Material und Methoden vervollständigt; Beginn Ergebnisteil

inc/abkuerzungen.tex

@@ -9,6 +9,7 @@
  \acro{BSA}{Bovines Serumalbumin}
  \acro{CBB}[CBB-G250]{Coomassie-Brilliant-Blau G-250}
  \acro{CD}{Circulardichroismus}
+ \acro{C. symbiosum}[\textit{C. symbiosum}]{\textit{Chlostridium symbiosum}}
  \acro{CV}{Säulenvolumen, engl. \textit{column volume}}
  \acro{dCTP}{Desoxycytidintriphosphat}
  \acro{ddH2O}[\ce{ddH2O}]{Doppelt destilliertes Wasser}
@@ -18,6 +19,7 @@
  \acro{EDTA}{Ethylendiamintetraessigsäure}
  \acro{E. coli}[\textit{E. coli}]{\textit{Escherichia coli}}
  \acro{F. trinervia}[\textit{F. trinervia}]{\textit{Flaveria trinervia}}
+ \acro{F. brownii}[\textit{F. brownii}]{\textit{Flaveria brownii}}
  %\acro{HCl}[\ce{HCl}]{Salzsäure}
  \acro{HRP}{Meerrettich-Peroxidase, engl. \textit{horseradish peroxidase}}
  \acro{IDA}{Iminodiessigsäure}
@@ -32,21 +34,22 @@
  %\acro{NaHCO3}[\ce{NaHCO3}]{Natriumhydrogencarbonat}
  \acro{NaN3}[\ce{NaN3}]{Natriumazid}
  \acro{OD}{Optische Dichte}
- \acro{p. a.}{\textit{pro analysi} (lat.)}
+ \acro{p. a.}{\textit{pro analysi}~(lat.)}
  \acro{PAGE}{Polyacrylamidgelelektrophorese}
  \acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion}
  \acro{PEP}{Phosphoenolpyruvat}
  \acro{PEPCase}{Phosphoenolpyruvat-Carboxylase}
  \acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
  \acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
- \acro{rcf}{\textit{relative centrifugal force} (engl.)}
+ \acro{rcf}{\textit{relative centrifugal force}~(engl.)}
  \acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat}
  \acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung}
- \acro{SOPMA}{\textit{Self-optimized prediction method} (engl.)}
+ \acro{SOPMA}{\textit{Self-optimized prediction method}~(engl.)}
  \acro{TAE}{Tris-Acetat-EDTA}
- \acro{TBS}{\textit{Tris-buffered saline} (engl.)}
+ \acro{TBS}{\textit{Tris-buffered saline}~(engl.)}
- \acro{TBT}{\textit{Tris-buffered Tween} (engl.)}
+ \acro{TBT}{\textit{Tris-buffered Tween}~(engl.)}
  \acro{TEMED}{Tetramethylethylendiamin}
+ \acro{TEV}{\textit{Tobacco etch virus}~(engl.)}
  \acro{Tris}{Tris(hydroxymethyl)-aminomethan}
  \acro{UV}{Ultraviolett}
 \end{acronym}

inc/anhang.tex

@@ -1,17 +1,59 @@
 \appendix
-\chapter{Nuklein- und Aminosäuresequenzen}
+\chapter{Anhang}
-\begin{texshade}{./misc/align_seq_ref.aln}
+\section{Nuklein- und Aminosäuresequenzen}
+\microtypesetup{protrusion=false}
+
+\begin{texshade}{./misc/seq_ref_aln.fa}
 \setsize{names}{scriptsize}
 \setsize{residues}{scriptsize}
+\setsize{features}{tiny}
+
+\setsize{names}{scriptsize}
+\setfamily{names}{sf}
+
+\shadingcolors{grays}
 \showruler{1}{top}
 \hidenumbering
 \hideconsensus
+\feature{bottom}{2}{71..71}{restriction}{Nde I}
+\feature{bottom}{2}{2712..2712}{restriction}{BamH I}
 \showcaption{Sequenzalignment der \acs{PPDK}-kodierenden Sequenz im Vektor pETEV-16b-ppdk und der
          Referenzsequenz}
 \shortcaption{Sequenzalignment pETEV-16b-ppdk}
 \end{texshade}
 
-\chapter{Anhang}
+\clearpage
+
+\begin{texshade}{./misc/ma_as_aln.fa}
+\shadingmode{similar}
+\threshold[80]{50}
+
+\nameseq{1}{F. trinervia}
+\nameseq{2}{F. brownii}
+\nameseq{3}{Zea mays}
+\nameseq{4}{C. symbiosum}
+
+\setsize{names}{scriptsize}
+\setfamily{names}{sf}
+\setsize{residues}{scriptsize}
+\setsize{numbers}{scriptsize}
+\setsize{features}{tiny}
+\setfamily{legend}{sf}
+\setsize{legend}{scriptsize}
+\setsize{featurestyles}{scriptsize}
+\showruler{1}{top}
+\hidenumbering
+\defconsensus{{$\bullet$}}{{$\bullet$}}{{$\bullet$}}
+\showconsensus[ColdHot]{bottom}
+\nameconsensus{conservation} 
+% \showlegend
+\showcaption{Multiples Alignment der Aminosäuresequenzen der \acs{PPDK}s aus \acs{F. trinervia}, \acs{F. brownii}, \textit{Zea mays} und 
+\acs{C. symbiosum}. Sequenzidentitäten sind farbkodiert dargestellt: \SI{100}{\percent} Identität (violett), \SI{75}{\percent} (blau) und 
+\SI{50}{\percent} (rosa).}
+\shortcaption{Multiples Alignment der Primärstrukturen verschiedener PPDKs}
+\end{texshade}
+
+\microtypesetup{protrusion=true}
 
 \chapter{Erklärung}
 Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Masterarbeit selbstständig verfasst und keine anderen, als die angegebenen Quellen und 

inc/ergebnisse.tex

@@ -1 +1,64 @@
-\chapter{Ergebnisse} 
+\chapter{Ergebnisse}
+\label{sec:ergebnisse}
+%
+\section{Klonierung}
+\label{sec:erg_klonierung}
+%
+Sie \acs{SLIC}-Klonierung erfolgte wie in \ref{sec:slic} beschrieben. Die mittels \acs{PCR} synthetisierten \textit{Inserts} 
+(vgl.~\ref{sec:inserts_slic}), sowie der linearisierte Vektor (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}) wurden auf ein zur Reinigung auf
+Agarosegel aufgetragen (vgl. \ref{sec:agarose_gelelektrophorese}). Es ergab sich das in Abbildung \ref{abb:agarosegel_vektor_insert} gezeigte Auftrennungsmuster.
+%
+\begin{figure}[htb]
+ \centering
+ \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
+ \centering
+ \includegraphics[keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/vektor_linear_text.png}
+ % vektor_linear_text.png: 615x551 pixel, 300dpi, 5.21x4.67 cm, bb=0 0 148 132
+ \caption{}
+ \label{abb:linearisierter_vektor}
+ \end{subfigure}
+ %
+ ~
+ %
+ \begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
+ \centering
+ \includegraphics[keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/insert_pcr_text.png}
+ % insert_pcr_text.png: 474x551 pixel, 300dpi, 4.01x4.67 cm, bb=0 0 114 132
+ \caption{}
+ \label{abb:}
+\end{subfigure}
+ \caption[Agarosegel zur Reinigung von Vektor und dem Insert]{Exemplarischer Ausschnitt aus dem Agarosegel zur Reinigung von 
+                                                                                  linearisiertem Vektor (a) und dem Insert (b) zur SLIC-Klonierung.
+                                                                                  Aufgetragen wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard und 
+                                                                                  je \SI{20}{\micro\liter} Probe. Die erwarteten Größen sind \SI{5720}{\bp} (Vektor) 
+                                                                                  und \SI{2691}{\bp} (Insert).}
+ \label{abb:agarosegel_vektor_insert}
+\end{figure}
+
+Sowohl Vektor als auch Insert lagen innerhalb der erwarteten Größenordnung (\SI{5720}{\bp} bzw. \SI{2691}{\bp}) auf, so dass beide wie in \ref{sec:slic}
+beschrieben in den Ligationsansatz gegeben wurden. Zur Amplifikation des Vektors wurden dann \acs{E. coli} Zellen des Stamms XL1-Blue mit diesem transformiert 
+(vgl. \ref{sec:transformation}) und auf Agarplatten angezogen. Mit einer Kolonie-PCR (vgl. \ref{sec:kolonie_pcr}) wurde überprüft, ob der untersuchte Klon
+das korrekte Insert trägt. Das enstsprechende Gelbild ist in Abbildung \ref{abb:kolonie_pcr} dargestellt.
+%
+\begin{figure}[htb]
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/agarose_gele/colony_pcr.png}
+ % colony_pcr.png: 1586x1474 pixel, 300dpi, 13.43x12.48 cm, bb=0 0 381 354
+ \caption[Agarosegel nach Kolonie-PCR]{Agarosegel nach Kolonie-PCR. Es wurden \SI{5}{\micro\liter} \SI{1}{\kb}-Größenstandard und je \SI{20}{\micro\liter} Probe aufgetragen.
+ Untersucht wurden 24 Klone, von denen fünf (10, 13, 22, 23 und 24) ein Plasmid mit der korrekten Größe tragen.}
+ \label{abb:kolonie_pcr}
+\end{figure}
+
+Von untersuchten 24 Klonen wiesen fünf ein Plasmid auf, das der erwarteten Größe von \SI{8351}{\bp} (Vektor~+~Insert) entspricht. Die fünf positiven Klone
+wurden in \SI{5}{\milli\liter} Kulturrörchen über Nacht angezogen und die Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit nach Herstellerangaben extrahiert.
+Proben der isolierten Plasmid-DNA wurden zur Sequenzierung eingeschickt (StarSEQ GmbH, Mainz). Es konnte gezeigt werden, dass das aus Klon \#22 isolierte
+Plasmid im für die \acs{PPDK} kodierenden Bereich keine Mutation trägt. Eine Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk ist in Abbildung \ref{abb:plasmidkarte}
+aufgeführt.
+%
+\begin{figure}[htb]
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/pETEV-16b-ppdk.pdf}
+ % pETEV-16b-ppdk.pdf: 611x480 pixel, 72dpi, 21.55x16.93 cm, bb=0 0 611 480
+ \caption{Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk}
+ \label{abb:plasmidkarte}
+\end{figure}

inc/material.tex

@@ -132,8 +132,8 @@
   \toprule
   \textbf{Bezeichnung} & \textbf{Hersteller} & \textbf{Erkennungssequenz (5'~--~3')}\\
   \midrule
-  \textit{BamH}I & New England Biolabs, Frankfurt & CA/TATG\\
+  \textit{Nde}I & New England Biolabs, Frankfurt & CA/TATG\\
-  \textit{Nde}I  & New England Biolabs, Frankfurt & G/GATCC\\
+  \textit{BamH}I  & New England Biolabs, Frankfurt & G/GATCC\\
   \bottomrule
  \end{tabularx} 
  
@@ -168,8 +168,10 @@
  
 \subsection{Plasmide}
 \label{sec:plasmide}
-
+Das tatsächlich eingesetzte Plasmid trägt die Bezeichnung pETEV-16b und ist ein Derivat des pET-16b-Vektors,
-
+das zusätzlich zwischen der für den Hexa-Histidin-Tag kodierenden Sequenz und dem Zielgen eine für die Schnittstelle 
+der \acs{TEV}-Protease kodierende Sequenz beinhaltet.
+%
 \begin{samepage}
  \begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
   \toprule
@@ -461,6 +463,7 @@ zwanzig Zyklen die Schmelztemperatur des zum Zielvektor homologen Primerbereichs
 \end{table}
 
 \subsubsection{Kolonie-\acs{PCR}}
+\label{sec:kolonie_pcr}
 Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden zufällig ausgewählte Kolonien mittels einer Kolonie-PCR
 untersucht. Hierzu wurden je Kolonie \SI{5}{\micro\liter} \acs{ddH2O} in einem \acs{PCR}-Gefäß
 vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie gepickt, in das vorgelegte Wasser getaucht
@@ -791,7 +794,7 @@ Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen e
 \SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n~\textrightarrow~\textpi$^*$ bzw. 
 \textpi~\textrightarrow~\textpi$^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr 
 empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{Greenfield2007}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration 
-von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und 
+von \SI{0,2}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und 
 Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.
 
 \subsection{Aktivitätsassay}
@@ -839,6 +842,16 @@ $\epsilon_{340} = \SI{6,3e3}{\per\Molar\per\centi\meter}$ \citep{McComb1976} und
 
 \subsection{Analyse von \ac{CD}-Spektren}
 \label{sec:analyse_cd_spektren}
+Die Analyse der aufgenommenen CD-Spektrem (siehe \ref{sec:cd_spektroskopie}) erfolgte mit dem Programmpaket \textit{CDPro} \citep{Sreerama2000}, sowie
+dem Programm \textit{K2D3} \citep{Louis-Jeune2011}. Die Analyse erfolgte jeweils in einem Wellenlängenbereich von \SIrange{190}{240}{\nano\meter}. 
+Die berechneten Sekundärstrukturanteile wurden dann mit mit einer \textit{ab initio} Vorhersage, welche mit \acs{SOPMA} \citep{Geourjon1995a} 
+berechnet wurde verglichen. Zusätzlich wurden die Sekundärstrukturanteile aus der bereits bekannten \acs{PPDK}-Struktur aus \textit{Zea mays} 
+herangezogen.
+
+\subsection{Alignment von Nuklein- und Aminosäuresequenzen}
+\label{sec:alignment}
+Alignments von Nuklein- und Aminosäuren wurden mit dem Programm \textit{T-Coffee} \citep{Notredame2000,Wallace2006,Moretti2007,DiTommaso2011} erstellt. Das Programm \textit{Bowtie 2} 
+\citep{Langmead2012} kam zum Einsatz, um \textit{Reads} aus der Sequenzierung an die Referenzsequenz zu alignieren.
 
 \subsection{Erstellung von Homologiemodellen}
 \label{sec:erstellung_homologiemodell}

masterarbeit.kilepr

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 \titlehead{\centering \includegraphics[keepaspectratio=true,width=0.4\textwidth]{./img/HHU_Logo.eps}}
 \subject{Institut für Biochemische Pflanzenphysiologie}

misc/align_seq_ref.aln

@@ -1,194 +0,0 @@
-CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment
-
-
-pETEV-16b-ppdk      ATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCATCATCATCATCATCATCA
-FtPPDK-ref          ------------------------------------------------------------
-                                                                                
-
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-
-pETEV-16b-ppdk      ACGCGTGTTTACGTTCGGCAAAGGTCGCTCGGAAGGCAACCGTGACATGAAATCGCTGCT
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+F._1     526 999999999999999999999999999999999999999999999998  573 
+Zea      526 999999999999999999999999999999999999999999999998  573 
+C.       523 999999999999999999999999999999999999999999999987  570 
+cons     529 999999999999999999999999999999999999999999999998  576 
+
+
+F.       574 788999999999999999999999999999999999999999999999  621 
+F._1     574 788999999999999999999999999999999999999999999999  621 
+Zea      574 788999999999999999999999999999999999999999999999  621 
+C.       571 -78889999999999999999999999999999999999999999999  617 
+cons     577 688899999999999999999999999999999999999999999999  624 
+
+
+F.       622 999999999999987766899999999999999999999999999999  669 
+F._1     622 999999999999987766899999999999999999999999999999  669 
+Zea      622 999999999999987766899999999999999999999999999999  669 
+C.       618 9999999999998766--689999999999999999999999999999  663 
+cons     625 999999999999977655799999999999999999999999999999  672 
+
+
+F.       670 999999999999999999999999999887-89999999999999999  716 
+F._1     670 999999999999999999999999999887-89999999999999999  716 
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+C.       664 999999999999999999999999999876389999999999999999  711 
+cons     673 999999999999999999999999999876289999999999999999  720 
+
+
+F.       717 999999999999999999999999999999999999999999999999  764 
+F._1     717 999999999999999999999999999999999999999999999999  764 
+Zea      717 999999999999999999999999999999999999999999999999  764 
+C.       712 999999999999999999999999999999999999999999999999  759 
+cons     721 999999999999999999999999999999999999999999999999  768 
+
+
+F.       765 999999999999999999999999999999999999999999999999  812 
+F._1     765 999999999999999999999999999999999999999999999999  812 
+Zea      765 999999999999999999999999999999999999999999999999  812 
+C.       760 999999999999999999999999999999999999999999999999  807 
+cons     769 999999999999999999999999999999999999999999999999  816 
+
+
+F.       813 999999999999999999999999999999999999999999999999  860 
+F._1     813 999999999999999999999999999999999999999999999999  860 
+Zea      813 999999999999999999999999999999999999999999999999  860 
+C.       808 999999999999999999999999999999999999999999999999  855 
+cons     817 999999999999999999999999999999999999999999999999  864 
+
+
+F.       861 999999999999999---8  876 
+F._1     861 999999999999999---8  876 
+Zea      861 999999999999999---8  876 
+C.       856 9999999999999983747  874 
+cons     865 9999999999999982228  883 
+
+
+
+
+

misc/ma_as_aln.fa

@@ -0,0 +1,76 @@
+>F. trinervia
+TAKKRVFTFGKGRSEGNRDMKSLLGGKGANLAEMSSIGLSVPPGLTISTE
+ACEEYQQNGKSLPPGLWDEISEGLDYVQKEMSASLGDPSKPLLLSVRSGA
+AISMPGMMDTVLNLGLNDEVVAGLAGKSG-ARFAYDSYRRFLDMFGNVVM
+GIPHSLFDEKLEQMKAEKGIHLDTDLTAADLKDLVEKYKNVYVEA-KGEK
+FPTDPKKQLELAVNAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVNIQSMVFG
+NMGNTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLINAQGEDVVAGIRTPEDLGTME
+TCMPEAYKELVENCEILERHYKDMMDIEFTVQENRLWMLQCRTGKRTGKG
+AVRIAVDMVNEGLIDTRTAIKRVETQHLDQLLHPQFEDPSAYK-SHVVAT
+GLPASPGAAVGQVCFSAEDAETWHAQGKSAILVRTETSPEDVGGMHAAAG
+ILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCVSGCADIRVNDDMKIFTIGDRVIKEGD
+WLSLNGTTGEVILGKQLLAPPAMSNDLEIFMSWADQARRLKVMANADTPN
+DALTARNNGAQGIGLCRTEHMFFASDERIKAVRKMIMAVTPEQRKVALDL
+LLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLEHIVNELAVDT
+GMSADEIYSKIENLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQVRAIFQAAVSM
+TN-QGVTVIPEIMVPLVGTPQELRHQISVIRGVAANVFAEMGVTLEYKVG
+TMIEIPRAALIAEEIGKEADFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLQIYLA
+QGILQHDPFEVIDQKGVGQLIKMATEKGRAANPSLKVGICGEHGGEPSSV
+AFFDGVGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQVI---V
+>F. brownii
+TTKKRVFTFGKGNSEGNKDMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTE
+ACEEYQQNGKKLPPGLWDEILEGLQYVQKEMSASLGDPSKALLLSVRSGA
+AISMPGMMDTVLNLGLNDEVVDGLAAKSG-ARFAYDSYRRFLDMFGNVVM
+GIPHSLFDEKLEQMKAEKGIHLDTDLTAADLKDLAEQYKNVYVEA-KGEK
+FPTDPKKQLELAVNAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFG
+NMGNTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQGEDVVAGIRTPEDLVTME
+TCMPEAYRELVENCVILERHYKDMMDIEFTVQENRLWMLQCRTGKRTGKG
+AVRIAVDMVNEGLIDTRTAIKRVETQHLDQLLHPQFENPSAYK-SHVVAT
+GLPASPGAAVGQVVFSAEDAETWHAQGKSAILVRTETSPEDVGGMHAAAG
+ILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCVSGCADIRVNDDMKVFTIGDRVIKEGD
+WLSLNGSTGEVILGKQLLAPPAMSNDLETFMSWADQARRLKVMANADTPN
+DALTARNNGAQGIGLCRTEHMFFASDERIKAVRKMIMAVTPEQRKAALDL
+LLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLEHIVNELTADT
+GMSKDEIYSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQVRAIFQAAVSM
+NN-QGVTVIPEIMVPLVGTPQELRHQIGVIRGVAANVFAEMGLTLEYKVG
+TMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLS
+QGILQHDPFEVLDQKGVGQLIKMATEKGRAANPNLKVGICGEHGGEPSSV
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+>Zea mays
+TTKKRVFHFGKGKSEGNKTMKELLGGKGANLAEMASIGLSVPPGFTVSTE
+ACQQYQDAGCALPAGLWAEIVDGLQWVEEYMGATLGDPQRPLLLSVRSGA
+AVSMPGMMDTVLNLGLNDEVAAGLAAKSG-ERFAYDSFRRFLDMFGNVVM
+DIPRSLFEEKLEHMKESKGLKNDTDLTASDLKELVGQYKEVYLSA-KGEP
+FPSDPKKQLELAVLAVFNSWESPRAKKYRSINQITGLRGTAVNVQCMVFG
+NMGNTSGTGVLFTRNPNTGEKKLYGEFLVNAQGEDVVAGIRTPEDLDAMK
+NLMPQAYDELVENCNILESHYKEMQDIEFTVQENRLWMLQCRTGKRTGKS
+AVKIAVDMVNEGLVEPRSAIKMVEPGHLDQLLHPQFENPSAYK-DQVIAT
+GLPASPGAAVGQVVFTAEDAEAWHSQGKAAILVRAETSPEDVGGMHAAVG
+ILTERGGMTSHAAVVARWWGKCCVSGCSGIRVNDAEKLVTIGSHVLREGE
+WLSLNGSTGEVILGKQPLSPPALSGDLGTFMAWVDDVRKLKVLANADTPD
+DALTARNNGAQGIGLCRTEHMFFASDERIKAVRQMIMAPTLELRQQALDR
+LLTYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDHPSYEFLPEGNIEDIVSELCAET
+GANQEDALARIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAIAM
+TN-QGVQVFPEIMVPLVGTPQELGHQVTLIRQVAEKVFANVGKTIGYKVG
+TMIEIPRAALVADEIAEQAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFIPVHLA
+QGILQHDPFEVLDQRGVGELVKFATERGRKARPNLKVGICGEHGGEPSSV
+AFFAKAGLDFVSCSPFRVPIARLAAAQVL---V
+>C. symbiosum
+MA-KWVYKF----EEGNASMRNLLGGKGCNLAEMTILGMPIPQGFTVTTE
+ACTEYYNSGKQITQEIQDQIFEAITWLEELNGKKFGDTEDPLLVSVRSGA
+RASMPGMMDTILNLGLNDVAVEGFAKKTGNPRFAYDSYRRFIQMYSDVVM
+EVPKSHFEKIIDAMKEEKGVHFDTDLTADDLKELAEKFKAVYKEAMNGEE
+FPQEPKDQLMGAVKAVFRSWDNPRAIVYRRMNDIPGDWGTAVNVQTMVFG
+NKGETSGTGVAFTRNPSTGEKGIYGEYLINAQGEDVVAGVRTPQPITQLE
+NDMPDCYKQFMDLAMKLEKHFRDMQDMEFTIEEGKLYFLQTRNGKRTAPA
+ALQIACDLVDEGMITEEEAVVRIEAKSLDQLLHPTF-NPAALKAGEVIGS
+ALPASPGAAAGKVYFTADEAKAAHEKGERVILVRLETSPEDIEGMHAAEG
+ILTVRGGMTSHAAVVARGMGTCCVSGCGEIKINEEAKTFELGGHTFAEGD
+YISLDGSTGKIYKGDIETQEASVSGSFERIMVWADKFRTLKVRTNADTPE
+DTLNAVKLGAEGIGLCRTEHMFFEAD-RIMKIRKMILSDSVEAREEALNE
+LIPFQKGDFKAMYKALEGRPMTVRYLDPPLHEFVPHTEEE--QAELAKNM
+GLTLAEVKAKVDELHEFNPMMGHRGCRLAVTYPEIAKMQTRAVMEAAIEV
+KEETGIDIVPEIMIPLVGEKKELKFVKDVVVEVAEQVKKEKGSDMQYHIG
+TMIEIPRAALTADAIAEEAEFFSFGTNDLTQMTFGFSRDDAGKFLDSYYK
+AKIYESDPFARLDQTGVGQLVEMAVKKGRQTRPGLKCGICGEHGGDPSSV
+EFCHKVGLNYVSCSPFRVPIARLAAAQAALNNK

misc/seq_ref_aln.fa

@@ -0,0 +1,80 @@
+>pETEV-16b-ppdk
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+ATATGACCGCTAAAAAACGCGTGTTTACGTTCGGCAAAGGTCGCTCGGAAGGCAACCGTGACATGAAATC
+GCTGCTGGGTGGCAAAGGTGCGAACCTGGCGGAAATGAGCTCTATTGGTCTGTCCGTGCCGCCGGGTCTG
+ACCATCTCAACGGAAGCCTGCGAAGAATATCAGCAAAATGGTAAATCGCTGCCGCCGGGCCTGTGGGATG
+AAATCAGCGAAGGTCTGGACTACGTTCAGAAAGAAATGTCAGCCTCGCTGGGCGATCCGTCGAAACCGCT
+GCTGCTGAGCGTCCGTTCTGGTGCGGCCATTAGCATGCCGGGCATGATGGATACCGTTCTGAACCTGGGT
+CTGAATGACGAAGTGGTTGCAGGTCTGGCCGGTAAATCGGGTGCTCGTTTCGCGTATGATAGCTACCGTC
+GCTTTCTGGACATGTTCGGTAACGTCGTGATGGGCATCCCGCATAGCCTGTTTGATGAAAAACTGGAACA
+GATGAAAGCCGAAAAAGGTATTCACCTGGATACCGACCTGACGGCAGCTGATCTGAAAGACCTGGTGGAA
+AAATATAAAAACGTTTACGTCGAAGCGAAAGGCGAAAAATTCCCGACCGATCCGAAAAAACAGCTGGAAC
+TGGCCGTCAATGCAGTGTTTGATAGTTGGGACTCCCCGCGTGCCAACAAATATCGCTCCATTAATCAGAT
+CACCGGTCTGAAAGGCACGGCAGTGAATATTCAATCTATGGTTTTCGGTAACATGGGCAATACCAGTGGC
+ACGGGTGTGCTGTTTACCCGTAACCCGAGCACGGGCGAGAAAAAACTGTACGGCGAATTCCTGATTAATG
+CCCAGGGTGAAGATGTTGTCGCAGGCATCCGCACCCCGGAAGATCTGGGTACCATGGAAACGTGCATGCC
+GGAAGCGTATAAAGAACTGGTGGAAAACTGTGAAATTCTGGAACGTCATTACAAAGATATGATGGACATC
+GAATTCACCGTTCAGGAAAATCGCCTGTGGATGCTGCAATGTCGTACCGGTAAACGCACGGGCAAAGGTG
+CTGTGCGTATTGCGGTTGATATGGTCAACGAAGGCCTGATTGACACCCGTACGGCAATCAAACGCGTTGA
+AACCCAGCATCTGGATCAACTGCTGCACCCGCAGTTCGAAGACCCGTCAGCGTATAAATCGCATGTGGTT
+GCCACCGGTCTGCCGGCATCCCCGGGTGCAGCAGTGGGCCAGGTTTGCTTTTCAGCTGAAGATGCGGAAA
+CGTGGCACGCTCAGGGTAAATCCGCGATCCTGGTGCGCACCGAAACGTCACCGGAAGATGTTGGCGGTAT
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+TGGGGTAAATGCTGTGTCTCAGGTTGTGCGGATATCCGTGTGAACGATGACATGAAAATCTTCACCATCG
+GTGATCGCGTGATCAAAGAAGGCGACTGGCTGAGCCTGAACGGTACCACGGGCGAAGTTATTCTGGGTAA
+ACAGCTGCTGGCACCGCCGGCAATGTCTAATGATCTGGAAATCTTTATGAGTTGGGCTGACCAGGCGCGT
+CGCCTGAAAGTGATGGCTAACGCGGATACCCCGAATGACGCCCTGACGGCACGTAACAATGGTGCACAGG
+GTATTGGTCTGTGCCGTACCGAACACATGTTTTTCGCTTCTGATGAACGTATTAAAGCGGTCCGCAAAAT
+GATCATGGCCGTGACGCCGGAACAGCGTAAAGTTGCTCTGGATCTGCTGCTGCCGTATCAACGTAGTGAC
+TTTGAAGGTATTTTCCGCGCAATGGATGGCCTGCCGGTGACCATCCGTCTGCTGGATCCGCCGCTGCATG
+AATTTCTGCCGGAAGGTGATCTGGAACACATTGTTAACGAACTGGCAGTCGATACGGGCATGAGCGCTGA
+CGAAATCTACTCTAAAATCGAAAACCTGAGTGAAGTTAATCCGATGCTGGGTTTCCGTGGCTGTCGCCTG
+GGTATTTCGTACCCGGAACTGACCGAAATGCAGGTTCGTGCCATCTTTCAAGCTGCGGTCAGCATGACCA
+ACCAGGGTGTGACGGTTATTCCGGAAATCATGGTCCCGCTGGTTGGCACCCCGCAGGAACTGCGTCACCA
+AATTTCTGTTATCCGCGGCGTCGCCGCAAATGTGTTTGCGGAAATGGGTGTCACCCTGGAATATAAAGTG
+GGCACGATGATTGAAATCCCGCGTGCTGCGCTGATTGCGGAAGAAATCGGTAAAGAAGCCGATTTCTTTA
+GCTTTGGCACCAACGACCTGACCCAGATGACGTTCGGTTATAGTCGCGATGACGTGGGCAAATTTCTGCA
+AATTTACCTGGCCCAGGGTATCCTGCAACATGATCCGTTTGAAGTTATTGACCAGAAAGGCGTCGGTCAA
+CTGATCAAAATGGCAACCGAAAAAGGCCGCGCCGCAAATCCGAGTCTGAAAGTGGGTATTTGCGGCGAAC
+ACGGCGGTGAACCGAGTTCCGTGGCGTTTTTCGATGGCGTTGGTCTGGACTACGTTAGTTGTTCCCCGTT
+TCGTGTCCCGATTGCCCGTCTGGCTGCCGCCCAAGTGATTGTTTAACTCGAGGATCC
+>FtPPDK-ref
+ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCATGAAAACCTGTATTTTCAGGGAC
+ATATGACCGCTAAAAAACGCGTGTTTACGTTCGGCAAAGGTCGCTCGGAAGGCAACCGTGACATGAAATC
+GCTGCTGGGTGGCAAAGGTGCGAACCTGGCGGAAATGAGCTCTATTGGTCTGTCCGTGCCGCCGGGTCTG
+ACCATCTCAACGGAAGCCTGCGAAGAATATCAGCAAAATGGTAAATCGCTGCCGCCGGGCCTGTGGGATG
+AAATCAGCGAAGGTCTGGACTACGTTCAGAAAGAAATGTCAGCCTCGCTGGGCGATCCGTCGAAACCGCT
+GCTGCTGAGCGTCCGTTCTGGTGCGGCCATTAGCATGCCGGGCATGATGGATACCGTTCTGAACCTGGGT
+CTGAATGACGAAGTGGTTGCAGGTCTGGCCGGTAAATCGGGTGCTCGTTTCGCGTATGATAGCTACCGTC
+GCTTTCTGGACATGTTCGGTAACGTCGTGATGGGCATCCCGCATAGCCTGTTTGATGAAAAACTGGAACA
+GATGAAAGCCGAAAAAGGTATTCACCTGGATACCGACCTGACGGCAGCTGATCTGAAAGACCTGGTGGAA
+AAATATAAAAACGTTTACGTCGAAGCGAAAGGCGAAAAATTCCCGACCGATCCGAAAAAACAGCTGGAAC
+TGGCCGTCAATGCAGTGTTTGATAGTTGGGACTCCCCGCGTGCCAACAAATATCGCTCCATTAATCAGAT
+CACCGGTCTGAAAGGCACGGCAGTGAATATTCAATCTATGGTTTTCGGTAACATGGGCAATACCAGTGGC
+ACGGGTGTGCTGTTTACCCGTAACCCGAGCACGGGCGAGAAAAAACTGTACGGCGAATTCCTGATTAATG
+CCCAGGGTGAAGATGTTGTCGCAGGCATCCGCACCCCGGAAGATCTGGGTACCATGGAAACGTGCATGCC
+GGAAGCGTATAAAGAACTGGTGGAAAACTGTGAAATTCTGGAACGTCATTACAAAGATATGATGGACATC
+GAATTCACCGTTCAGGAAAATCGCCTGTGGATGCTGCAATGTCGTACCGGTAAACGCACGGGCAAAGGTG
+CTGTGCGTATTGCGGTTGATATGGTCAACGAAGGCCTGATTGACACCCGTACGGCAATCAAACGCGTTGA
+AACCCAGCATCTGGATCAACTGCTGCACCCGCAGTTCGAAGACCCGTCAGCGTATAAATCGCATGTGGTT
+GCCACCGGTCTGCCGGCATCCCCGGGTGCAGCAGTGGGCCAGGTTTGCTTTTCAGCTGAAGATGCGGAAA
+CGTGGCACGCTCAGGGTAAATCCGCGATCCTGGTGCGCACCGAAACGTCACCGGAAGATGTTGGCGGTAT
+GCATGCAGCTGCGGGCATTCTGACCGCACGTGGCGGTATGACGTCCCACGCAGCAGTCGTGGCTCGCGGC
+TGGGGTAAATGCTGTGTCTCAGGTTGTGCGGATATCCGTGTGAACGATGACATGAAAATCTTCACCATCG
+GTGATCGCGTGATCAAAGAAGGCGACTGGCTGAGCCTGAACGGTACCACGGGCGAAGTTATTCTGGGTAA
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+CGCCTGAAAGTGATGGCTAACGCGGATACCCCGAATGACGCCCTGACGGCACGTAACAATGGTGCACAGG
+GTATTGGTCTGTGCCGTACCGAACACATGTTTTTCGCTTCTGATGAACGTATTAAAGCGGTCCGCAAAAT
+GATCATGGCCGTGACGCCGGAACAGCGTAAAGTTGCTCTGGATCTGCTGCTGCCGTATCAACGTAGTGAC
+TTTGAAGGTATTTTCCGCGCAATGGATGGCCTGCCGGTGACCATCCGTCTGCTGGATCCGCCGCTGCATG
+AATTTCTGCCGGAAGGTGATCTGGAACACATTGTTAACGAACTGGCAGTCGATACGGGCATGAGCGCTGA
+CGAAATCTACTCTAAAATCGAAAACCTGAGTGAAGTTAATCCGATGCTGGGTTTCCGTGGCTGTCGCCTG
+GGTATTTCGTACCCGGAACTGACCGAAATGCAGGTTCGTGCCATCTTTCAAGCTGCGGTCAGCATGACCA
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+TCGTGTCCCGATTGCCCGTCTGGCTGCCGCCCAAGTGATTGTTTAACTCGAGGATCC