Material und Methoden

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inc/abkuerzungen.tex

@@ -17,15 +17,16 @@
  \acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}}
  \acro{F. trinervia}[\textit{F. trinervia}]{\textit{Flaveria trinervia}}
  \acro{HRP}{Meerrettich-Peroxidase, engl. \textit{horseradish peroxidase}}
+ \acro{IDA}{Iminodiessigsäure}
  \acro{IMAC}{Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie}
  \acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
  \acro{OD}{Optische Dichte}
  \acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.)}
+ \acro{PAGE}{Polyacrylamidgelelektrophorese}
  \acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion}
  \acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
  \acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
  \acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat}
- \acro{SDS-PAGE}{Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese}
  \acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung}
  \acro{SOPMA}{\textit{Self-optimized prediction method} (engl.)}
  \acro{TAE}{Tris-Acetat-EDTA}

inc/anhang.tex

@@ -1,2 +1,12 @@
 \appendix
-\chapter{Anhang}
+\chapter{Anhang}
+
+\chapter{Erklärung}
+Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Masterarbeit selbstständig verfasst und keine anderen, als die angegebenen Quellen und 
+Hilfsmittel benutzt habe. Alle Stellen, die ich aus den Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommen habe, sind als solche kenntlich gemacht.
+
+\vspace{6em}
+
+\noindent \rule{7cm}{1pt}
+
+Alexander Ralph Michael Minges \hfill Düsseldorf, \today

inc/material.tex

@@ -11,8 +11,8 @@
   Autoklav                                                 & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
   Automatische Pipetten                                    & Gilson, Bad Camberg\\
   \acs{CD}-Spektrometer J-715                              & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
-  Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus             & GE Healthcare, Freiburg \\
-  \acs{DNA}-Gelkammersystem PerfectBlue                          & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
+  Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus            & GE Healthcare, Uppsala, SE \\
+  \acs{DNA}-Gelkammersystem PerfectBlue                    & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
   Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry'                    & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
   Gelsysteme für große Gele                                & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
   Inkubationsschüttler INNOVA 44R                          & New Brunswick, Nürtigen\\
@@ -40,7 +40,7 @@
   \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
   \midrule
   Chromatographiepapier 3MM Chr                                   & Whatman, Maidstone, UK\\
-  Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25                            & GE Healthcare, Freiburg\\
+  Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25                            & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
   Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter}  & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
   \acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter}                & GE-Healthcare, Freiburg\\
   Mikrotiterplatten                                               & Hartenstein, Würzburg\\
@@ -118,7 +118,7 @@
   \toprule
   \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
   \midrule
-  illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Freiburg\\
+  illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
   QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\
   Roti-Quant$^\text{\textregistered}$ (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
   \bottomrule
@@ -139,6 +139,7 @@
 \subsection{Bakterienstämme}
 \label{sec:batrienstaemme}
 
+\begin{samepage}
  \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
   \toprule
   \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\
@@ -147,11 +148,13 @@
   BL21 Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm} Tet$^\text{r}$ gal \textlambda(DE3) \textit{endA} Hte\\
   XL1-Blue & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} \textit{recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac} [F' \textit{proAB lacI$^\text{q}$ Z\textDelta M15} Tn\textit{10} (Tet$^\text{r}$)]\\
   \bottomrule
- \end{tabularx} 
+ \end{tabularx}
+\end{samepage}
  
 \subsection{Synthetische Oligonukleotide}
 \label{sec:synthetische_oligonukleotide}
 
+\begin{samepage}
  \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.3\textwidth}X}
   \toprule
   \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Sequenz (5'~--~3')} \\
@@ -160,10 +163,13 @@
   pETEV-16b-PPDK-rev & \texttt{TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAG \newline TTAAACAATCACTTGGGCGG}\\
   \bottomrule
  \end{tabularx} 
+\end{samepage}
  
 \subsection{Plasmide}
 \label{sec:plasmide}
 
+
+\begin{samepage}
  \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
   \toprule
   \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Marker}\\
@@ -171,6 +177,7 @@
   pET-16b & Novagen, Darmstadt & Ampicillinresistenz\\
   \bottomrule
  \end{tabularx} 
+\end{samepage}
  
 \subsection{Kulturmedien}
 \label{sec:kulturmedien}
@@ -391,7 +398,7 @@ und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \
  \SI{25}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
 \end{description}
 
-Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß dem in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt.
+Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt.
 
 \begin{table}[hbt]
 \centering
@@ -466,17 +473,21 @@ ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
 Die Stammhaltung erfolgte in \SI{20}{\percent}igen Glycerinkulturen bei \SI{-80}{\celsius}. Hierfür wurden \SI{800}{\micro\liter} einer Übernachtkultur 
 (vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren.
 
-\subsection{Expression in \acs{E. coli}}
+\subsection{Heterologe Expression in \acs{E. coli}}
 \label{sec:expression_ecoli}
 Die Transformation kompetenter Zellen erfolgte wie in \ref{sec:transformation} beschrieben. Die Anzucht erfolgte in \acs{2YT}-Medium 
 mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin.
 
 \subsubsection{Expressionsstudien}
 \label{sec:expression_ecoli_studien}
-Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
+Die optimalen Bedingungen zur heterologen Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} wurden durch Expressionsstudien evaluiert, bei denen 
+unterschiedliche Konzentrationen von \ac{IPTG} zur Induktion verwendet wurden. Es kamen hierbei die \acs{E. coli}"=Stämme BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3)
+zum Einsatz.
+
+Von den Agarplatten (vgl. \ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
 \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt.
 
-Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter} Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
+Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
 und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer 
 \acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar}, \SI{0,5}{\milli\Molar} und \SI{1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
 
@@ -484,22 +495,78 @@ Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30
 wurden die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet.
 
 \subsubsection{Präparative Expression}
+\label{sec:praeparative_expression}
+Die heterologe Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} erfolgte mit den in den Expressionsstudien als besonders geeignet explorierten Bedingungen.
+Als Expressionsstamm kam \acs{E. coli} BL21 (DE3) zum Einsatz.
+
 Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{100}{\milli\liter} Volumen in unschikanierten \SI{250}{\milli\liter}-Kolben angesetzt. Die 
 Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der 
 Hauptkulturen eingesetzt.
 
-Hierfür wurden \SI{2}{\liter} Kolben mit Schikane und \SI{500}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
+Hierfür wurden \SI{2}{\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{500}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
 und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer 
 \acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
 
 Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Am nächsten Tag wurden
-die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet.
+die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet. Die Zellpellets wurden in \SI{4}{\gram}-Aliquots
+in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für weitere Versuche bei \SI{-80}{\celsius} gelagert.
 
 \section{Präparative Methoden}
 \label{sec:praeparative_methoden}
 
+\subsection{Zellaufschluss}
+\label{sec:zellaufschluss}
+Ein Aliquot eingefrorener Zellen (siehe \ref{sec:praeparative_expression}) wurde bei Raumtemperatur mit \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer, 
+sowie einer Spatelspitze DNAse I (Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt und durch Vortexen resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch Hochdruckdispersion
+bei einem Druck von \SI{1,35}{\kilo\bar} und einer Temperatur von \SI{15}{\celsius}.
+
+\subsection{Proteinaufreinigung durch Affinitätschromatographie}
+\label{sec:affinitaetschromatographie}
+Proteine, die mit einem Poly-Histidin-Tag markiert sind, lassen sich über eine \acf{IMAC} aus
+einem Proteingemisch isolieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden HisTrap$^\text{\textregistered}$ HP-Säulen mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter}
+eingesetzt. Als Säulenmaterial dient quervernetzte Agarose an welche \acf{IDA} immobilisiert ist. \ce{Ni2+}-Ionen werden von \acs{IDA} dreifach koordinativ
+komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion Poly-Histidin-markierter Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni2+}-Ionen zur
+Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über die Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu
+Histidin in der Lage ist, dieses kompetitiv aus der Bindung mit \ce{Ni2+} zu verdrängen.
+
+Die wie in \ref{sec:zellaufschluss} beschrieben aufgeschlossenen Zellen wurden zunächst  bei \SI{10000}{\xg} und \SI{15}{\celsius} für \SI{30}{\minute}
+zentrifugiert um Zelltrümmer und \textit{Inclusion-Bodies} zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{100000}{\xg} und \SI{15}{\celsius}
+ulrazentrifugiert um lediglich lösliche Proteine im Überstand zu halten und Membranfragmente zu präzipitieren.
+
+Die mit \ce{Ni2+} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \ce{ddH20} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende
+\ce{Ni2+} von der Säule zu eluieren und die Bildung von amorphem Nickel bei der nachfolgenden Benutzung der Puffer mit reduzierend wirksamen \acs{DTT}
+zu minimieren. 
+
+Die Säule wurde mit Waschpuffer äquilibriert und das Zelllysat mit einer Flussrate von \SI{1,5}{\milli\liter\per\minute} auf die Säule geladen. Im Anschluss
+Unspezifisch bindende Proteine wurde mit \SI{20}{\CV} Waschpuffer + \SI{50}{\milli\Molar} Imidazol von der Säule gelöst. Die Elution der \acs{PPDK} erfolgte dann mit je \SI{10}{\CV} Waschpuffer + \SI{150}{\milli\Molar}, \SI{200}{\milli\Molar} und \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Es wurden Fraktionen 
+mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} gesammelt und ggf. vereinigt. Zur Detektion der Proteinfraktionen wurde die Absorption bei \SI{280}{\nano\meter} verfolgt.
+
+Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt und neu mit \ce{Ni2+} beladen.
+
+
+\subsection{Konzentrierung}
+\label{sec:konzentrierung}
+
+\subsection{Entsalzung}
+\label{sec:entsalzung}
+
 \section{Analytische Methoden}
 \label{sec:analytische_methoden}
 
+\subsection{Differentielle Zentrifugation}
+\label{sec:differentielle_zentrifugation}
+
+\subsection{Größenauschlusschromatographie}
+\label{sec:groessenausschluss}
+
+\subsection{SDS-\acl{PAGE}}
+\label{sec:sds_page}
+
+\subsection{Konzentrationsbestimmung von Proteinen}
+\label{sec:konzentrationsbestimmung_proteine}
+
+\subsection{\acl{CD}-Spektroskopie}
+\label{sec:cd_spektroskopie}
+
 \section{Bioinformatische Methoden}
 \label{sec:bioinformatische_methoden}

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