Ausbau Material und Methoden
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@ -1 +1,4 @@
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\selectlanguage{english}
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\chapter*{Abstract}
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\selectlanguage{ngerman}
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130
inc/material.tex
130
inc/material.tex
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@ -35,7 +35,6 @@
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\subsection{Verbrauchsmaterialien}
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\label{sec:verbrauchsmaterialien}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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@ -52,10 +51,43 @@
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\subsection{Chemikalien}
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\label{sec:chemikalien}
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\begin{longtable}{p{0.33\textwidth} r p{0.38\textwidth}}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{CAS-Nummer} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Agar & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Ampicillin-Natriumsalz & 69-52-3 & AppliChem, Darmstadt\\
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Bromphenolblau & 62625-28-9 & Sigma-Aldrich, München\\
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Coomassie Blue (CB250) & & \\
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Dikaliumhydrogenphosphat & 16788-57-1 & Grüssing, Filsum\\
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\acf{DTT} & 3483-12-3 & Sigma-Aldrich, München\\
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\acf{EDTA} & 60-00-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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Ethanol & 64-17-5 & VWR, Darmstadt\\
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Glycerin & 56-81-5 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Hefeextrakt & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Imidazol & 288-32-4 & AppliChem, Darmstadt\\
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\acf{IPTG} & 367-93-1 & PEQLAB Biotechnologie, Erlangen\\
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Kaliumdihydrogenphosphat & 7778-77-0 & Grüssing, Filsum\\
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Magnesiumchlorid & 7791-18-6 & VWR, Darmstadt\\
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Natriumchlorid & 7647-14-5 & VWR, Damrstadt\\
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Natriumdodecylsulfat (SDS) & 151-21-3 & Serva, Heidelberg\\
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Nickelsulfat & 10101-97-0 & AppliChem, Darmstadt\\
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Pepton & & Becton Dickinson, Heidelberg\\
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Phosphorsäure & 7664-38-2 & Grüssing, Filsum\\
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\acf{PMSF} & 329-98-6 & Merck, Bruchsal\\
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Polysorbat 20 (Tween$^{\text{\textregistered}}$ 20) & 9005-64-5 & Sigma-Aldrich, München\\
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Rotiphorese$^\text{\textregistered}$ Gel 30 & & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Saccharose & 57-50-1 & Carl Roth, Karlsruhe\\
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Salzsäure & 7647-01-0 & VWR, Darmstadt\\
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\acf{Tris} & 77-86-1 & VWR, Darmstadt\\
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\bottomrule
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\end{longtable}
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\subsection{Standards für Proteine und Nukleinsäuren}
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\label{sec:standards_proteine_nukleinsaeuren}
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%\begin{center}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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@ -65,8 +97,78 @@
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PageRuler Protein Ladder \newline(Prestained/Unstained) & Fermentas, {St. Leon-Rot}\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\end{singlespace}
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\subsection{Antikörper}
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\label{sec:antikoerper}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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Anti-His-\acs{HRP} & Carl Roth, Karlsruhe\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\subsection{Kommerzielle Kits}
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\label{sec:komerzielle_kits}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.55\textwidth}X}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller}\\
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\midrule
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illustra GFX PCR DNA and Gel Band\newline Purification kit & GE Healthcare, Freiburg\\
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QIAprep Spin Miniprep & Qiagen, Hilden\\
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Roti-Quant$^\text{\textregistered}$ (Bradford) & Carl Roth, Karlsruhe\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\subsection{Bakterienstämme}
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\label{sec:batrienstaemme}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Genotyp}\\
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\midrule
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BL21 (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm gal} \textlambda(DE3)\\
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BL21 Gold (DE3) & Agilent Technologies, Waldbronn & \acs{E. coli} B F$^\text{-}$ \textit{ompT hsdS}(${\text{r}_\text{B}}^\text{-}~{\text{m}_\text{B}}^\text{-}$) \textit{dcm} Tet$^\text{r}$ gal \textlambda(DE3) \textit{endA} Hte\\
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||||
\bottomrule
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\end{tabularx}
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||||
\subsection{Plasmide}
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\label{sec:plasmide}
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\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
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\toprule
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\textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Marker}\\
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\midrule
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pET-16b & Novagen, Darmstadt & Ampicillinresistenz\\
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\bottomrule
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\end{tabularx}
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\subsection{Kulturmedien}
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\label{sec:kulturmedien}
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\begin{description}
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\item[2YT (pH 7,5)] \hfill \\
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\SI{1,6}{\percent} (w/v) Pepton\\
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\SI{1}{\percent} (w/v) Hefeextrakt\\
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\SI{0,5}{\percent} (w/v) Natriumchlorid\\
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\end{description}
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\subsection{Puffer für den Zellaufschluss}
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\label{sec:puffer_zellauschluss}
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\begin{description}
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\item[Aufschlusspuffer] \hfill \\
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\SI{50}{\milli\Molar} \acs{Tris}/\ce{HCl}, pH 7,5\\
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\SI{300}{\milli\Molar} Natriumchlorid\\
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\SI{10}{\milli\Molar} Imidazol\\
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\SI{5}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat\\
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\SI{5}{\milli\Molar} \ac{DTT}\\
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\SI{10}{\percent} (w/v) Glycerin\\
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\SI{0,002}{\percent} (w/v) \ac{PMSF}
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\end{description}
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\end{singlespace}
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\section{Methoden}
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\label{sec:methoden}
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@ -76,7 +178,7 @@ Nucleinsäuren besitzen aufgrund der aromatischen Basen ein Absorptionsmaximum
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bei einer Wellenlänge von \SI{260}{\nano\meter}. Die DNA-Konzentration kann daher spektrometrisch
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durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden. Es gilt hierbei:
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\begin{align}
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\text{OD}_{600} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
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\text{OD}_{260} \equiv \SI{50}{\micro\gram\per\milli\liter}~\text{DNA}
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\label{eq:dna_konz}
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\end{align}
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@ -141,14 +243,15 @@ zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs
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\subsection{\acf{SLIC}}
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\label{sec:slic}
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Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren, welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
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Die \ac{SLIC} \citep{Li2007} macht sich die Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase zu Nutze, um 5'-Überhänge zu generieren,
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welche anschließend in einer enzymunabhängigen Reaktion ligieren.
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Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I (New England Biolabs, Frankfurt) linearisiert. Hierfür wurden in einem Gesamtvolumen von \SI{25}{\micro\liter} \SI{4000}{\nano\gram} Plasmid-\acs{DNA} für \SI{2}{\hour} bei \SI{22}{\celsius} nach Herstellerangaben gedaut.
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Der linearisierte Vektor wurde anschlieend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst.
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Die für die \ac{PPDK} kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
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Der Zielvektor pET-16b wurde zunächst über die Restriktionsenzyme \textit{Nde}I und \textit{BamH}I (New England Biolabs, Frankfurt)
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linearisiert. Hierfür wurden in einem Gesamtvolumen von \SI{25}{\micro\liter} \SI{4000}{\nano\gram} Plasmid-\acs{DNA} für \SI{2}{\hour}
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bei \SI{22}{\celsius} nach Herstellerangaben gedaut.
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Der linearisierte Vektor wurde anschlieend über ein Agarosegel gereinigt und die \acs{DNA} aus dem Gel gelöst. Die für die \ac{PPDK}
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kodierende Sequenz wurde wie in \ref{sec:pcr} beschrieben amplifiziert und ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt.
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Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Insert-\acs{DNA} in folgendem Ansatz gedaut:
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\begin{description}
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@ -160,9 +263,12 @@ Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Ins
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ad \SI{35}{\micro\liter} \ce{dH2O}
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\end{description}
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Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von \SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde durch Zugabe von \SI{3,5}{\micro\liter} \ac{dCTP} gestoppt.
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Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von
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\SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde
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durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.
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In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert DNA im zweifachen molaren Verhältnis (\SI{144}{\nano\gram}) eingesetzt:
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In das nachfolgende Annealing wurden \SI{150}{\nano\gram} Vektor-\acs{DNA}, sowie Insert DNA im zweifachen molaren Verhältnis
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(\SI{144}{\nano\gram}) eingesetzt:
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\begin{description}
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\item[\acs{SLIC}-Annealing (\SI{10}{\micro\liter})] \hfill \\
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@ -27,7 +27,7 @@
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\usepackage[utf8]{inputenc} % Eingabekodierung UTF-8
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\usepackage[T1]{fontenc} % Schriftkodierung
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\usepackage{libertine} % Schriftarten 'Linux Libertine' und 'Linux Biolinum'
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\usepackage[ngerman]{babel} % Neue Deutsche Rechtschreibung/Silbentrennung mit griechischen Buchstaben
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\usepackage[ngerman,english]{babel} % Neue Deutsche Rechtschreibung/Silbentrennung mit griechischen Buchstaben
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\usepackage{setspace} % Paket für das Setzen des Zeilenabstandes
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\onehalfspacing % 1,5facher Zeilenabstand
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\usepackage[draft,kerning,spacing,protrusion=true,expansion,tracking=true,babel=true]{microtype} %Mikrotypographie (erweitertes Kerning, etc.)
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@ -37,7 +37,7 @@
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\newunit{\kb}{kb} % Definition eigener Einheiten: Kilo-Basenpaare
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\newunit{\Unit}{U} % Definition eigener Einheiten: Unit
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\newunit{\rpm}{rpm} % Definition eigener Einheiten: Umdrehungen/Minute
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\newunit{\g}{x g} % Definition eigener Einheiten: relative Erdbeschleunigung
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\newunit{\g}{x~g} % Definition eigener Einheiten: relative Erdbeschleunigung
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\newunit{\psi}{psi} % Definition eigener Einheiten: Pounds per inch
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\newunit{\CV}{CV}
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\newunit{\AS}{AS}
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@ -83,6 +83,7 @@
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\renewcommand{\texttheta}{{\libertineGlyph{theta}}}
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\renewcommand{\textDelta}{{\libertineGlyph{Delta}}}
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\renewcommand{\textpi}{{\libertineGlyph{pi}}}
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\renewcommand{\textlambda}{{\libertineGlyph{lambda}}}
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\renewcommand{\textrightarrow}{{\libertineGlyph{arrowright}}}
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\renewcommand{\textregistered}{{\libertineGlyph{registered}}}
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\newcommand{\textequiv}{{\libertineGlyph{equivalence}}}
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