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29 KiB
TeX
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\chapter{Material und Methoden}
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\section{Material}
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\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
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\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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\begin{singlespace}
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\begin{longtable}{p{0.5\textwidth} p{0.45\textwidth}}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Analysen-/Präzisionswaagen & Sartorius, Göttingen\\
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Autoklav & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
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Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
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\acs{CD}-Spektrometer J-715 & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
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Chromatographiesystem \newline ÄKTAprime plus & GE Healthcare, Uppsala, SE \\
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\acs{DNA}-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
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Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\
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Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R & Eppendorf, Hamburg\\
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Image Analyzer LAS-4000 mini & Fujifilm, Düsseldorf\\
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Magnetrührer MR 3000/3001 & Heidolph, Schwabach\\
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Microplate Reader Infinite 200 PRO & Tecan, Crailsheim \\
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Mikrozentrifuge Minispin & Eppendorf, Hamburg\\
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Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage & Millipore, Schwalbach\\
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Minishaker MS 2 & IKA, Staufen\\
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Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwalbach\\
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Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\
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Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Zellaufschlusssystem 'One-Shot' & Constant Systems, Daventry, UK\\
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\bottomrule
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\end{longtable}
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\subsection{Verbrauchsmaterialien}
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\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\
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Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25 & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
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Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
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\acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter} & GE-Healthcare, Freiburg\\
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Mikrotiterplatten & Hartenstein, Würzburg\\
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Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
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Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
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Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One,\newline Frickenhausen\\
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Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter}) & Merck, Bruchsal\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\subsection{Chemikalien}
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\label{sec:chemikalien}
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\begin{longtable}{p{0.35\textwidth} r p{0.36\textwidth}}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
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Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
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\ac{CBB} & 6104-58-1 & \\
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Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
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\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
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\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
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Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Hefeextrakt & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Imidazol & 288-32-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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\acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\
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Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\
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Magnesiumsulfat-Heptahydrat & 10034-99-8 & \\
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Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\
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Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\
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Natriumhydrogencarbonat & 144-55-8 & VWR, Darmstadt\\
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Nickelsulfat & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
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Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
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\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
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|
Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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|
Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
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|
Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
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|
\acf{Tris} & 77-86-1 & VWR, Darmstadt\\
|
|
\bottomrule
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|
\end{longtable}
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\subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren}
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\label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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|
\acs{BSA}-Standard (\SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter}) & Qiagen, Hilden\\
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\acs{DNA} \SI{1}{\kb}/\SI{100}{\bp} Ladder & New England Biolabs, Frankfurt\\
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|
PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained) & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\
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|
\bottomrule
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|
\end{tabularx}
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\subsection{Antikörper}
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\label{sec:antikoerper}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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|
\midrule
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|
Anti-His-\acs{HRP} & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
|
\bottomrule
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|
\end{tabularx}
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\subsection{Kommerzielle Kits}
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\label{sec:komerzielle_kits}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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|
illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
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|
QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\
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|
Roti-Quant$^\text{\textregistered}$ (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
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|
\bottomrule
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|
\end{tabularx}
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\subsection{Restriktionsenzyme}
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\label{sec:restriktionsenzyme}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
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|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Erkennungssequenz (5'~--~3')}\\
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\midrule
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|
\textit{BamH}I & New England Biolabs, Frankfurt & CA/TATG\\
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|
\textit{Nde}I & New England Biolabs, Frankfurt & G/GATCC\\
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|
\bottomrule
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|
\end{tabularx}
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\subsection{Bakterienstämme}
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\label{sec:batrienstaemme}
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\begin{samepage}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
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|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\
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|
\midrule
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|
BL21 (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm gal} \textlambda(DE3)\\
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|
BL21 Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm} Tet$^\text{r}$ gal \textlambda(DE3) \textit{endA} Hte\\
|
|
XL1-Blue & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} \textit{recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac} [F' \textit{proAB lacI$^\text{q}$ Z\textDelta M15} Tn\textit{10} (Tet$^\text{r}$)]\\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabularx}
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|
\end{samepage}
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\subsection{Synthetische Oligonukleotide}
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\label{sec:synthetische_oligonukleotide}
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\begin{samepage}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.3\textwidth}X}
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|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Sequenz (5'~--~3')} \\
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|
\midrule
|
|
pETEV-16b-PPDK-for & \texttt{CATGAAAACCTGTATTTTCAGGGACATATG \newline ACCGCTAAAAAACGCGTGTT}\\
|
|
pETEV-16b-PPDK-rev & \texttt{TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAG \newline TTAAACAATCACTTGGGCGG}\\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabularx}
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|
\end{samepage}
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\subsection{Plasmide}
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\label{sec:plasmide}
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\begin{samepage}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
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\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Marker}\\
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|
\midrule
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|
pET-16b & Novagen, Darmstadt & Ampicillinresistenz\\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabularx}
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\end{samepage}
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\subsection{Kulturmedien}
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\label{sec:kulturmedien}
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\begin{samepage}
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\begin{description}
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|
\item[\acs{2YT} (pH 7,5)] \hfill \\
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\SI{1,6}{\percent} (w/v) Pepton\\
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|
\SI{1}{\percent} (w/v) Hefeextrakt\\
|
|
\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid
|
|
\end{description}
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\end{samepage}
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\subsection{Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese}
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\label{sec:puffer_agarose_gelelektrophorese}
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\begin{samepage}
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\begin{description}
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|
\item[\ac{TAE}-Puffer (50x)] \hfill \\
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|
\SI{100}{\milli\liter} \acs{EDTA} (\SI{0,5}{\Molar}, pH 8)\\
|
|
\SI{57,1}{\milli\liter} Essigsäure\\
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|
\SI{242}{\gram} Tris\\
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|
\SI{1}[ad~]{\liter} \ce{ddH2O}
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|
\end{description}
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\end{samepage}
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\subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
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\label{sec:puffer_zellauschluss}
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\begin{samepage}
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\begin{description}
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|
\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
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|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
|
|
\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
|
\SI{10}{\milli\Molar} Imidazol\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
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\end{samepage}
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\subsection{Puffer und Lösungen für die Reinigung}
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\label{sec:reinigungspuffer}
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\begin{samepage}
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\begin{description}
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|
\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
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|
\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
|
|
\end{description}
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\end{samepage}
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\begin{samepage}
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\begin{description}
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|
\item[Waschpuffer] \hfill \\
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|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
|
|
\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
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|
\end{samepage}
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\begin{samepage}
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\begin{description}
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|
\item[Elutionspuffer] \hfill \\
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|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
|
|
\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
|
\SI{500}{\milli\Molar} Imidazol\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
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|
\end{samepage}
|
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|
\begin{samepage}
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\begin{description}
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|
\item[Lagerungspuffer] \hfill \\
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|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 8\\
|
|
\SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
|
|
\SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{EDTA}\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
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|
\end{samepage}
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\end{singlespace}
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\section{Molekularbiologische Methoden}
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\label{sec:methoden}
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\subsection{Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren}
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\label{sec:konzentrationsbestimmung_nukleinsaeuren}
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Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
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bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
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durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
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\begin{align}
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\text{OD}_{260} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
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\label{eq:dna_konz}
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\end{align}
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\SI{2}{\micro\liter} der Probe und des verwendeten Puffers werden hierbei auf einer NanoQuant-
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Platte im Mikroplatten-Lesegerät vermessen und die Konzentration aus der Differenz
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aus Probe und Puffer gemäß Gleichung \ref{eq:dna_konz} berechnet.
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\subsection{Isolierung von Plasmid-\acs{DNA}}
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\label{sec:isolierung_plasmid_dna}
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Die Isolierung von Plasmiden erfolgte aus \SI{5}{\milli\liter} Übernachtkulturen mit Hilfe des
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"`QIAprep$^\text{\textregistered}$ Spin Miniprep"'-Kits nach Herstellerangaben.
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Die isolierte Plasmid-\acs{DNA} wurde in \SI{10}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl} pH 8,5 bei bei
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\SI{-20}{\celsius} gelagert.
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\subsection{Restriktionsverdau von \acs{DNA}}
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\label{sec:restriktionsverdau_dna}
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\begin{samepage}
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Im Zuge der Klonierung wurde der Zielvektor pET-16b über die beiden Restriktionsenzyme \textit{BamH}I und \textit{Nde}I linearisiert.
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Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}{\celsius} über einen Zeitraum von \SI{2}{\hour}.
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\begin{description}
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\item[Ansatz Restriktionsverdau] \hfill \\
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\SI{4}{\micro\gram} Vektor-DNA\\
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\SI{3}{\micro\liter} NEBuffer 4 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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|
\SI{10}{\Unit} \textit{BamH}I \\
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|
\SI{10}{\Unit} \textit{Nde}I\\
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ad \SI{25}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
|
|
\end{description}
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\end{samepage}
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\subsection{Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von \acs{DNA}}
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\label{sec:agarose_gelelektrophorese}
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Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe wurde die Agarose"=Gelelektrophorese eingesetzt.
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Hierbei wandern die durch das Phosphatrückrat negativ geladenen Nukleinsäuren im elektrischen Feld durch ein
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Agarose"=Gel zur Anode. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist hierbei abhängig von der Größe, es resultiert
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eine entsprechende Auftrennung im Gel.
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Eine \SI{1}{\percent}ige~(w/v) Lösung von Agarose in \ac{TAE}-Puffer wurde etwa \SI{1}{\centi\meter} hoch auf den
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|
Gelträger der Elektrophoresekammer gefüllt, mit Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von \SI{0,5}{\micro\gram\per\milli\liter} versetzt
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|
und durch Schwenken homogen verteilt.
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|
Das erstarrte Gel wurde anschließend mit \acs{TAE}-Puffer überschichtet und mit \SI{5}{\micro\liter} Marker, sowie den zu analysierenden
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|
Proben beladen. Die Laufzeit betrug bei \SI{150}{\volt} \SIrange{30}{45}{\minute}.
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Die Dokumentation der \acs{DNA}"=Banden erfolgte fotografisch im \acs{UV}"=Transilluminator.
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|
\subsection{Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen}
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|
\label{sec:extraktion_dna_agarosegel}
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Die Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen erfolgte mit dem "`illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"'
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|
nach Herstellerangaben.
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\subsection{\acl{PCR}}
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\label{sec:pcr}
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Mit Hilfe der \ac{PCR} konnen Nukleinsäurefragmente gezielt
|
|
vervielfältigt werden. Die Spezifität der Reaktion ist hierbei durch die Auswahl der
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|
eingesetzten Primer gegeben.
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|
Eine PCR gliedert sich grundsätzlich in drei aufeinanderfolgende Phasen: Während
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der Denaturierung bei \SI{95}{\celsius} wird der Doppelstrang in die beiden Einzelstränge
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aufgespalten. Das Annealing bei \SIrange{50}{60}{\celsius} führt zur Anlagerung der Primer an die
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komplementären Sequenzabschnitte der Einzelstränge des Templates. Die exakte
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Temperatur ist hierbei von den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer abhängig.
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Während der Elongationsphase erfolgt die Synthese neuer Komplementärstränge
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ausgehend von den Primern durch eine DNA-Polymerase.
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|
Durch eine mehrfache Wiederholung kann die Ziel-DNA in kurzer Zeit exponentiell
|
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vervielfacht werden.
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\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
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\label{sec:inserts_slic}
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\begin{samepage}
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Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl. \ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
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Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz.
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\begin{description}
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\item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\
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|
\SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
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|
\SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
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\SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
|
|
\SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
|
|
\SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (\SI{1}{\Unit\per\micro\liter}, peqlab, Erlangen) \\
|
|
\SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
|
|
\SI{50}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
|
|
\end{description}
|
|
\end{samepage}
|
|
Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
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|
der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
|
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des zum \acs{PPDK}-kodierenden Bereich homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
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|
zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.
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|
|
|
\begin{table}[hbt]
|
|
\centering
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|
\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
|
|
\begin{tabular}{ccc}
|
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\toprule
|
|
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit [\si{\minute}]} & \textbf{Zyklen}\\
|
|
\midrule
|
|
95 & 5 & \multirow{4}{*}{10} \\
|
|
95 & 1 & \\
|
|
46 & 1 & \\
|
|
72 & 5 & \\
|
|
\midrule
|
|
95 & 1 & \multirow{3}{*}{20} \\
|
|
65 & 1 & \\
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|
72 & 5 & \\
|
|
\midrule
|
|
95 & 10 & 1 \\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabular}
|
|
\label{tab:slic_cycler}
|
|
\end{table}
|
|
|
|
\subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}}
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|
Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden zufällig ausgewählte Kolonien mittels einer Kolonie-PCR
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untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \ce{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
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vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht
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und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \acs{2YT}-Medium verwendet.
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\begin{description}
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\item[Kolonie-PCR-Ansatz] \hfill \\
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\SI{1}{\micro\liter} T7-Pro-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
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\SI{1}{\micro\liter} T7-Ter-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
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\SI{2,5}{\micro\liter} 10x~Thermo-Pol-Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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\SI{0,5}{\Unit} Taq-Polymerase (\SI{5}{\Unit\per\micro\liter}, New England Biolabs, Frankfurt)\\
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\SI{0,25}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar})\\
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\SI{25}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
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\end{description}
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Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt.
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\begin{table}[hbt]
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\centering
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\caption[Cyclerprogramm Kolonie-\acs{PCR}]{Cyclerprogramm für die Kolonie-\acs{PCR}}
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\begin{tabular}{ccc}
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\toprule
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\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit} & \textbf{Zyklen}\\
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\midrule
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95 & \SI{5}{\minute} & \multirow{4}{*}{30} \\
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95 & \SI{30}{\second} & \\
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48 & \SI{30}{\second} & \\
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72 & \SI{40}[\SI{2}{\minute}~]{\second} & \\
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\midrule
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72 & \SI{5}{\minute} & 1 \\
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\bottomrule
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\end{tabular}
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\label{tab:kolonie_pcr_cycler}
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\end{table}
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\subsection{\acf{SLIC}}
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\label{sec:slic}
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Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren,
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welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
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Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl. \ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor
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wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl. \ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die
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für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
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Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
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\begin{description}
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\item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
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x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~≡~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
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\SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
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\SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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\SI{1}{\Unit} T4-\acs{DNA}-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
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\end{description}
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Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von
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\SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde
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durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.
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In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert-\acs{DNA} (\SI{2691}{\bp}) im zweifachen molaren Verhältnis eingesetzt:
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\begin{description}
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\item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
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x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} ≡~\SI{150}{\nano\gram}\\
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y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} ≡~\SI{141}{\nano\gram}\\
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\SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
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\end{description}
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Der Ansatz wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{37}{\celsius} inkubiert. \SI{5}{\micro\liter} der Ansätze wurden für die
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Transformation von \acs{E. coli} XL1-Blue eingesetzt.
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\section{Mikrobiologische Methoden}
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\label{sec:mikrobiologische_methoden}
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\subsection{Transformation in \acs{E. coli}}
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\label{sec:transformation}
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Die Transformation erfolgte mittels einer Hitzeschocktransformation. \SI{50}{\micro\liter} chemisch kompetenter Zellen wurden auf
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Eis aufgetaut und mit \SI{1}{\micro\liter} Plasmid-\acs{DNA} versetzt. Anschließend wurden die Zellen für \SI{15}{\minute} auf Eis inkubiert.
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Es folgte ein Hitzeschock bei \SI{42}{\celsius} von \SI{90}{\second} Dauer. Nach einer erneuten Inkubation auf Eis
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für \SI{2}{\minute} und der Zugabe von \SI{400}{\micro\liter} \acs{2YT}-Medium wurden die Zellen für \SI{1}{\hour} unter leichtem
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Schütteln bei \SI{37}{\celsius} im Thermoblock inkubiert.
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Der \SI{150}{\micro\liter} des Ansatzes wurde anschließend auf \acs{2YT}"=Agarplatten mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin
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ausgestrichen und über Nacht bei \SI{37}{\celsius} im Brutschrank inkubiert.
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\subsection{Stammhaltung}
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\label{sec:stammhaltung}
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Die Stammhaltung erfolgte in \SI{20}{\percent}igen Glycerinkulturen bei \SI{-80}{\celsius}. Hierfür wurden \SI{800}{\micro\liter} einer Übernachtkultur
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(vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) mit \SI{200}{\micro\liter} sterilem Glycerin versetzt und eingefroren.
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\subsection{Heterologe Expression in \acs{E. coli}}
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\label{sec:expression_ecoli}
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Die Transformation kompetenter Zellen erfolgte wie in \ref{sec:transformation} beschrieben. Die Anzucht erfolgte in \acs{2YT}-Medium
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mit \SI{100}{\micro\gram\per\milli\liter} Ampicillin.
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\subsubsection{Expressionsstudien}
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\label{sec:expression_ecoli_studien}
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Die optimalen Bedingungen zur heterologen Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} wurden durch Expressionsstudien evaluiert, bei denen
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unterschiedliche Konzentrationen von \ac{IPTG} zur Induktion verwendet wurden. Es kamen hierbei die \acs{E. coli}"=Stämme BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3)
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zum Einsatz.
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Von den Agarplatten (vgl. \ref{sec:transformation}) wurden Vorkulturen in \SI{5}{\milli\liter} Volumen im Kulturröhrchen angesetzt. Die Vorkulturen wurden über Nacht bei
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\SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der Hauptkulturen eingesetzt.
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Hierfür wurden \SI{250}{\milli\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{100}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{1}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
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und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer
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\acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar}, \SI{0,5}{\milli\Molar} und \SI{1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
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Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Vier Stunden nach der Induktion bzw. am nächsten Tag
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wurden die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet.
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\subsubsection{Präparative Expression}
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\label{sec:praeparative_expression}
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Die heterologe Expression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} erfolgte mit den in den Expressionsstudien als besonders geeignet explorierten Bedingungen.
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Als Expressionsstamm kam \acs{E. coli} BL21 (DE3) zum Einsatz.
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Von den Agarplatten wurden Vorkulturen in \SI{100}{\milli\liter} Volumen in unschikanierten \SI{250}{\milli\liter}-Kolben angesetzt. Die
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Vorkulturen wurden über Nacht bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schütler inkubiert und am folgenden Tag zur Inokulation der
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Hauptkulturen eingesetzt.
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Hierfür wurden \SI{2}{\liter}-Kolben mit Schikane und \SI{500}{\milli\liter} Kulturmedium mit \SI{5}{\milli\liter} der Vorkultur inokuliert
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und bis zur Induktion bei \SI{37}{\celsius} und \SI{180}{\rpm} im Schüttler inkubiert. Die Induktion erfolgte beim Erreichen einer
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\acs{OD}$_\text{600}$ von \numrange{0,6}{0,8} mit \SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{IPTG}.
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Das weitere Wachstum nach der Induktion erfolgte bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius}. Am nächsten Tag wurden
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die Zellen durch Zentrifugation bei \SI{7000}{\xg} für \SI{10}{\minute} und \SI{4}{\celsius} geerntet. Die Zellpellets wurden in \SI{4}{\gram}-Aliquots
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in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für weitere Versuche bei \SI{-80}{\celsius} gelagert.
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\section{Präparative Methoden}
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\label{sec:praeparative_methoden}
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\subsection{Zellaufschluss}
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\label{sec:zellaufschluss}
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Ein Aliquot eingefrorener Zellen (siehe \ref{sec:praeparative_expression}) wurde bei Raumtemperatur mit \SI{20}{\milli\liter} Aufschlusspuffer,
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sowie einer Spatelspitze DNAse I (Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt und durch Vortexen resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte durch Hochdruckdispersion
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bei einem Druck von \SI{1,35}{\kilo\bar} und einer Temperatur von \SI{15}{\celsius}.
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\subsection{Proteinaufreinigung durch Affinitätschromatographie}
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\label{sec:affinitaetschromatographie}
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Proteine, die mit einem Poly-Histidin-Tag markiert sind, lassen sich über eine \acf{IMAC} aus
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einem Proteingemisch isolieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden HisTrap$^\text{\textregistered}$ HP-Säulen mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter}
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eingesetzt. Als Säulenmaterial dient quervernetzte Agarose an welche \acf{IDA} immobilisiert ist. \ce{Ni2+}-Ionen werden von \acs{IDA} dreifach koordinativ
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komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion Poly-Histidin-markierter Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni2+}-Ionen zur
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Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über die Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu
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Histidin in der Lage ist, dieses kompetitiv aus der Bindung mit \ce{Ni2+} zu verdrängen.
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Die wie in \ref{sec:zellaufschluss} beschrieben aufgeschlossenen Zellen wurden zunächst bei \SI{10000}{\xg} und \SI{15}{\celsius} für \SI{30}{\minute}
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zentrifugiert um Zelltrümmer und \textit{Inclusion-Bodies} zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{100000}{\xg} und \SI{15}{\celsius}
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ulrazentrifugiert um lediglich lösliche Proteine im Überstand zu halten und Membranfragmente zu präzipitieren.
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Die mit \ce{Ni2+} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \ce{ddH20} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende
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\ce{Ni2+} von der Säule zu eluieren und die Bildung von amorphem Nickel bei der nachfolgenden Benutzung der Puffer mit reduzierend wirksamen \acs{DTT}
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zu minimieren.
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Die Säule wurde mit Waschpuffer äquilibriert und das Zelllysat mit einer Flussrate von \SI{1,5}{\milli\liter\per\minute} auf die Säule geladen. Im Anschluss
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Unspezifisch bindende Proteine wurde mit \SI{20}{\CV} Waschpuffer + \SI{50}{\milli\Molar} Imidazol von der Säule gelöst. Die Elution der \acs{PPDK} erfolgte dann mit je \SI{10}{\CV} Waschpuffer + \SI{150}{\milli\Molar}, \SI{200}{\milli\Molar} und \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol. Es wurden Fraktionen
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mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} gesammelt und ggf. vereinigt. Zur Detektion der Proteinfraktionen wurde die Absorption bei \SI{280}{\nano\meter} verfolgt.
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Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt und neu mit \ce{Ni2+} beladen.
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\subsection{Konzentrierung}
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\label{sec:konzentrierung}
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\subsection{Entsalzung}
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\label{sec:entsalzung}
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\section{Analytische Methoden}
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\label{sec:analytische_methoden}
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\subsection{Differentielle Zentrifugation}
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\label{sec:differentielle_zentrifugation}
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\subsection{Größenauschlusschromatographie}
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\label{sec:groessenausschluss}
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\subsection{SDS-\acl{PAGE}}
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\label{sec:sds_page}
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\subsection{Konzentrationsbestimmung von Proteinen}
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\label{sec:konzentrationsbestimmung_proteine}
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\subsection{\acl{CD}-Spektroskopie}
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\label{sec:cd_spektroskopie}
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\section{Bioinformatische Methoden}
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\label{sec:bioinformatische_methoden}
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