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Alexander Minges 2012-07-20 00:07:56 +02:00
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@ -1 +1,4 @@
\selectlanguage{english}
\chapter*{Abstract} \chapter*{Abstract}
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130
inc/material.tex
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@ -35,7 +35,6 @@
\subsection{Verbrauchsmaterialien} \subsection{Verbrauchsmaterialien}
\label{sec:verbrauchsmaterialien} \label{sec:verbrauchsmaterialien}
%\begin{center}
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
\toprule \toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\ \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
@ -52,10 +51,43 @@
\bottomrule \bottomrule
\end{tabularx} \end{tabularx}
\subsection{Chemikalien}
\label{sec:chemikalien}
\begin{longtable}{p{0.33\textwidth} r p{0.38\textwidth}}
\toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
\midrule
Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
Coomassie Blue (CB250) & & \\
Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
Hefeextrakt & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
Imidazol & 288-32-4 & AppliChem, Darmstadt\\
\acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\
Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\
Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\
Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\
Nickelsulfat & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
\acf{Tris} & 77-86-1 & VWR, Darmstadt\\
\bottomrule
\end{longtable}
\subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren} \subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren}
\label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren} \label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren}
%\begin{center}
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X} \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
\toprule \toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\ \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
@ -65,8 +97,78 @@
PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained) & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\ PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained) & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\
\bottomrule \bottomrule
\end{tabularx} \end{tabularx}
\end{singlespace}
\subsection{Antikörper}
\label{sec:antikoerper}
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
\toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
\midrule
Anti-His-\acs{HRP} & Carl Roth, Karlsruhe\\
\bottomrule
\end{tabularx}
\subsection{Kommerzielle Kits}
\label{sec:komerzielle_kits}
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
\toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
\midrule
illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Freiburg\\
QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\
Roti-Quant$^\text{\textregistered}$ (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
\bottomrule
\end{tabularx}
\subsection{Bakterienstämme}
\label{sec:batrienstaemme}
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
\toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\
\midrule
BL21 (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm gal} \textlambda(DE3)\\
BL21 Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm} Tet$^\text{r}$ gal \textlambda(DE3) \textit{endA} Hte\\
\bottomrule
\end{tabularx}
\subsection{Plasmide}
\label{sec:plasmide}
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
\toprule
\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Marker}\\
\midrule
pET-16b & Novagen, Darmstadt & Ampicillinresistenz\\
\bottomrule
\end{tabularx}
\subsection{Kulturmedien}
\label{sec:kulturmedien}
\begin{description}
\item[2YT (pH 7,5)] \hfill \\
\SI{1,6}{\percent} (w/v) Pepton\\
\SI{1}{\percent} (w/v) Hefeextrakt\\
\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid\\
\end{description}
\subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
\label{sec:puffer_zellauschluss}
\begin{description}
\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
\SI{10}{\milli\Molar} Imidazol\\
\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
\end{description}
\end{singlespace}
\section{Methoden} \section{Methoden}
\label{sec:methoden} \label{sec:methoden}
@ -76,7 +178,7 @@ Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei: durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
\begin{align} \begin{align}
\text{OD}_{600} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA} \text{OD}_{260} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
\label{eq:dna_konz} \label{eq:dna_konz}
\end{align} \end{align}
@ -141,14 +243,15 @@ zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs
\subsection{\acf{SLIC}} \subsection{\acf{SLIC}}
\label{sec:slic} \label{sec:slic}
Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren, welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren. Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren,
welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I (New England Biolabs, Frankfurt) linearisiert. Hierfür wurden in einem Gesamtvolumen von \SI{25}{\micro\liter} \SI{4000}{\nano\gram} Plasmid-\acs{DNA} für \SI{2}{\hour} bei \SI{22}{\celsius} nach Herstellerangaben gedaut. Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I (New England Biolabs, Frankfurt)
linearisiert. Hierfür wurden in einem Gesamtvolumen von \SI{25}{\micro\liter} \SI{4000}{\nano\gram} Plasmid-\acs{DNA} für \SI{2}{\hour}
Der linearisierte Vektor wurde anschlieend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst. bei \SI{22}{\celsius} nach Herstellerangaben gedaut.
Die für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
Der linearisierte Vektor wurde anschlieend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst. Die für die \ac{PPDK}
kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut: Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
\begin{description} \begin{description}
@ -160,9 +263,12 @@ Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Ins
ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{dH2O} ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{dH2O}
\end{description} \end{description}
Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von \SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{3,5}{\micro\liter} \ac{dCTP} gestoppt. Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von
\SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde
durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.
In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert DNA im zweifachen molaren Verhältnis (\SI{144}{\nano\gram}) eingesetzt: In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert DNA im zweifachen molaren Verhältnis
(\SI{144}{\nano\gram}) eingesetzt:
\begin{description} \begin{description}
\item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\ \item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\

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@ -27,7 +27,7 @@
\usepackage[utf8]{inputenc} % Eingabekodierung UTF-8 \usepackage[utf8]{inputenc} % Eingabekodierung UTF-8
\usepackage[T1]{fontenc} % Schriftkodierung \usepackage[T1]{fontenc} % Schriftkodierung
\usepackage{libertine} % Schriftarten 'Linux Libertine' und 'Linux Biolinum' \usepackage{libertine} % Schriftarten 'Linux Libertine' und 'Linux Biolinum'
\usepackage[ngerman]{babel} % Neue Deutsche Rechtschreibung/Silbentrennung mit griechischen Buchstaben \usepackage[ngerman,english]{babel} % Neue Deutsche Rechtschreibung/Silbentrennung mit griechischen Buchstaben
\usepackage{setspace} % Paket für das Setzen des Zeilenabstandes \usepackage{setspace} % Paket für das Setzen des Zeilenabstandes
\onehalfspacing % 1,5facher Zeilenabstand \onehalfspacing % 1,5facher Zeilenabstand
\usepackage[draft,kerning,spacing,protrusion=true,expansion,tracking=true,babel=true]{microtype} %Mikrotypographie (erweitertes Kerning, etc.) \usepackage[draft,kerning,spacing,protrusion=true,expansion,tracking=true,babel=true]{microtype} %Mikrotypographie (erweitertes Kerning, etc.)
@ -37,7 +37,7 @@
\newunit{\kb}{kb} % Definition eigener Einheiten: Kilo-Basenpaare \newunit{\kb}{kb} % Definition eigener Einheiten: Kilo-Basenpaare
\newunit{\Unit}{U} % Definition eigener Einheiten: Unit \newunit{\Unit}{U} % Definition eigener Einheiten: Unit
\newunit{\rpm}{rpm} % Definition eigener Einheiten: Umdrehungen/Minute \newunit{\rpm}{rpm} % Definition eigener Einheiten: Umdrehungen/Minute
\newunit{\g}{x g} % Definition eigener Einheiten: relative Erdbeschleunigung \newunit{\g}{x~g} % Definition eigener Einheiten: relative Erdbeschleunigung
\newunit{\psi}{psi} % Definition eigener Einheiten: Pounds per inch \newunit{\psi}{psi} % Definition eigener Einheiten: Pounds per inch
\newunit{\CV}{CV} \newunit{\CV}{CV}
\newunit{\AS}{AS} \newunit{\AS}{AS}
@ -83,6 +83,7 @@
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