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TeX
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\chapter{Material und Methoden}
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\section{Material}
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\subsection{Geräte und Hilfsmittel}
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\label{sec:geraete_hilfsmittel}
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\begin{singlespace}
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\begin{longtable}{p{0.5\textwidth} p{0.45\textwidth}}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Analysen-/Präzisionswaagen & Sartorius, Göttingen\\
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Autoklav & Thermo Fisher Scientific, Bonn\\
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Automatische Pipetten & Gilson, Bad Camberg\\
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\acs{CD}-Spektrometer J-715 & JASCO Corp., Gross-Umstadt\\
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Chromatographiesystem \newlineÄKTAprime plus & GE Healthcare, Freiburg \\
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DNA-Gelkammersystem PerfectBlue & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Elektroblotter PerfectBlue 'Semi-Dry' & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Gelsysteme für große Gele & Zentralwerkstatt, Uni Düsseldorf\\
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Inkubationsschüttler INNOVA 44R & New Brunswick, Nürtigen\\
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Kühlzentrifuge Avanti J-26 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Kühlzentrifuge Eppendorf 5810 R & Eppendorf, Hamburg\\
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Image Analyzer LAS-4000 mini & Fujifilm, Düsseldorf\\
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Magnetrührer MR 3000/3001 & Heidolph, Schwabach\\
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Microplate Reader Infinite 200 PRO & Tecan, Crailsheim \\
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Mikrozentrifuge Minispin & Eppendorf, Hamburg\\
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Milli-Q-gradient Wasserfilteranlage & Millipore, Schwalbach\\
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Minishaker MS 2 & IKA, Staufen\\
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Rotoren: JA-10, JA-25.50, Type 70.1 Ti & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Taumelschüttler Polymax 1040 & Heidolph, Schwalbach\\
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Thermomixer compact/comfort & Eppendorf, Hamburg\\
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Ultrazentrifuge Optima L-80 XP & Beckman Coulter, Krefeld\\
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Zellaufschlusssystem 'One-Shot' & Constant Systems, Daventry, UK\\
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\bottomrule
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\end{longtable}
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\subsection{Verbrauchsmaterialien}
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\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Chromatographiepapier 3MM Chr & Whatman, Maidstone, UK\\
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Entsalzungssäulen PD10/MidiTrap G-25 & GE Healthcare, Freiburg\\
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Falconröhrchen \SI{15}{\milli\liter} und \SI{50}{\milli\liter} & Orange Scientific,\newline Braine-l'Alleud, BE\\
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\acs{IMAC}-Säule HisTrap HP \SI{5}{\milli\liter} & GE-Healthcare, Freiburg\\
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Mikrotiterplatten & Hartenstein, Würzburg\\
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Petrischalen & Hartenstein, Würzburg\\
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Pipettenspitzen & Brand, Wertheim\\
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Reaktionsgefäße \SI{1,5}{\milli\liter} und \SI{2}{\milli\liter} & Greiner-Bio One,\newline Frickenhausen\\
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Spritzenvorsatzfilter (\SI{0,2}{\micro\meter}) & Merck, Bruchsal\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\subsection{Chemikalien}
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\label{sec:chemikalien}
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\begin{longtable}{p{0.33\textwidth} r p{0.38\textwidth}}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
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Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
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Coomassie Blue (CB250) & & \\
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Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
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\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
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\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
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Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Hefeextrakt & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Imidazol & 288-32-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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\acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\
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Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\
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Magnesiumsulfat-Heptahydrat & 10034-99-8 & \\
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Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\
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Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\
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Natriumhydrogencarbonat & 144-55-8 & VWR, Darmstadt\\
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Nickelsulfat & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
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Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
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\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
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Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
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\acf{Tris} & 77-86-1 & VWR, Darmstadt\\
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|
\bottomrule
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|
\end{longtable}
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\subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren}
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\label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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|
\acs{BSA}-Standard (\SI{2}{\milli\gram\per\milli\liter}) & Qiagen, Hilden\\
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\acs{DNA} \SI{1}{\kb}/\SI{100}{\bp} Ladder & New England Biolabs, Frankfurt\\
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|
PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained) & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\
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|
\bottomrule
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|
\end{tabularx}
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\subsection{Antikörper}
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\label{sec:antikoerper}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
|
|
\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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|
\midrule
|
|
Anti-His-\acs{HRP} & Carl Roth, Karlsruhe\\
|
|
\bottomrule
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|
\end{tabularx}
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\subsection{Kommerzielle Kits}
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\label{sec:komerzielle_kits}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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|
\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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|
illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Freiburg\\
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|
QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\
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Roti-Quant$^\text{\textregistered}$ (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
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|
\bottomrule
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|
\end{tabularx}
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\subsection{Restriktionsenzyme}
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\label{sec:restriktionsenzyme}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
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|
\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Erkennungssequenz (5'~--~3')}\\
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\midrule
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|
\textit{BamH}I & New England Biolabs, Frankfurt & CA/TATG\\
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|
\textit{Nde}I & New England Biolabs, Frankfurt & G/GATCC\\
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|
\bottomrule
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|
\end{tabularx}
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\subsection{Bakterienstämme}
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\label{sec:batrienstaemme}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.27\textwidth}X}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\
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\midrule
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BL21 (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm gal} \textlambda(DE3)\\
|
|
BL21 Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm} Tet$^\text{r}$ gal \textlambda(DE3) \textit{endA} Hte\\
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|
XL1-Blue & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} \textit{recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac} [F' \textit{proAB lacI$^\text{q}$ Z\textDelta M15} Tn\textit{10} (Tet$^\text{r}$)]\\
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|
\bottomrule
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\end{tabularx}
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\subsection{Plasmide}
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\label{sec:plasmide}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
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\toprule
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|
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Marker}\\
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\midrule
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|
pET-16b & Novagen, Darmstadt & Ampicillinresistenz\\
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|
\bottomrule
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\end{tabularx}
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\subsection{Kulturmedien}
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\label{sec:kulturmedien}
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\begin{description}
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\item[2YT (pH 7,5)] \hfill \\
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\SI{1,6}{\percent} (w/v) Pepton\\
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|
\SI{1}{\percent} (w/v) Hefeextrakt\\
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|
\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid\\
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|
\end{description}
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\subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
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\label{sec:puffer_zellauschluss}
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\begin{description}
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|
\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
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\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
|
|
\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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|
\SI{10}{\milli\Molar} Imidazol\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
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\subsection{Puffer und Lösungen für die Reinigung}
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\label{sec:reinigungspuffer}
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\begin{description}
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|
\item[Nickelsulfatlösung] \hfill \\
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|
\SI{100}{\milli\Molar} Nickelsulfat
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|
\end{description}
|
|
|
|
\begin{description}
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|
\item[Waschpuffer] \hfill \\
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|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
|
|
\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
|
|
|
|
\begin{description}
|
|
\item[Elutionspuffer] \hfill \\
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|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
|
|
\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
|
|
\SI{500}{\milli\Molar} Imidazol\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
|
|
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\begin{description}
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|
\item[Lagerungspuffer] \hfill \\
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|
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 8\\
|
|
\SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumchlorid\\
|
|
\SI{0,1}{\milli\Molar} \ac{EDTA}\\
|
|
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
|
|
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
|
|
\end{description}
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|
\end{singlespace}
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\section{Molekularbiologische Methoden}
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\label{sec:methoden}
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\subsection{Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren}
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\label{sec:konzentrationsbestimmung_nukleinsaeuren}
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Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
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bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
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durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
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\begin{align}
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\text{OD}_{260} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
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\label{eq:dna_konz}
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\end{align}
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\SI{2}{\micro\liter} der Probe und des verwendeten Puffers werden hierbei auf einer NanoQuant-
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Platte im Mikroplatten-Lesegerät vermessen und die Konzentration aus der Differenz
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aus Probe und Puffer gemäß Gleichung \ref{eq:dna_konz} berechnet.
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\subsection{Isolierung von Plasmid-\acs{DNA}}
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\label{sec:isolierung_plasmid_dna}
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Die Isolierung von Plasmiden erfolgte aus \SI{5}{\milli\liter} Übernachtkulturen mit Hilfe des
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"`QIAprep$^\text{\textregistered}$ Spin Miniprep"'-Kits nach Herstellerangaben.
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|
Die isolierte Plasmid-\acs{DNA} wurde in \SI{10}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl} pH 8,5 bei bei
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\SI{-20}{\celsius} gelagert.
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\subsection{Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen}
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\label{sec:extraktion_dna_agarosegel}
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Die Extraktion von \acs{DNA} aus Agarosegelen erfolgte mit dem "`illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"'
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nach Herstellerangaben.
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\subsection{Restriktionsverdau von \acs{DNA}}
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\label{sec:restriktionsverdau_dna}
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Im Zuge der Klonierung wurde der Zielvektor pET-16b über die beiden Restriktionsenzyme \textit{BamH}I und \textit{Nde}I linearisiert.
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Der Verdau erfolgte in einem Ansatzvolumen von \SI{25}{\micro\liter} bei \SI{37}{\celsius} über einen Zeitraum von \SI{2}{\hour}.
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\begin{description}
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\item[Ansatz Restriktionsverdau] \hfill \\
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\SI{4}{\micro\gram} Vektor-DNA\\
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\SI{2}{\micro\liter} NEBuffer 4 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
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|
\SI{10}{\Unit} \textit{BamH}I \\
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\SI{10}{\Unit} \textit{Nde}I\\
|
|
ad \SI{25}{\micro\liter} \ce{dH2O}
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\end{description}
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\subsection{\acl{PCR}}
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\label{sec:pcr}
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Mit Hilfe der \ac{PCR} konnen Nukleinsäurefragmente gezielt
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vervielfältigt werden. Die Spezifität der Reaktion ist hierbei durch die Auswahl der
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eingesetzten Primer gegeben.
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Eine PCR gliedert sich grundsätzlich in drei aufeinanderfolgende Phasen: Während
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der Denaturierung bei \SI{95}{\celsius} wird der Doppelstrang in die beiden Einzelstränge
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aufgespalten. Das Annealing bei \SIrange{50}{60}{\celsius} führt zur Anlagerung der Primer an die
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komplementären Sequenzabschnitte der Einzelstränge des Templates. Die exakte
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Temperatur ist hierbei von den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer abhängig.
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Während der Elongationsphase erfolgt die Synthese neuer Komplementärstränge
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ausgehend von den Primern durch eine DNA-Polymerase.
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Durch eine mehrfache Wiederholung kann die Ziel-DNA in kurzer Zeit exponentiell
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vervielfacht werden.
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\subsubsection{Herstellung von Inserts für die \acs{SLIC}}
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\label{sec:inserts_slic}
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Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl. \ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach folgendem
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Ansatz durchgeführt:
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\begin{description}
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\item[\ac{PCR}-Ansatz (\SI{50}{\micro\liter})] \hfill \\
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\SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
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|
\SI{2}{\micro\liter} 3'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
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\SI{2}{\micro\liter} 5'-Primer (\SI{10}{\micro\Molar}) \\
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|
\SI{5}{\micro\liter} Pwo-Puffer "`complete"' \\
|
|
\SI{0,5}{\micro\liter} Pwo-Polymerase (peqlab, Erlangen) \\
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|
\SI{0,5}{\micro\liter} dNTPs (\SI{10}{\milli\Molar}) \\
|
|
ad \SI{50}{\micro\liter} dH2O
|
|
\end{description}
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Das verwendete Cyclerprogramm ist in Tabelle \ref{tab:slic_cycler} aufgeführt. Bei der Berechnung
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der Annealing-Temperatur wurde im Fall der ersten zehn Zyklen die Schmelztemperatur
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des zum \ac{PPDK}-Gen homologen Primerabschnitts zu Grunde gelegt. In den letzten
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zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs.
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\begin{table}
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|
\centering
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\caption[Cyclerprogramm \acs{SLIC}]{Cyclerprogramm für die Synthese von Inserts zur \acs{SLIC}}
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\begin{tabular}{ccc}
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\toprule
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|
\textbf{Temperatur [\si{\celsius}]} & \textbf{Zeit [\si{\minute}]} & \textbf{Zyklen}\\
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|
\midrule
|
|
95 & 5 & \multirow{4}{*}{10} \\
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|
95 & 1 & \\
|
|
46 & 1 & \\
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|
72 & 5 & \\
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|
\midrule
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|
95 & 1 & \multirow{3}{*}{20} \\
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|
65 & 1 & \\
|
|
72 & 5 & \\
|
|
\midrule
|
|
95 & 10 & 1 \\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabular}
|
|
\label{tab:slic_cycler}
|
|
\end{table}
|
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|
|
\subsection{\acf{SLIC}}
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|
\label{sec:slic}
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Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren,
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|
welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
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|
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|
Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I linearisiert (vgl. \ref{sec:restriktionsverdau_dna}). Der linearisierte Vektor
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wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst (vgl. \ref{sec:extraktion_dna_agarosegel}). Die
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|
für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
|
|
Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
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|
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|
\begin{description}
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|
\item[Ansatz für \ac{SLIC}-Dau (\SI{35}{\micro\liter})] \hfill \\
|
|
x~\si{\micro\liter} \acs{DNA}~\textequiv~\SI{1000}{\nano\gram} \acs{DNA}\\
|
|
\SI{2}{\micro\liter} \acs{BSA} (\SI{1}{\milli\gram\per\milli\liter})\\
|
|
\SI{4}{\micro\liter} NEBuffer 2 (New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
|
\SI{1}{\Unit} T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
|
ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{dH2O}
|
|
\end{description}
|
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|
|
Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von
|
|
\SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde
|
|
durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.
|
|
|
|
In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert DNA (\SI{2691}{\bp}) im zweifachen molaren Verhältnis eingesetzt:
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|
|
|
\begin{description}
|
|
\item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
|
|
x \si{\micro\liter} Vektor-\acs{DNA} \textequiv~\SI{150}{\nano\gram}\\
|
|
y \si{\micro\liter} Insert-\acs{DNA} \textequiv~\SI{141}{\nano\gram}\\
|
|
\SI{1}{\micro\liter} T4-Ligase Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)\\
|
|
ad \SI{10}{\micro\liter} \ce{dH2O}
|
|
\end{description}
|
|
|
|
Der Ansatz wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{37}{\celsius} inkubiert. \SI{5}{\micro\liter} der Ansätze wurden für die
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|
Transformation von \acs{E. coli} XL1-Blue eingesetzt.
|
|
|
|
\section{Mikrobiologische Methoden}
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\label{sec:mikrobiologische_methoden}
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\section{Präparative Methoden}
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\label{sec:praeparative_methoden}
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\section{Analytische Methoden}
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\label{sec:analytische_methoden}
|
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\section{Bioinformatische Methoden}
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\label{sec:bioinformatische_methoden}
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