Fortführung Material und Methoden

inc/abkuerzungen.tex

@@ -5,7 +5,7 @@
  \acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
  \acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
  \acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
- \acro{CBB}[CBB G-250]{Coomassie-Brilliant-Blau G-250}
+ \acro{CBB}[CBB-G250]{Coomassie-Brilliant-Blau G-250}
  \acro{CD}{Circulardichroismus}
  \acro{CV}{Säulenvolumen, engl. \textit{column volume}}
  \acro{dCTP}{Desoxycytidintriphosphat}
@@ -20,16 +20,20 @@
  \acro{IDA}{Iminodiessigsäure}
  \acro{IMAC}{Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie}
  \acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
+ \acro{NaN3}[\ce{NaN3}]{Natriumazid}
  \acro{OD}{Optische Dichte}
  \acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.)}
  \acro{PAGE}{Polyacrylamidgelelektrophorese}
  \acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion}
  \acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
  \acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
+ \acro{rcf}{\textit{relative centrifugal force} (engl.)}
  \acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat}
  \acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung}
  \acro{SOPMA}{\textit{Self-optimized prediction method} (engl.)}
  \acro{TAE}{Tris-Acetat-EDTA}
+ \acro{TBS}{\textit{Tris-buffered saline} (engl.)}
+ \acro{TBT}{\textit{Tris-buffered Tween} (engl.)}
  \acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
  \acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
  \acro{UV}{Ultraviolett}

inc/material.tex

@@ -42,7 +42,8 @@
   Chromatographiepapier 3MM Chr                                   & Whatman, Maidstone, UK\\
   Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25                            & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
   Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter}  & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
-  \acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter}                & GE-Healthcare, Freiburg\\
+  Filter für Ultrazentrifugation "`Amicon Ultra"'                 & Millipore, Schwalbach\\
+  \acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter}                & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
   Mikrotiterplatten                                               & Hartenstein, Würzburg\\
   Petrischalen                                                    & Hartenstein, Würzburg\\
   Pipettenspitzen                                                 & Brand, Wertheim\\
@@ -120,7 +121,7 @@
   \midrule
   illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
   QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\
-  Roti-Quant$^\text{\textregistered}$ (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
+  Roti$^\text{\textregistered}$-Quant (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
   \bottomrule
  \end{tabularx}
  
@@ -198,10 +199,60 @@
  \SI{100}{\milli\liter} \acs{EDTA} (\SI{0,5}{\Molar}, pH 8)\\
  \SI{57,1}{\milli\liter} Essigsäure\\
  \SI{242}{\gram} Tris\\
- \SI{1}[ad~]{\liter} \ce{ddH2O}
+ \SI{1}[ad~]{\liter} \acs{ddH2O}
 \end{description}
 \end{samepage}
 
+\subsection{Puffer für die \acs{SDS}-\acs{PAGE}}
+\label{sec:puffer_sds_page}
+\begin{description}
+ \item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30)] \hfill \\  
+  \SI{30}{\percent} Acrylamid\\
+  \SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid
+ \item[Laufpuffer (10\texttimes)] \hfill \\
+  \SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}\\
+  \SI{1,92}{\Molar} Glycin\\
+  \SI{0,5}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
+ \item[Sammelgelpuffer, pH 6,7 (5\texttimes)] \hfill \\
+  \SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
+  \SI{0,5}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
+ \item[Trenngelpuffer, pH 8,9 (2,5\texttimes)] \hfill \\
+  \SI{1,875}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
+  \SI{0,25}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
+ \item[Probenpuffer (4\texttimes)] \hfill \\
+  \SI{30}{\milli\Molar} Borsäure\\
+  \SI{30}{\milli\Molar} \acs{Tris}\\
+  \SI{0,7}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
+  \SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
+  \SI{50}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
+  \SI{6,7}{\percent} (w/v) \acs{SDS}\\
+  \SI{16,7}{\percent} (w/v) Saccharose\\
+  \SI{0,16}{\percent} (w/v) Bromphenolblau
+ \item[Färbelösung] \hfill \\
+  \SI{0,1}{\percent}~(w/v) \acs{CBB}\\
+  \SI{2}{\percent}~(w/v) Phosphorsäure\\
+  \SI{5}{\percent}~(w/w) Aluminiumsulfat\\
+  \SI{10}{\percent}~(v/v) Ethanol
+\end{description}
+
+\subsection{Puffer und Lösungen für den Westernblot}
+\label{sec:puffer_westernblot}
+\begin{description}
+ \item[Transferpuffer]\hfill \\
+  \SI{25}{\milli\Molar} Tris\\
+  \SI{190}{\milli\Molar} Glycin\\
+  \SI{10}{\percent} (v/v) Ethanol
+ \item[TBS pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
+  \SI{10}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl}\\
+  \SI{150}{\milli\Molar} Natriumchlorid
+ \item[TBT pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
+  \SI{20}{\milli\Molar} Tris\\
+  \SI{500}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
+  \SI{0,05}{\percent} (v/v) Polysorbat 20
+ \item[Caseinlösung pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
+  \SI{1}{\percent} (w/v) Casein in TBS\\
+  \SI{2}{\milli\liter} \SI{2}{\Molar} \ce{NaOH} je \SI{500}{\milli\liter}
+\end{description}
 
 \subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
 \label{sec:puffer_zellauschluss}
@@ -263,6 +314,14 @@
 \end{description}
 \end{samepage}
 
+\subsection{Puffer für die \acs{CD}-Spektroskopie}
+\label{sec:puffer_cd_spektroskopie}
+ \begin{description}
+  \item[CD-Puffer] \hfill \\
+   \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat pH 7,9\\
+   \SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat
+ \end{description}
+
 \end{singlespace}
 \section{Molekularbiologische Methoden}
 \label{sec:methoden}
@@ -299,7 +358,7 @@ Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}
  \SI{3}{\micro\liter} NEBuffer 4 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
  \SI{10}{\Unit} \textit{BamH}I \\
  \SI{10}{\Unit} \textit{Nde}I\\
- ad \SI{25}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
+ ad \SI{25}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
 \end{description}
 \end{samepage}
 
@@ -352,7 +411,7 @@ Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleot
   \SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
   \SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (\SI{1}{\Unit\per\micro\liter}, peqlab, Erlangen) \\
   \SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
-  \SI{50}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
+  \SI{50}[ad~]{\micro\liter} \acs{ddH2O}
 \end{description}
 \end{samepage}
 Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
@@ -384,10 +443,10 @@ zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs
 
 \subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}}
 Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden zufällig ausgewählte Kolonien mittels einer Kolonie-PCR
-untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \ce{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
+untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \acs{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
 vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht
 und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \acs{2YT}-Medium verwendet.
-
+%
 \begin{description}
  \item[Kolonie-PCR-Ansatz] \hfill \\
  \SI{1}{\micro\liter} T7-Pro-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
@@ -395,9 +454,9 @@ und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \
  \SI{2,5}{\micro\liter} 10x~Thermo-Pol-Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
  \SI{0,5}{\Unit} Taq-Polymerase (\SI{5}{\Unit\per\micro\liter}, New England Biolabs, Frankfurt)\\
  \SI{0,25}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar})\\
- \SI{25}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
+ \SI{25}[ad~]{\micro\liter} \acs{ddH2O}
 \end{description}
-
+%
 Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt.
 
 \begin{table}[hbt]
@@ -427,30 +486,30 @@ Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}
 wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl. \ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die 
 für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
 Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
-
+%
 \begin{description}
  \item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
  x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~≡~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
  \SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
  \SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
  \SI{1}{\Unit} T4-\acs{DNA}-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
- ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
+ ad \SI{35}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
 \end{description}
-
+%
 Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von 
 \SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde 
 durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.
 
 In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert-\acs{DNA} (\SI{2691}{\bp}) im zweifachen molaren Verhältnis eingesetzt:
-
+%
 \begin{description}
  \item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
  x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} ≡~\SI{150}{\nano\gram}\\
  y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} ≡~\SI{141}{\nano\gram}\\
  \SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
- ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
+ ad \SI{10}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
 \end{description}
-
+%
 Der Ansatz wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{37}{\celsius} inkubiert. \SI{5}{\micro\liter} der Ansätze wurden für die
 Transformation von \acs{E. coli} XL1-Blue eingesetzt.
 
@@ -533,7 +592,7 @@ Die wie in \ref{sec:zellaufschluss} beschrieben aufgeschlossenen Zellen wurden z
 zentrifugiert um Zelltrümmer und \textit{Inclusion-Bodies} zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{100000}{\xg} und \SI{15}{\celsius}
 ulrazentrifugiert um lediglich lösliche Proteine im Überstand zu halten und Membranfragmente zu präzipitieren.
 
-Die mit \ce{Ni2+} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \ce{ddH20} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende
+Die mit \ce{Ni2+} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \acs{ddH2O} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende
 \ce{Ni2+} von der Säule zu eluieren und die Bildung von amorphem Nickel bei der nachfolgenden Benutzung der Puffer mit reduzierend wirksamen \acs{DTT}
 zu minimieren. 
 
@@ -543,12 +602,28 @@ mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} gesammelt und ggf. vereinigt. Zur Det
 
 Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt und neu mit \ce{Ni2+} beladen.
 
-
+\subsection{Konzentrierung von Proteinlösungen}
-\subsection{Konzentrierung}
 \label{sec:konzentrierung}
+Proteinlösungen wurden durch zentrifugale Ultrafiltration bei \SI{20}{\celsius} und \SI{5000}{\xg} aufkonzentriert. Hierbei kamen Konzentratoren mit einer Ausschlussgröße 
+von \SI{30}{\kilo\dalton} zu Einsatz.
 
-\subsection{Entsalzung}
+\subsection{Entsalzung von Proteinlösungen}
 \label{sec:entsalzung}
+Nach der Reinigung wurden Fraktionen, welche die \acs{PPDK} enthielten mittels Ultrafiltration (vgl. \ref{sec:konzentrierung}) auf ein Volumen
+von etwa \SI{2,5}{\milli\liter} eingeengt. Zur Umpufferung des Konzentrats in Lagerungspuffer kam eine PD-10-Säule zum Einsatz. Es handelt sich
+hierbei um eine Größenauschlusschromatographie-Säule, bei welcher die Proteinanteile der Lösung eine wesentlich geringere Retentionszeit aufweisen,
+als die gelösten Salzionen und somit mit einem geringeren Volumen von der Säule eluieren.
+
+Die Säule wurde mit \SI{25}{\milli\liter} Lagerungspuffer äquilibriert und anschließend mit der konzentrierten Probe beladen. Anschließend wurde die 
+Differenz des Probenvolumens zu \SI{2,5}{\milli\liter} durch Lagerungspuffer ausgeglichen. Die Elution erfolgte mit \SI{3,5}{\milli\liter} 
+Lagerungspuffer. Die entsalzten Proben wurden erneut aufkonzentriert (vgl. \ref{sec:konzentrierung}).
+
+\subsection{Lagerung von PPDK-Konzentraten}
+\label{sec:lagerung}
+Die kurzfristige Lagerung (max \SI{24}{\hour}) entsalzter \acs{PPDK}-Konzentrate (vgl. \ref{sec:entsalzung}) erfolgte nach Zugabe von \SI{1}{\percent}iger
+\ac{NaN3}-Lösung im Verhältnis 1:1000 bei Raumtemperatur.
+
+Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v) Glycerin bei \SI{-20}{\celsius} gelagert.
 
 \section{Analytische Methoden}
 \label{sec:analytische_methoden}
@@ -556,17 +631,156 @@ Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt u
 \subsection{Differentielle Zentrifugation}
 \label{sec:differentielle_zentrifugation}
 
+ Nach dem Zellaufschluss (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurde eine Probe von \SI{10}{\micro\liter} aus dem Homogenisat als Kontrolle entnommen.
+ Anschließend wurde das Homogenisat bei \SI{2000}{\xg} für \SI{15}{\minute} bei \SI{15}{\celsius} zentrifugiert. Das resultierende Pellet 
+ wurde im gleichen Volumen Aufschlusspuffer unter Zusatz von \SI{0,1}{\percent} (w/v) \acs{SDS} bei Raumtemperatur und unter Rühren rückgelöst.
+
+ Es wurden jeweils vom Überstand, als auch vom resuspendierten Pellet weitere Proben von \SI{10}{\micro\liter} Volumen entnommen. Diese 
+ wurden mit \SI{25}{\micro\liter} \acs{SDS}-Probenpuffer und \SI{65}{\micro\liter} \acs{ddH2O} versetzt. Alle weiteren Zentrifugationsschritte 
+ erfolgten hierzu analog und sind in Tabelle \ref{tab:differentielle_zentrifugation} aufgeführt.
+%
+\begin{table}[htb]
+ \centering
+ \caption{Zentrifugationsschritte der differentiellen Zentrifugation}
+ \begin{tabularx}{0.85\textwidth}{rcX}
+  \toprule
+   \textbf{\acs{rcf} [\si{\xg}]} & \textbf{Dauer [\si{\minute}]} & \textbf{Sediment}\\
+  \midrule
+   2000   & 15 & Nicht aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer\\
+   10000  & 30 & Aggregierte Proteine (\textit{Inclusion Bodies})\\
+   30000  & 30 & Große Membransysteme und assoziierte Proteine\\
+   100000 & 60 & Kleine Membransysteme und assoziierte Proteine\\
+  \bottomrule
+ \end{tabularx}
+ \label{tab:differentielle_zentrifugation}
+\end{table}
+
 \subsection{Größenauschlusschromatographie}
 \label{sec:groessenausschluss}
+Um die Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmen, wurde ein entsalztes Konzentrat (vgl. \ref{sec:entsalzung}) nach der Reinigung mittels 
+\acs{IMAC} (vgl. \ref{sec:affinitaetschromatographie}) einer analytischen Größenausschlusschromatographie unterzogen. Hierbei dient die Säulenmatrix
+als Molekularsieb. Höhermolekulare Anteile eluieren hierbei schneller von der Säule, als niedermolekulare Anteile, da letztere in die Poren des
+Säulenmaterials eindringen können.
+
+In dieser Arbeit wurde eine Superdex 200 5/150 GL-Säule der Firma GE Healthcare (Uppsala, SE) mit einem Säulenvolumen von \SI{3}{\milli\liter} 
+eingesetzt.
+
+Die Säule wurde mit \SI{5}{\CV} Lagerungspuffer äquilibriert und anschließend mit \SI{50}{\micro\liter} Probe in Lagerungspuffer beladen. Die
+Detektion erfolgte durch Absorptionsmessung bei \SI{280}{\nano\meter}. Eluiert wurde mit \SI{2}{\CV} Lagerungspuffer bei einer Flussrate von 
+\SI{0,2}{\milli\liter\per\minute}.
 
 \subsection{SDS-\acl{PAGE}}
 \label{sec:sds_page}
+Die Proteinproben wurden auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen und dort nach ihrer Masse aufgetrennt
+\citep{Laemmli1970}. Durch die Zugabe von \ac{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einr negativen
+Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Somit ist die Wanderungsgeschwindigkeit
+im elektrischen Feld allein von der Proteinmasse abhängig. Vor dem Auftragen auf das Geld wurden alle Proben mit 
+4\texttimes-Probenpuffer versetzt. Expressionsproben wurden darüber hinaus für \SI{10}{\minute} auf \SI{95}{\celsius} erhitzt.
+Im Falle der Expressionsproben errechnete sich das Auftragungsvolumen für große bzw. kleine Gele nach Gleichung \eqref{eq:page_gross} und \eqref{eq:page_klein}.
+%
+\begin{align}
+ \label{eq:page_gross}
+ V_\text{groß}~[\si{\micro\liter}] &= \frac{15}{OD_{600}}\\
+ \label{eq:page_klein}
+ V_\text{klein}~[\si{\micro\liter}] &= \frac{15}{OD_{600}} \ \cdot 0,75
+\end{align}
+%
+Für die Elektrophorese wurden \SI{10}{\percent}ige Gele eingesetzt. Tabelle \ref{tab:pipettierschema_sds_page} zeigt exemplarisch eine
+Pipettierschema für drei kleine Gele (\SI{9}{\centi\meter}~\texttimes~\SI{10}{\centi\meter}).
+%
+\begin{table}[htb]
+\centering
+\caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
+\begin{tabular}{lll}
+\toprule
+                                  & \textbf{Trenngel}       & \textbf{Sammelgel}\\
+\midrule
+\acs{AA/BAA} 30                   & \SI{10,9}{\milli\liter} & \SI{2}{\milli\liter}\\
+Trenn-/Sammelgelpuffer            & \SI{9,2}{\milli\liter}  & \SI{2,6}{\milli\liter}\\
+\acs{ddH2O}                       & \SI{3,6}{\milli\liter}  & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
+\acs{TEMED}                       & \SI{16,5}{\micro\liter} & \SI{12,3}{\micro\liter}\\
+\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112}{\micro\liter}  & \SI{129}{\micro\liter}\\
+\bottomrule
+\end{tabular}
+\label{tab:pipettierschema_sds_page}
+\end{table}
+%
+Um die Größenzuordnung der Proteinbanden zu gewährleisten, wurden die in \ref{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren} genannten
+Standards eingesetzt. Bei kleinen Gelen wurde nach dem Beladen für \SI{1}{\hour} eine Stromstärke von \SI{35}{\milli\ampere} je Gel angelegt.
+Größe Gele liefen über Nacht bei \SI{50}{\milli\ampere}.
+
+\subsection{Kolloidale Coomassie-Färbung}
+\label{sec:faerbung_coomassie}
+Mit der kolloidalen Coomassie-Färbung nach \citet{Kang2002} lassen sich Proteine in Polyacrylamid-Gelen bis zu einer Nachweisgrenze von etwa \SI{1}{\nano\gram} 
+detektieren. Sie ist damit ähnlich sensitiv wie eine Silberfärbung.
+
+Die Gele wurden drei Mal für jeweils \SI{10}{\minute} in \acs{ddH2O} gewaschen und anschließend für mindestens \SI{2}{\hour} in der Färbelösung
+inkubiert. Nach dieser Zeit sind etwa \SI{90}{\percent} der maximalen Farbintensität erreicht \citep{Kang2002}. Eine Entfärbung des Hintergrunds kann durch mehrfaches
+Waschen mit \acs{ddH2O} erreicht werden.
+
+\subsection{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen}
+\label{sec:westernblot}
+Über einen Westernblot können Proteine aus einem SDS-Gel elektrophoretisch auf einen Membran übertragen und dort fixiert werden. 
+Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteine auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das 
+Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.
+
+Bei Gelen, welche für einen Westernblot vorgesehen waren, kam ein gefärbter Proteingrößenstandard zum Einsatz. Das Gel wurde für etwa 
+\SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die benötigten Filterpapiere, sowie die Nitrozellulosemembran wurden ebenfalls kurz in 
+Transferpuffer getränkt.
+
+Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolgt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen 
+Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von 
+\SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.
+
+Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in \acs{TBS} auf einem 
+Rotationsschüttler inkubiert. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute} an.
+
+Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-\acs{HRP}-Antikörper im Verhältnis 1:10000 
+enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten 
+zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper ließ sich über die gekoppelte 
+Meerrettich-Peroxidase (\acs{HRP}) mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. die \acs{HRP} oxidiert in Anwesenheit von 
+Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es zu einer Lichtemission kommt.
+
+Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor 
+(LAS 4000 mini, Fujifilm) eingesetzt.
+
 
 \subsection{Konzentrationsbestimmung von Proteinen}
 \label{sec:konzentrationsbestimmung_proteine}
+Die Konzentration von Proteinen wurde nach \citet{Bradford1976} bestimmt. Hierzu wurde in einer Mikrotiterplatte \SI{50}{\micro\liter} einer
+Verdünnung der zu vermessenden Proteinlösung mit \SI{200}{\micro\liter} Bradford-Reagenz aus dem Roti$^{\text{\textregistered}}$-Quant-Kit versetzt.
+Die Probe wurde für \SI{5}{\minute} bei Raumtemperatur inkubiert und die Absorption bei \SI{595}{\nano\meter} gemessen.
+
+Die Berechnung der Proteinkonzentration erfolgte anhand einer mit bovinem Serumalbumin \acs{BSA} erstellten Kalibriergeraden. Alle Messungen erfolgten in Dreifachbestimmung.
 
 \subsection{\acl{CD}-Spektroskopie}
 \label{sec:cd_spektroskopie}
+Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken 
+ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen 
+weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$ 
+auf, wobei letztlich ihre Differenz \textDelta\textepsilon~gemessen und als Elliptizität \texttheta~angegeben wird -- d sei die Schichtdicke und c 
+die Konzentration \citep{Greenfield2007}:
+%
+ \begin{equation}
+  \theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
+ \end{equation}
+%
+Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von 
+\SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n~\textrightarrow~\textpi$^*$ bzw. 
+\textpi~\textrightarrow~\textpi$^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr 
+empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{Greenfield2007}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration 
+von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und 
+Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.
+
+\subsection{Aktivitätsassay}
+\label{sec:aktivitaetsassay}
+
 
 \section{Bioinformatische Methoden}
 \label{sec:bioinformatische_methoden}
+
+\subsection{Analyse von \ac{CD}-Spektren}
+\label{sec:analyse_cd_spektren}
+
+\subsection{Erstellung von Homologiemodellen}
+\label{sec:erstellung_homologiemodell}

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