Fortführung Material und Methoden
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@ -5,7 +5,7 @@
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\acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
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\acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
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\acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
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\acro{CBB}[CBB G-250]{Coomassie-Brilliant-Blau G-250}
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\acro{CBB}[CBB-G250]{Coomassie-Brilliant-Blau G-250}
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\acro{CD}{Circulardichroismus}
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\acro{CV}{Säulenvolumen, engl. \textit{column volume}}
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\acro{dCTP}{Desoxycytidintriphosphat}
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@ -20,16 +20,20 @@
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\acro{IDA}{Iminodiessigsäure}
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\acro{IMAC}{Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie}
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\acro{IPTG}{Isopropyl-\textbeta-D-thiogalactopyranosid}
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\acro{NaN3}[\ce{NaN3}]{Natriumazid}
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\acro{OD}{Optische Dichte}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.)}
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\acro{PAGE}{Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion}
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\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
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\acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
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\acro{rcf}{\textit{relative centrifugal force} (engl.)}
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\acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat}
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\acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung}
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\acro{SOPMA}{\textit{Self-optimized prediction method} (engl.)}
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\acro{TAE}{Tris-Acetat-EDTA}
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\acro{TBS}{\textit{Tris-buffered saline} (engl.)}
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\acro{TBT}{\textit{Tris-buffered Tween} (engl.)}
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\acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
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\acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
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\acro{UV}{Ultraviolett}
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252
inc/material.tex
252
inc/material.tex
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@ -42,7 +42,8 @@
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Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\
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Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25 & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
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Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
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\acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter} & GE-Healthcare, Freiburg\\
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Filter für Ultrazentrifugation "`Amicon Ultra"' & Millipore, Schwalbach\\
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\acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter} & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
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Mikrotiterplatten & Hartenstein, Würzburg\\
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Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
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Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
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@ -120,7 +121,7 @@
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\midrule
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illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Uppsala, SE\\
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QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\
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Roti-Quant$^\text{\textregistered}$ (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Roti$^\text{\textregistered}$-Quant (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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@ -198,10 +199,60 @@
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\SI{100}{\milli\liter} \acs{EDTA} (\SI{0,5}{\Molar}, pH 8)\\
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\SI{57,1}{\milli\liter} Essigsäure\\
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\SI{242}{\gram} Tris\\
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\SI{1}[ad~]{\liter} \ce{ddH2O}
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\SI{1}[ad~]{\liter} \acs{ddH2O}
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||||
\end{description}
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||||
\end{samepage}
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\subsection{Puffer für die \acs{SDS}-\acs{PAGE}}
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\label{sec:puffer_sds_page}
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\begin{description}
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\item[\ac{AA/BAA} (Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30)] \hfill \\
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\SI{30}{\percent} Acrylamid\\
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\SI{0,8}{\percent} Bisacrylamid
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||||
\item[Laufpuffer (10\texttimes)] \hfill \\
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||||
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}\\
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||||
\SI{1,92}{\Molar} Glycin\\
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||||
\SI{0,5}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
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||||
\item[Sammelgelpuffer, pH 6,7 (5\texttimes)] \hfill \\
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||||
\SI{0,25}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
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||||
\SI{0,5}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
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||||
\item[Trenngelpuffer, pH 8,9 (2,5\texttimes)] \hfill \\
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||||
\SI{1,875}{\Molar} \acs{Tris}/\ce{H3PO4}\\
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||||
\SI{0,25}{\percent} (w/v) \acs{SDS}
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||||
\item[Probenpuffer (4\texttimes)] \hfill \\
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||||
\SI{30}{\milli\Molar} Borsäure\\
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||||
\SI{30}{\milli\Molar} \acs{Tris}\\
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||||
\SI{0,7}{\milli\Molar} \acs{EDTA}\\
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||||
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
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||||
\SI{50}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
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||||
\SI{6,7}{\percent} (w/v) \acs{SDS}\\
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||||
\SI{16,7}{\percent} (w/v) Saccharose\\
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||||
\SI{0,16}{\percent} (w/v) Bromphenolblau
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||||
\item[Färbelösung] \hfill \\
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||||
\SI{0,1}{\percent}~(w/v) \acs{CBB}\\
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||||
\SI{2}{\percent}~(w/v) Phosphorsäure\\
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||||
\SI{5}{\percent}~(w/w) Aluminiumsulfat\\
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||||
\SI{10}{\percent}~(v/v) Ethanol
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||||
\end{description}
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||||
\subsection{Puffer und Lösungen für den Westernblot}
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\label{sec:puffer_westernblot}
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||||
\begin{description}
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||||
\item[Transferpuffer]\hfill \\
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||||
\SI{25}{\milli\Molar} Tris\\
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\SI{190}{\milli\Molar} Glycin\\
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||||
\SI{10}{\percent} (v/v) Ethanol
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||||
\item[TBS pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
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||||
\SI{10}{\milli\Molar} Tris/\ce{HCl}\\
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\SI{150}{\milli\Molar} Natriumchlorid
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||||
\item[TBT pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
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||||
\SI{20}{\milli\Molar} Tris\\
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\SI{500}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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||||
\SI{0,05}{\percent} (v/v) Polysorbat 20
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||||
\item[Caseinlösung pH 7,5 - 8,0] \hfill \\
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||||
\SI{1}{\percent} (w/v) Casein in TBS\\
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\SI{2}{\milli\liter} \SI{2}{\Molar} \ce{NaOH} je \SI{500}{\milli\liter}
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\end{description}
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\subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
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\label{sec:puffer_zellauschluss}
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@ -263,6 +314,14 @@
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\end{description}
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||||
\end{samepage}
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||||
\subsection{Puffer für die \acs{CD}-Spektroskopie}
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\label{sec:puffer_cd_spektroskopie}
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||||
\begin{description}
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||||
\item[CD-Puffer] \hfill \\
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||||
\SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat pH 7,9\\
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||||
\SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat
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\end{description}
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\end{singlespace}
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\section{Molekularbiologische Methoden}
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\label{sec:methoden}
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@ -299,7 +358,7 @@ Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}
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\SI{3}{\micro\liter} NEBuffer 4 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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\SI{10}{\Unit} \textit{BamH}I \\
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\SI{10}{\Unit} \textit{Nde}I\\
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||||
ad \SI{25}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
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ad \SI{25}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
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||||
\end{description}
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\end{samepage}
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@ -352,7 +411,7 @@ Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleot
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\SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
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||||
\SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (\SI{1}{\Unit\per\micro\liter}, peqlab, Erlangen) \\
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||||
\SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
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||||
\SI{50}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
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||||
\SI{50}[ad~]{\micro\liter} \acs{ddH2O}
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\end{description}
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\end{samepage}
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Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
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@ -384,10 +443,10 @@ zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs
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\subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}}
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Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden zufällig ausgewählte Kolonien mittels einer Kolonie-PCR
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untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \ce{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
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untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \acs{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
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vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht
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und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \acs{2YT}-Medium verwendet.
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\begin{description}
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\item[Kolonie-PCR-Ansatz] \hfill \\
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\SI{1}{\micro\liter} T7-Pro-Primer (\SI{10}{\micro\Molar})\\
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@ -395,9 +454,9 @@ und anschließend zum Animpfen eines \SI{5}{\milli\liter} Kulturröhrchens mit \
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\SI{2,5}{\micro\liter} 10x~Thermo-Pol-Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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\SI{0,5}{\Unit} Taq-Polymerase (\SI{5}{\Unit\per\micro\liter}, New England Biolabs, Frankfurt)\\
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||||
\SI{0,25}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar})\\
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||||
\SI{25}[ad~]{\micro\liter} \ce{ddH2O}
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\SI{25}[ad~]{\micro\liter} \acs{ddH2O}
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||||
\end{description}
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Die Kolonie-\acs{PCR} wurde dann gemäß des in Tabelle \ref{tab:kolonie_pcr_cycler} dargelegten Programms durchgeführt.
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\begin{table}[hbt]
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@ -427,30 +486,30 @@ Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}
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wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl. \ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die
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für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
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Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
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\begin{description}
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\item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
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x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~≡~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
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||||
\SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
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||||
\SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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||||
\SI{1}{\Unit} T4-\acs{DNA}-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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||||
ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
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ad \SI{35}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
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\end{description}
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Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von
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\SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde
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durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.
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In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert-\acs{DNA} (\SI{2691}{\bp}) im zweifachen molaren Verhältnis eingesetzt:
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%
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\begin{description}
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\item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
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x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} ≡~\SI{150}{\nano\gram}\\
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y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} ≡~\SI{141}{\nano\gram}\\
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\SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{ddH2O}
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ad \SI{10}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
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\end{description}
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Der Ansatz wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{37}{\celsius} inkubiert. \SI{5}{\micro\liter} der Ansätze wurden für die
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Transformation von \acs{E. coli} XL1-Blue eingesetzt.
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@ -533,7 +592,7 @@ Die wie in \ref{sec:zellaufschluss} beschrieben aufgeschlossenen Zellen wurden z
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zentrifugiert um Zelltrümmer und \textit{Inclusion-Bodies} zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{100000}{\xg} und \SI{15}{\celsius}
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ulrazentrifugiert um lediglich lösliche Proteine im Überstand zu halten und Membranfragmente zu präzipitieren.
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Die mit \ce{Ni2+} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \ce{ddH20} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende
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||||
Die mit \ce{Ni2+} beladene Säule wurde zunächst mit \SI{5}{\CV} \acs{ddH2O} und \SI{20}{\CV} Waschpuffer \emph{ohne} \acs{DTT} gewaschen, um schwach bindende
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||||
\ce{Ni2+} von der Säule zu eluieren und die Bildung von amorphem Nickel bei der nachfolgenden Benutzung der Puffer mit reduzierend wirksamen \acs{DTT}
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zu minimieren.
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@ -543,12 +602,28 @@ mit einem Volumen von \SI{5}{\milli\liter} gesammelt und ggf. vereinigt. Zur Det
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Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt und neu mit \ce{Ni2+} beladen.
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\subsection{Konzentrierung}
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\subsection{Konzentrierung von Proteinlösungen}
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\label{sec:konzentrierung}
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Proteinlösungen wurden durch zentrifugale Ultrafiltration bei \SI{20}{\celsius} und \SI{5000}{\xg} aufkonzentriert. Hierbei kamen Konzentratoren mit einer Ausschlussgröße
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von \SI{30}{\kilo\dalton} zu Einsatz.
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\subsection{Entsalzung}
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||||
\subsection{Entsalzung von Proteinlösungen}
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\label{sec:entsalzung}
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||||
Nach der Reinigung wurden Fraktionen, welche die \acs{PPDK} enthielten mittels Ultrafiltration (vgl. \ref{sec:konzentrierung}) auf ein Volumen
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von etwa \SI{2,5}{\milli\liter} eingeengt. Zur Umpufferung des Konzentrats in Lagerungspuffer kam eine PD-10-Säule zum Einsatz. Es handelt sich
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hierbei um eine Größenauschlusschromatographie-Säule, bei welcher die Proteinanteile der Lösung eine wesentlich geringere Retentionszeit aufweisen,
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als die gelösten Salzionen und somit mit einem geringeren Volumen von der Säule eluieren.
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Die Säule wurde mit \SI{25}{\milli\liter} Lagerungspuffer äquilibriert und anschließend mit der konzentrierten Probe beladen. Anschließend wurde die
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Differenz des Probenvolumens zu \SI{2,5}{\milli\liter} durch Lagerungspuffer ausgeglichen. Die Elution erfolgte mit \SI{3,5}{\milli\liter}
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||||
Lagerungspuffer. Die entsalzten Proben wurden erneut aufkonzentriert (vgl. \ref{sec:konzentrierung}).
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\subsection{Lagerung von PPDK-Konzentraten}
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\label{sec:lagerung}
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||||
Die kurzfristige Lagerung (max \SI{24}{\hour}) entsalzter \acs{PPDK}-Konzentrate (vgl. \ref{sec:entsalzung}) erfolgte nach Zugabe von \SI{1}{\percent}iger
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||||
\ac{NaN3}-Lösung im Verhältnis 1:1000 bei Raumtemperatur.
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||||
Langfristig wurden \acs{PPDK}-Lösungen nach Zugabe von \SI{20}{\percent}~(w/v) Glycerin bei \SI{-20}{\celsius} gelagert.
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||||
\section{Analytische Methoden}
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\label{sec:analytische_methoden}
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@ -556,17 +631,156 @@ Nach Abschluss der Reinigung wurde die Säule nach Herstellerangaben gereinigt u
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|||
\subsection{Differentielle Zentrifugation}
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\label{sec:differentielle_zentrifugation}
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Nach dem Zellaufschluss (vgl. \ref{sec:zellaufschluss}) wurde eine Probe von \SI{10}{\micro\liter} aus dem Homogenisat als Kontrolle entnommen.
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||||
Anschließend wurde das Homogenisat bei \SI{2000}{\xg} für \SI{15}{\minute} bei \SI{15}{\celsius} zentrifugiert. Das resultierende Pellet
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||||
wurde im gleichen Volumen Aufschlusspuffer unter Zusatz von \SI{0,1}{\percent} (w/v) \acs{SDS} bei Raumtemperatur und unter Rühren rückgelöst.
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||||
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||||
Es wurden jeweils vom Überstand, als auch vom resuspendierten Pellet weitere Proben von \SI{10}{\micro\liter} Volumen entnommen. Diese
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||||
wurden mit \SI{25}{\micro\liter} \acs{SDS}-Probenpuffer und \SI{65}{\micro\liter} \acs{ddH2O} versetzt. Alle weiteren Zentrifugationsschritte
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||||
erfolgten hierzu analog und sind in Tabelle \ref{tab:differentielle_zentrifugation} aufgeführt.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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||||
\caption{Zentrifugationsschritte der differentiellen Zentrifugation}
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||||
\begin{tabularx}{0.85\textwidth}{rcX}
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||||
\toprule
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\textbf{\acs{rcf} [\si{\xg}]} & \textbf{Dauer [\si{\minute}]} & \textbf{Sediment}\\
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\midrule
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2000 & 15 & Nicht aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer\\
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10000 & 30 & Aggregierte Proteine (\textit{Inclusion Bodies})\\
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||||
30000 & 30 & Große Membransysteme und assoziierte Proteine\\
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||||
100000 & 60 & Kleine Membransysteme und assoziierte Proteine\\
|
||||
\bottomrule
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||||
\end{tabularx}
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||||
\label{tab:differentielle_zentrifugation}
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||||
\end{table}
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||||
\subsection{Größenauschlusschromatographie}
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\label{sec:groessenausschluss}
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||||
Um die Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmen, wurde ein entsalztes Konzentrat (vgl. \ref{sec:entsalzung}) nach der Reinigung mittels
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||||
\acs{IMAC} (vgl. \ref{sec:affinitaetschromatographie}) einer analytischen Größenausschlusschromatographie unterzogen. Hierbei dient die Säulenmatrix
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||||
als Molekularsieb. Höhermolekulare Anteile eluieren hierbei schneller von der Säule, als niedermolekulare Anteile, da letztere in die Poren des
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||||
Säulenmaterials eindringen können.
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||||
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||||
In dieser Arbeit wurde eine Superdex 200 5/150 GL-Säule der Firma GE Healthcare (Uppsala, SE) mit einem Säulenvolumen von \SI{3}{\milli\liter}
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||||
eingesetzt.
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||||
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||||
Die Säule wurde mit \SI{5}{\CV} Lagerungspuffer äquilibriert und anschließend mit \SI{50}{\micro\liter} Probe in Lagerungspuffer beladen. Die
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||||
Detektion erfolgte durch Absorptionsmessung bei \SI{280}{\nano\meter}. Eluiert wurde mit \SI{2}{\CV} Lagerungspuffer bei einer Flussrate von
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||||
\SI{0,2}{\milli\liter\per\minute}.
|
||||
|
||||
\subsection{SDS-\acl{PAGE}}
|
||||
\label{sec:sds_page}
|
||||
Die Proteinproben wurden auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen und dort nach ihrer Masse aufgetrennt
|
||||
\citep{Laemmli1970}. Durch die Zugabe von \ac{SDS} werden die Proteine denaturiert und mit einr negativen
|
||||
Ladung maskiert, wodurch sie ein einheitliches Ladungs-Masse-Verhältnis aufweisen. Somit ist die Wanderungsgeschwindigkeit
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||||
im elektrischen Feld allein von der Proteinmasse abhängig. Vor dem Auftragen auf das Geld wurden alle Proben mit
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||||
4\texttimes-Probenpuffer versetzt. Expressionsproben wurden darüber hinaus für \SI{10}{\minute} auf \SI{95}{\celsius} erhitzt.
|
||||
Im Falle der Expressionsproben errechnete sich das Auftragungsvolumen für große bzw. kleine Gele nach Gleichung \eqref{eq:page_gross} und \eqref{eq:page_klein}.
|
||||
%
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||||
\begin{align}
|
||||
\label{eq:page_gross}
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||||
V_\text{groß}~[\si{\micro\liter}] &= \frac{15}{OD_{600}}\\
|
||||
\label{eq:page_klein}
|
||||
V_\text{klein}~[\si{\micro\liter}] &= \frac{15}{OD_{600}} \ \cdot 0,75
|
||||
\end{align}
|
||||
%
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Für die Elektrophorese wurden \SI{10}{\percent}ige Gele eingesetzt. Tabelle \ref{tab:pipettierschema_sds_page} zeigt exemplarisch eine
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Pipettierschema für drei kleine Gele (\SI{9}{\centi\meter}~\texttimes~\SI{10}{\centi\meter}).
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%
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
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\begin{tabular}{lll}
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\toprule
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& \textbf{Trenngel} & \textbf{Sammelgel}\\
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\midrule
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\acs{AA/BAA} 30 & \SI{10,9}{\milli\liter} & \SI{2}{\milli\liter}\\
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Trenn-/Sammelgelpuffer & \SI{9,2}{\milli\liter} & \SI{2,6}{\milli\liter}\\
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\acs{ddH2O} & \SI{3,6}{\milli\liter} & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
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\acs{TEMED} & \SI{16,5}{\micro\liter} & \SI{12,3}{\micro\liter}\\
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\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112}{\micro\liter} & \SI{129}{\micro\liter}\\
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\bottomrule
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\end{tabular}
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\label{tab:pipettierschema_sds_page}
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\end{table}
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%
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Um die Größenzuordnung der Proteinbanden zu gewährleisten, wurden die in \ref{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren} genannten
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Standards eingesetzt. Bei kleinen Gelen wurde nach dem Beladen für \SI{1}{\hour} eine Stromstärke von \SI{35}{\milli\ampere} je Gel angelegt.
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Größe Gele liefen über Nacht bei \SI{50}{\milli\ampere}.
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\subsection{Kolloidale Coomassie-Färbung}
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\label{sec:faerbung_coomassie}
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Mit der kolloidalen Coomassie-Färbung nach \citet{Kang2002} lassen sich Proteine in Polyacrylamid-Gelen bis zu einer Nachweisgrenze von etwa \SI{1}{\nano\gram}
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detektieren. Sie ist damit ähnlich sensitiv wie eine Silberfärbung.
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Die Gele wurden drei Mal für jeweils \SI{10}{\minute} in \acs{ddH2O} gewaschen und anschließend für mindestens \SI{2}{\hour} in der Färbelösung
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inkubiert. Nach dieser Zeit sind etwa \SI{90}{\percent} der maximalen Farbintensität erreicht \citep{Kang2002}. Eine Entfärbung des Hintergrunds kann durch mehrfaches
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Waschen mit \acs{ddH2O} erreicht werden.
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\subsection{Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen}
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\label{sec:westernblot}
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Über einen Westernblot können Proteine aus einem SDS-Gel elektrophoretisch auf einen Membran übertragen und dort fixiert werden.
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Über eine Immunfärbung kann anschließend eine Visualisierung der Proteine auf der Membran erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit kam das
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Semi-Dry-Blotverfahren, sowie eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von \SI{0,2}{\micro\meter} zum Einsatz.
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Bei Gelen, welche für einen Westernblot vorgesehen waren, kam ein gefärbter Proteingrößenstandard zum Einsatz. Das Gel wurde für etwa
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\SI{10}{\minute} in Transferpuffer inkubiert. Die benötigten Filterpapiere, sowie die Nitrozellulosemembran wurden ebenfalls kurz in
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Transferpuffer getränkt.
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Auf die Anode der Blotapparatur wurden zunächst drei Lagen Filterpapier, gefolgt von der Blotmembran, dem Gel sowie drei weiteren Lagen
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Filterpapier gegeben. Anschließend wurde die Apparatur geschlossen und für \SI{2}{\hour} eine Stromstärke von
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\SI{1}{\milli\ampere\per\square\centi\meter} angelegt.
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Nach Abschluss des Blotvorgangs wurde die Membran entnommen und \SI{1}{\hour} in einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in \acs{TBS} auf einem
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Rotationsschüttler inkubiert. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute} an.
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Die Membran wurde dann zusammen mit einer \SI{1}{\percent}igen Caseinlösung in TBS, welche den Anti-His-\acs{HRP}-Antikörper im Verhältnis 1:10000
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enthielt, in Folie eingeschweißt und über Nacht bei \SI{4}{\celsius} auf einem Taumelschüttler inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten
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zwei Waschschritte mit \acs{TBT} und einer mit \acs{TBS} zu jeweils \SI{10}{\minute}. Der gebundene Antikörper ließ sich über die gekoppelte
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Meerrettich-Peroxidase (\acs{HRP}) mit Hilfe eines Chemilumineszenzreagenzes nachweisen. die \acs{HRP} oxidiert in Anwesenheit von
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Wasserstoffperoxid das Substrat Luminol, wobei es zu einer Lichtemission kommt.
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Hierfür wurde die Membran in Folie eingeschlagen und mit dem Reagenz überschichtet. Für die Visualisierung wurde ein Lumineszenzdetektor
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(LAS 4000 mini, Fujifilm) eingesetzt.
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\subsection{Konzentrationsbestimmung von Proteinen}
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\label{sec:konzentrationsbestimmung_proteine}
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Die Konzentration von Proteinen wurde nach \citet{Bradford1976} bestimmt. Hierzu wurde in einer Mikrotiterplatte \SI{50}{\micro\liter} einer
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Verdünnung der zu vermessenden Proteinlösung mit \SI{200}{\micro\liter} Bradford-Reagenz aus dem Roti$^{\text{\textregistered}}$-Quant-Kit versetzt.
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Die Probe wurde für \SI{5}{\minute} bei Raumtemperatur inkubiert und die Absorption bei \SI{595}{\nano\meter} gemessen.
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Die Berechnung der Proteinkonzentration erfolgte anhand einer mit bovinem Serumalbumin \acs{BSA} erstellten Kalibriergeraden. Alle Messungen erfolgten in Dreifachbestimmung.
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\subsection{\acl{CD}-Spektroskopie}
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\label{sec:cd_spektroskopie}
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Bei der \ac{CD}-Spektroskopie wird die Wechselwirkung von optisch aktiven Substanzen mit zirkular polarisiertem Licht zu analytischen Zwecken
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ausgenutzt. Eine links- und eine rechtszirkulare Lichwelle überlagern sich hierbei zu linear polarisiertem Licht. Optisch aktive Substanzen
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weisen für die links- bzw. rechtszirkulare Komponente unterschiedliche Absorptionskoeffizienten \textepsilon$_\text{L}$ und \textepsilon$_\text{R}$
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auf, wobei letztlich ihre Differenz \textDelta\textepsilon~gemessen und als Elliptizität \texttheta~angegeben wird -- d sei die Schichtdicke und c
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die Konzentration \citep{Greenfield2007}:
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\begin{equation}
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\theta (\lambda) = \Delta\varepsilon \cdot c \cdot d
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\end{equation}
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Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen eingesetzt werden. Hierbei werden Spektren im Bereich von
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\SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n~\textrightarrow~\textpi$^*$ bzw.
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\textpi~\textrightarrow~\textpi$^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr
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empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{Greenfield2007}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration
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von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und
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Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.
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\subsection{Aktivitätsassay}
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\label{sec:aktivitaetsassay}
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\section{Bioinformatische Methoden}
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\label{sec:bioinformatische_methoden}
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\subsection{Analyse von \ac{CD}-Spektren}
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\label{sec:analyse_cd_spektren}
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\subsection{Erstellung von Homologiemodellen}
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\label{sec:erstellung_homologiemodell}
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\end{document}
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