenen Struktur (PDB: 1VBG) ergänzt.
+
+Die Evaluation der erstellten Modelle erfolgte mit dem Programmpaket \textit{PROCHECK} \citep{Laskowski1993,Laskowski1996}.

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 \usepackage{multirow}                               % Mehrzeilige Tabellen
 \usepackage{graphicx}                               % Grafikerweiterung
-\usepackage{tikz}
+\usepackage{tikz}                                   % Grafikbibliothek, u.a. benötigt von mhchem + pgf
 \usepackage[version=3]{mhchem}                      % Darstellung chemischer Summenformeln
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 \usepackage{natbib}                                 % Naturwissenschaftliche Zitierungsstile
 \usepackage[format=plain,footnotesize]{caption}[2008/08/24]
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 \nocite{Li2007}
 

misc/align_seq_ref.aln

@@ -0,0 +1,194 @@
+CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment
+
+
+pETEV-16b-ppdk      ATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCATCATCATCATCATCATCA
+FtPPDK-ref          ------------------------------------------------------------
+                                                                                
+
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+                                                               *****************
+
+pETEV-16b-ppdk      ACGCGTGTTTACGTTCGGCAAAGGTCGCTCGGAAGGCAACCGTGACATGAAATCGCTGCT
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