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\addchap{Abkürzungsverzeichnis}
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\begin{acronym}[F. trinervia]
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\begin{acronym}[C. symbiosum]
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\setlength{\itemsep}{-\parsep}
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\acro{2YT}{\textit{2x Yeast extract and Tryptone} (engl.)}
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\acro{3PGAK}{3-Phosphoglycerat Kinase}
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\acro{AA/BAA}{Acrylamid/Bisacrylamid}
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\acro{ADP}{Adenosindiphosphat}
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\acro{AK}{Adenylatkinase}
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\acro{AMP}{Adenosinmonophosphat}
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\acro{APS}{Ammoniumperoxodisulfat}
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\acro{ATP}{Adenosintriphosphat}
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%\acro{KH2PO4}[\ce{KH2PO4}]{Kaliumdihydrogenphosphat}
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%\acro{MgCl2}[\ce{MgCl2}]{Magnesiumchlorid}
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%\acro{MgSO4}[\ce{MgSO4}]{Magnesiumsulfat}
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\acro{MDH}{Malatdehydrogenase}
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\acro{ME}{Malatenzym}
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\acro{MW}{Molekulargewicht}
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\acro{NADH}{Nicotinamidadenindinukleotid}
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\acro{NAD-MDH}{NAD-abhängige Malatdehydrogenase}
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%\acro{NaHCO3}[\ce{NaHCO3}]{Natriumhydrogencarbonat}
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\acro{p. a.}{\textit{pro analysi}~(lat.)}
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\acro{PAGE}{Polyacrylamidgelelektrophorese}
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\acro{PCR}{Polymerase-Kettenreaktion}
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\acro{PDRP}{PPDK regulierendes Protein}
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\acro{PEP}{Phosphoenolpyruvat}
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\acro{PEPCase}{Phosphoenolpyruvat-Carboxylase}
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\acro{PFK}{Phosphofruktokinase}
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\acro{PMSF}{Phenylmethylsulfonylfluorid}
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\acro{PPDK}{Pyruvat-Phosphat Dikinase}
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\acro{rcf}{\textit{relative centrifugal force}~(engl.)}
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\acro{RuBisCO}{Ribulose"=1,5"=bisphosphat"=carboxylase/"=oxygenase}
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\acro{SDS}{Natriumdodecylsulfat}
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\acro{SLIC}{Sequenz und Ligase unabhängige Klonierung}
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\acro{SOPMA}{\textit{Self-optimized prediction method}~(engl.)}
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\selectlanguage{english}
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\addchap{Abstract}
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<Abstract>
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\selectlanguage{ngerman}
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\acs{C. symbiosum}. Sequenzidentitäten sind farbkodiert dargestellt: \SI{100}{\percent} Identität (violett), \SI{75}{\percent} (blau) und
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\SI{50}{\percent} (rosa).}
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\shortcaption{Multiples Alignment der Primärstrukturen verschiedener PPDKs}
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\label{abb:ma}
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\end{texshade}
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\microtypesetup{protrusion=true}
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\clearpage
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\section{Evalutation der Homologiemodelle}
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\includegraphics[height=0.5\textheight,keepaspectratio=true]{./img/anhang/FtPPDK_Zm.eps}
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% FtPPDK_Zm.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=0 -1 474 638
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\caption{Ramachandran-Plot des von \textit{Zea mays} abgeleiteten Homologiemodells}
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\label{abb:ramachandran_Zm}
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\end{figure}
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\includegraphics[height=0.5\textheight,keepaspectratio=true]{./img/anhang/FtPPDK_Cs.eps}
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% FtPPDK_Cs.svg: 765x990 pixel, 72dpi, 26.99x34.92 cm, bb=0 0 765 990
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\caption{Ramachandran-Plot des von \acs{C. symbiosum} abgeleiteten Homologiemodells}
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\label{abb:ramachandran_Cs}
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\end{figure}
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\chapter{Erklärung}
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Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Masterarbeit selbstständig verfasst und keine anderen, als die angegebenen Quellen und
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\chapter{Diskussion}
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\chapter{Diskussion}
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\section{Expression und Reinigung der \acs{PPDK}}
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Die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} konnte erfolgreich in \acs{E. coli} BL21 (DE3) exprimiert werden. Sowohl in einer vierstündigen Expression,
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als auch in einer Expression über Nacht zeigten sich in der differentiellen Zentrifugation nur geringe unlösliche Anteile, gemessen an der
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Gesamtmenge Protein (vgl. \ref{sec:ergebnisse_dz}). Dies spricht dafür, dass nur in geringem Maße \textit{Inclusion Bodies} gebildet wurden und legt die
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Vermutung nahe, das der lösliche Proteinanteil nativ gefaltet ist.
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Dies konnte durch die \acs{CD}-Spektroskopie gestützt werden. Es konnten Sekundärstrukturanteile nachgewiesen werden, welche sich mit
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Sequenz basierten \textit{ab initio} Vorhersagen, sowie bekannten Strukturdaten decken (vgl. Tabelle \ref{tab:cd}). In einem letzten Schritt konnte die tatsächlich funktionelle
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Faltung der rekombinanten \acs{PPDK} in einem Aktivitätsassay gezeigt werden.
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Im Rahmen der Reinigung konnten mit steigender Imidazolkonzentration insgesamt drei Fraktionen \acs{PPDK} gewonnen werden, die eine jeweils hohe Reinheit aufweisen (vgl. \ref{abb:reinigung_sds} und sich
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durch ihre Dispersität unterscheiden (siehe Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}). Der Oligomerisierungsgrad beeinflusst offenbar die Bindungsaffinität der \acs{PPDK} an die Säule,
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was zu einem unterschiedlichen Elutionsverhalten führt. Ursächlich könnte eine zunehmende Maskierung des Hexa-Histidin-Tags in den Oligomeren sein. Eine zuverlässige Größenzuordnung
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konnte in der Größenausschluschromatographie aufgrund der sehr eng zusammen liegenden Elutionsvolumina nicht vorgenommen werden. Es konnte aber gezeigt werden, dass
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die bei \SI{250}{\milli\Molar} gewonnene Fraktion monodispers vorliegt und sich somit gut für zukünftige Kristallisationsexperimente eignet.
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Die Proteinausbeute liegt -- betrachtet man nur die monodispers gereinigte Fraktion -- bei etwa \SI{47}{\milli\gram\per\liter} Kulturmedium und ist somit als
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hoch einzuschätzen. Der in der Literatur beschriebene Effekt der ausgeprägten Kältelabilität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Burnell1990},
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welcher zum Zerfall der funktionellen Tetramere in Monomere führt, ließe sich unter Umständen zur Erhöhung der effektiv nutzbaren Ausbeute einsetzen. Durch eine
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Vereinigung aller gereinigter PPDK-Fraktionen und anschließender Kältebehandlung sollte zu einer einheitlichen Population der PPDK-Monomere führen. Die Ausbeute
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beträgt dann etwa \SI{118}{\milli\gram\per\liter} Kultur.
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\section{Aktivität der gereinigten PPDK}
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Die spezifische Aktivität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} liegt mit \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram} in der \acs{PEP}-bildenden Richtung in der Größenordnung
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von Literaturwerten für \textit{Zea mays} \citep{Hatch1975}. In ähnlicher Weise stimmen auch die bestimmten \ce{K_m}-Werte für ATP \SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} und
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Pyruvat \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar} mit bekannten Literaturwerten von \textit{Zea mays} und \textit{F. brownii} überein \citep{Hatch1975,Ohta1997}, die ebenfalls
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im zwei- bis dreistelligen mikromolaren Bereich liegen. Ein Vergleich der experimentellen Daten mit Literaturwerten ist in Tabelle \ref{tab:literatur} aufgeführt.
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\begin{threeparttable}
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\caption[Vergleich der kinetischen Parameter mit Literaturwerten]{Vergleich der kinetischen Parameter mit Literaturwerten der PPDK aus \textit{F. bidentis}, \textit{F. brownii} und \textit{Zea mays}.
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Die Literaturwerte beziehen sich jeweils auf die \acs{PEP}-bildende Reaktion.}
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\label{tab:literatur}
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\begin{tabular}{llll}
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\toprule
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\multirow{2}{*}{\textbf{Spezies}} & \multicolumn{2}{c}{\textbf{\ce{K_m} [\si{\micro\Molar}]}} & \multirow{2}{*}{\textbf{spez. Aktivität [\si{\Unit\per\milli\gram}]}} \\
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& \textbf{ATP} & \textbf{Pyruvat} & \\
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\midrule
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\acs{F. trinervia} & \num[seperr]{50(9)} & \num[seperr]{270(44)} & \num[seperr]{ 0,99(9)} \\
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\midrule
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\textit{F. bidentis} & 25\tnote{2} & 73\tnote{2} & \\
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\textit{F. brownii} & 88\tnote{2} & 67\tnote{2} & \\
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\textit{Zea mays} & 95\tnote{2} & 158\tnote{2} & 1,2\tnote{1} \\
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\bottomrule
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\end{tabular}
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\begin{tablenotes}
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\item[1] \citet{Hatch1975}
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\item[2] \citet{Ohta1997}
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\end{tablenotes}
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\end{threeparttable}
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\end{table}
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\ce{V_{max}} wurde im Rahmen der nichtlinearen Regression für \acs{ATP} und Pyruvat bestimmt. Unter Berücksichtigung der Standardabweichung sind die beiden Werte
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-- \SI[seperr]{0,095(5)}{\milli\Molar\per\minute} (ATP) und \SI[seperr]{0,093(5)}{\milli\Molar\per\minute} (Pyruvat) -- als identisch anzusehen. Dies entspricht der
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Erwartung, da die maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung in beiden Fällen identisch sein sollte.
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Der beobachtete Abfalls der gemessenen Reaktionsgeschwindigkeit bei einer \acs{ATP}-Konzentration von \SI{2,5}{\milli\Molar} (Abbildung \ref{abb:kinetik_atp}) ist auf
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die inhibitorische Wirkung von \acs{ATP}, \acs{ADP} und \acs{AMP} auf die als letzte Stufe des gekoppelten Enzymassays eingesetzte \acs{MDH} zurückzuführen \citep{Harris}. Bei einer \acs{ATP}-Konzentration
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von \SI{2,5}{\milli\Molar} ist nicht mehr die Pyruvat-Bildung durch die \acs{PPDK}, sondern die Umsetzung des Oxalacetats durch die \acs{MDH} der geschwindigkeitsbestimmende Schritt.
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Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Aktivität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} in etwa vergleichbar mit anderen bekannten PPDKs ist.
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\section{Homologiemodelle}
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Die erstellten Homologiemodelle weisen nach einer Analyse mit PROCHECK keine auffälligen Anomalien auf, so dass die Modelle als hinreichend korrekt angesehen werden können.
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Da die \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} zudem eine hohe Sequenzidentität von \SI{79}{\percent} zur \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} aufweist, bietet das hierauf basierende
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Modell eine gute Annäherung an die tatsächliche dreidimensionale Struktur der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}, insbesondere in Hinblick auf die räumliche Ausrichtung
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der Seitenketten in der \acs{PEP}-Bindetasche. In Kombination mit der Identifikation hoch konservierter Sequenzabschnitte können einige für die \acs{PEP}-Bindung und
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Umsetzung wichtige Reste identifiziert werden \citep{Nakanishi2005}: Arg562, Arg619, Arg669, Glu748, Asp772 und Asn771, sowie Cys834, welches als Protonen-Donor fungiert (Abbildung \ref{abb:substratbindetasche}).
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Durch gezielte Mutation dieser Reste kann in zukünftigen Experimenten ihr Einfluss auf die Aktivität und Stabilität der \acs{PPDK} untersucht werden.
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\section{Ausblick}
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Die im Rahmen dieser Arbeit gereinigte \acs{PPDK} liegt in hoher Konzentration, monodispers und hoher Reinheit vor, so dass sie in Kristallisationsexperimente eingesetzt
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werden kann. Eine erfolgreiche Kristallisation ist dann notwendig für die Strukturaufklärung mittels Röntgenkristallographie. Zusätzlich können anhand der erstellten
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Homologiemodelle \textit{in silico} Analysen durchgeführt werden. Beispielsweise kann nach Bindetaschen für Effektoren gesucht werden, welche das \textit{Domain-Swiveling}
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in distinkten Zwischenstadien halten. Sobald Kristallisationsbedingungen für die wildtypische Form etabliert sind, können diese für die Co-Kristallisation mit den gefundenen
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Effektoren adaptiert werden. Letztere können darüber hinaus direkt mit Hilfe des etablierten Aktivitätsassays auf ihren Einfluss auf die \acs{PPDK}-Aktivität hin untersucht werden.
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Aus den resultierenden Strukturdaten ließen sich dann intermediäre Konformationen ableiten, die zu einem genaueren Verständnis der Funktionalität
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der \acs{PPDK} führen können. Mittels einer Netzwerkanalyse ließen sich zusätzlich Regionen innerhalb der \acs{PPDK} identifizieren, welche für die Flexibilität der zentralen
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Phospho"=Histidin"=Domäne verantwortlich sind. Hier bietet sich ein weiterer Ansatzpunkt um beispielsweise über \textit{Cross-Linking} Zwischenkonformationen zu stabilieren.
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\chapter{Einleitung}
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\chapter{Einleitung}
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Die \acl{PPDK} (PPDK, EC 2.7.9.1) gehört zur Enzymklasse der Phosphotransferasen (Kinasen) und katalysiert die frei reversible Reaktion:
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\begin{equation*}
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\ce{\text{Pyruvat} + \text{ATP} + \text{Pi} <=> \text{PEP} + \text{AMP} + \text{PPi}}
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\end{equation*}
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Erstmals beschrieben wurde die \acs{PPDK} von \citet{Slack1968,Reeves1968} in tropischen Gräsern und der parasitären Amöbe
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\textit{Entamoeba histolytica} \citep{Chastain2011}. Strukturdaten der \acs{PPDK} sind verfügbar aus \textit{Clostridium symbiosum} \citep{Herzberg1996}, \textit{Zea mays} \citep{Nakanishi2005} und \textit{Trypanosomas brucei} \citep{Cosenza2002}.
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\section{Strukturelle Funktionalität der \acs{PPDK}}
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Die \acs{PPDK} kann in drei Domänen unterteilt werden:
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\begin{enumerate}
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\item \acs{PEP}/Pyruvat-Bindedomäne
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\item Nukleotid-Bindedomäne
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\item Zentrale Phosphohistidin-Domäne
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\end{enumerate}
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\begin{figure}[H]
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\centering
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\includegraphics[height=0.7\textheight,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/ppdk_1vbh.png}
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% ppdk_1vbh.png: 2480x4004 pixel, 300dpi, 21.00x33.90 cm, bb=0 0 595 961
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\caption[Struktur der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays}]{Struktur der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBH). Farblich abgesetzt sind die Nukleotid-Bindedomäne (grün), \acs{PEP}/Pyruvat-Bindedomäne (blau) mit dem Substra \acs{PEP} und einem \ce{Mg2+}-Ion, die Phosphohistidin-Domäne (gelb), sowie die Linker-Peptide(rot). Der katalytische Rest His458 ist durch einen Pfeil hervorgehoben. Die Überlagerung (grau) zeigt die \acs{PPDK} aus \acs{C. symbiosum} (PDB: 1KBL). Das katalytische His455 ist ebenfalls durch einen Pfeil markiert. Es zeigt sich die Torsionsbewegung der zentralen Phosphohistidindomäne.}
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\label{abb:swivel_domain}
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\end{figure}
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Verknüpft sind die genannten Domänen über flexible Linker-Peptide. Der Abstand zwischen der Nukleotid-Bindedomäne und der \acs{PEP}/Pyruvat-Bindedomäne beträgt etwa \SI{50}{\angstrom}, so dass eine direkte Interaktion der Substrate mit dem katalytisch
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aktiven Histidinrest in der zentralen Phosphohistidin-Domäne nicht möglich ist. Daher wurde ein so genannter \textit{Domain-Swiveling}-Mechanismus vorgeschlagen, der eine Torsionsbewegung der Phosphohistidin-Domäne postuliert, wodurch die Übertragung der Phosphatgruppen ermöglicht wird \citep{Herzberg1996,Nakanishi2005}. Das Ausmaß dieser Domänenbewegung ist bei Überlagerung der \acs{PEP}-gebundenen Struktur aus \textit{Zea mays} und der ungebundenen Struktur aus \acs{C. symbiosum} (Abbildung \ref{abb:swivel_domain}).
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\section{Funktion in $\text{C}_\text{4}$-Pflanzen}
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Am besten untersucht ist die Funktion der \acs{PPDK} in \ce{C_4}"=Pflanzen. In \ce{C_3}-Pflanzen limitiert die Oxygenase-Aktivität der \ac{RuBisCO} die Effizienz
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der Photosynthese bei warmen Umgebungstemperaturen oder bei Wasserstress. Bei den genannten Bedingungen werden die Spaltöffnungen der Blätter geschlossen um
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den Wasserverlust durch Verdunstung zu minimieren. Durch das Schließen der Spaltöffnungen wird aber auch die Diffusion von \ce{CO2} in das Blatt vermindert. Die resultierende Absenkung der \ce{CO2}-Konzentration in den photosynthetisch aktiven Zellen führt zu einer Begünstigung der zur \ce{CO2}-Fixierung konkurrierenden Oxygenaseaktivität der \ac{RuBisCO} \citep{Sharkey1989,Cornic2000,Lawlor2002}. Durch die Fixierung von \ce{O2} statt \ce{CO2} wird entsteht als Zwischenprodukt 2-Phosphoglycolat, welches nicht im Calvin-Zyklus verstoffwechselt werden kann und unter zusätzlichem Energieverbrauch über die Photorespiration in 3-Phosphoglycerat umgesetzt wird.
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Die \ce{C_4}"=Kohlenstofffixierung umgeht dieses Problem durch eine räumliche Trennung von \ce{CO2}-Fixierung und Calvin-Zyklus. Hierdurch kann \ce{CO2} konzentriert werden, was der \acs{RuBisCO} eine \ce{CO2} reiche Umgebung zur Verfügung stellt. Hierdurch wird die Oxygenaseaktivität stark reduziert.
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Die \acs{PPDK} ist hierbei im Stroma der Chloroplasten der Mesophyllzellen lokalisiert und katalysiert dort die Regeneration des primären \ce{CO2}-Akzeptors \ac{PEP} \citep{Hatch2002}.
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\begin{figure}[H]
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\centering
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\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/C4_photosynthesis_NADP-ME_type.eps}
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% C4_photosynthesis_NADP-ME_type.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=0 -1 713 233
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\caption[\ce{C_4}"-Kohlenstofffixierung]{\ce{C_4}"-Kohlenstofffixierung nach dem NADP-\acs{ME} Mechanismus. Dargestellt sind eine Mesophyllzelle (links) und eine Bündelscheidezelle (rechts), sowie die Chloroplasten (grün). \ce{CO2} wird auf \ac{PEP} übertragen, welches in Malat umgewandelt und in die Bündelscheidezelle transportiert wird. Dort wird \ce{CO2} abgespalten und das entstandene Pyruvat zurück in die Chloroplasten der Mesophyllzelle transportiert, wo \ac{PEP} durch die \acs{PPDK} aus Pyruvat regeneriert wird. \citep{Raghavendra2011}}
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\label{abb:c4_cycle}
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\end{figure}
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Es existieren unterschiedliche Varianten der \ce{C_4}"=Kohlenstofffixierung, welche sich in drei Punkten voneinander unterscheiden \citep{Raghavendra2011}:
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\begin{enumerate}
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\item Dem \ce{C_4}-Körper, der aus den Mesophyllzellen exportiert wird (Malat oder Aspartat)
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\item Dem \ce{C_3}-Körper, der aus den Bündelscheidezellen zurück in die Mesophyllzellen transportiert wird (Pyruvat oder Alanin)
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\item Dem zur Decarboxylierung in den Bündelscheidezellen verwendetem Enzym (NADP- bzw. NAD-abhängiges Malatenzym oder \ac{PEP}-Carboxykinase)
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\end{enumerate}
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Abbildung \ref{abb:c4_cycle} illustriert die \ce{C_4}"=Kohlenstofffixierung mit Malat als \ce{C_4}-Körper, Pyruvat als \ce{C_3}-Körper und einem NADP-abhängigen Malatenzym, wie sie beispielsweise von Mais oder Zuckerrohr bekannt ist. Allen Varianten gemein ist die zentrale Rolle der \acs{PPDK} bei der Regeneration des primären \ce{CO2}-Akzeptors \ac{PEP}.
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\begin{figure}[H]
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\centering
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\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/aktivierung.png}
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% aktivierung.png: 716x259 pixel, 72dpi, 25.26x9.14 cm, bb=0 0 716 259
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\caption[Lichtabhängige Aktivierung der PPDK]{Lichtabhängige Aktivierung der PPDK durch reversible Phosphorylierung eines Threoninrestes \citep{Chastain2011}.}
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\label{abb:aktivierung_ppdk}
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\end{figure}
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Die Regulation der \acs{PPDK} erfolgt lichtabhängig durch das \ac{PDRP} über die Phosphorylierung eines Threonin-Restes (vgl. Abbildung \ref{abb:aktivierung_ppdk}) im aktiven Zentrum \citep{Burnell1985,Burnell2006,Chastain2011}.
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\section{Funktion in $\text{C}_\text{3}$-Pflanzen}
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Über die Funktion der \acs{PPDK} in \ce{C_3}-Pflanzen liegen weitaus weniger gesicherte Erkenntnisse vor. Die \acs{PPDK} kann ubiquitär in Geweben aus \ce{C_3}-Pflanzen nachgewiesen werden, liegt dort aber meist nur in sehr geringen Konzentrationen vor \citep{Chastain2003}. Dies erschwert die biochemische Charakterisierung von \acs{PPDK}s aus \ce{C_3}-Pflanzen \textit{in vivo}, da die Umsetzung der Substrate, sowie die Produktbildung nicht zuverlässig verfolgt werden können. Zudem wird der Substratumsatz durch konkurrierende Reaktionen der Pyruvat-Kinase und \acs{PEP}-Carboxykinase maskiert \citep{Chastain2011}. \textit{Knock-out} Linien von \textit{Arabidopsis thaliana} zeigen keinen veränderten Phänotyp, so dass auch hierüber eine Aussage über die Funktion der \acs{PPDK} in \ce{C_3}-Pflanzen nicht möglich ist \citep{Chastain2011}.
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Untersuchungen an Mais-Samen, in denen die \acs{PPDK} in hohem Maße im Cytoplasma des Endosperms exprimiert wird legen allerdings eine Funktion als ergänzendes Enzym der Glykolyse nahe \citep{Kang2005,Hennen-Bierwagen2009}. Es wurde postuliert, dass die \acs{PPDK} durch die von ihr katalysierte, frei reversible Reaktion den Kohlenstofffluss zwischen verschiedenen Biosynthesewegen
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ausgleicht \citep{Hennen-Bierwagen2009} und \acs{ATP} in hypoxischen Bereichen des Endosperms zur Verfügung stellt \citep{Chastain2006}.
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\section{Funktion in nicht-pflanzlichen Organismen}
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Die \acs{PPDK} wurde in einigen Archäen, Protozoen und Baterien gefunden, welche in sauerstoffarmen Habitaten leben. Die \acs{PPDK} hat in diesen Organismen die Rolle eines primären oder sekundären Enzyms der Glykolyse. Die freie Reversibilität der katalysierten
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Reaktion erlaubt sowohl die Synthese von \acs{ATP}, als auch die Bildung von \ac{PEP} im Rahmen der Gluconeogenese \citep{Chastain2011}.
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\begin{figure}[H]
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\centering
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\includegraphics[width=0.6\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/ppdk_glycolysis.eps}
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% ppdk_glycolysis.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=0 -1 536 475
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\caption[Einfluss der \acs{PPDK} auf die glykolytische ATP-Ausbeute]{Einfluss der \acs{PPDK} auf die glykolytische ATP-Ausbeute. Durch das Zusammenspiel zwischen \ac{AK} und \ac{PPDK} können im Vergleich zur konventionellen Glykolyse drei zusätzliche Moleküle \acs{ATP} je Glukosemolekül gewonnen werden.}
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\label{abb:glykolyse}
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\end{figure}
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Durch synergetische Effekte zwischen \acl{AK} und \ac{PPDK} kann die \acs{ATP}-Ausbeute von drei Molekülen \acs{ATP} je Molekül Glukose auf fünf Moleküle \acs{ATP} erhöht werden (Abbildung \ref{abb:glykolyse}). Hierbei kann die Bindungsenergie von Pyrophosphat durch die \acs{PPDK} zum Aufbau von \acs{ATP} aus \acs{AMP} genutzt werden \citep{Huang2008}. Die Reaktion läuft dabei in die Pyruvat-formende Richtung ab.
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\section{Kälteinaktivierung}
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Eine besondere Eigenschaft der \acs{PPDK} ist die Kälteinaktivierung. Die funktionelle Form ist ein Tetramer, welches bei Temperaturen unterhalb von \SI{10}{\celsius} in inaktive Di- und Monomere zerfällt \citep{Slack1968,Shirahashi1978,Burnell1990}.
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Bei der experimentellen Arbeit mit der \acs{PPDK} ergibt sich hieraus die Problematik, dass alle Arbeitsschritte bei Raumtemperatur
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durchgeführt werden müssen, was aber die Anfälligkeit für die Degradierung durch im Zelllysat enthaltene Proteasen erhöht. Durch Erwärmen auf \SI{30}{\celsius} ist allerdings eine weitgehende Reaktivierung zu erreichen \citep{Burnell1985}.
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Die Kältesensitivität ist zwischen verschiedenen Spezies unterschiedlich stark ausgeprägt. Innerhalb der Gattung \textit{Flaveria} weist die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} die höchste Sensitivität auf (vgl. Abbildung \ref{abb:cold_lability}): Nach einer \SI{30}{\minute} Inkubation bei \SI{0}{\celsius} konnte eine Restaktivität von lediglich \SI{10}{\percent} beobachtet werden. Die \acs{PPDK} aus \acs{F. brownii} wies nach der Kältebehandlung eine Restaktivität von \SI{80}{\percent} auf \citep{Burnell1990}.
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\begin{figure}[H]
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\centering
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\includegraphics[width=0.6\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/einleitung/cold_lability.png}
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% cold_lability.png: 470x467 pixel, 96dpi, 12.43x12.35 cm, bb=0 0 352 350
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\caption[Kälteinaktivierung der \acs{PPDK}]{Kälteinaktivierung der \acs{PPDK}. Aufgetragen ist die Restaktivität in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer bei \SI{0}{\celsius}. Die Restaktivität der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} beträgt nach \SI{30}{\minute} lediglich \SI{10}{\percent} \citep{Burnell1990}.}
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\label{abb:cold_lability}
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\end{figure}
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Durch Sequenzanalysen konnten gezeigt werden, dass nur wenige Aminosäurereste die Kältesensitivität stark beeinflussen \citep{Ohta1997}. Darüberhinaus kann durch Zusatz von Glycerin und reduzierenden Agenzien wie \acs{DTT} die Aktivität zu einem Großteil erhalten bleiben \citep{Shirahashi1978}.
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\section{Zielsetzung}
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Die \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} wurde bereits heterolog in \acs{E. coli} exprimiert \citep{Chastain1996,Nakanishi2003} und gereinigt. Ebenfalls etabliert ist ein photometrischer Aktivitätsassay über die \acs{PEP}-Carboxylase und die Malatdehydrogenase \citep{Jenkins1985,Salahas1990}.
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Auf diesen Ergebnissen aufbauend war es Ziel dieser Arbeit, ein Expressions- und Reinigungsprotokoll für die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} zu etablieren, sowie nachzuweisen, dass das gereinigte Enzym funktionell gefalten ist. Darüber hinaus sollten Homologiemodelle erstellt werden, um im Vorfeld zukünftiger Experimente die Identifikation funktionell und strukturell bedeutender Reste zu ermöglichen.
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@ -5,8 +5,9 @@
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\label{sec:erg_klonierung}
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Sie \acs{SLIC}-Klonierung erfolgte wie in \ref{sec:slic} beschrieben. Die mittels \acs{PCR} synthetisierten \textit{Inserts}
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(vgl.~\ref{sec:inserts_slic}), sowie der linearisierte Vektor (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}) wurden auf ein zur Reinigung auf
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Agarosegel aufgetragen (vgl. \ref{sec:agarose_gelelektrophorese}). Es ergab sich das in Abbildung \ref{abb:agarosegel_vektor_insert} gezeigte Auftrennungsmuster.
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(vgl.~\ref{sec:inserts_slic}), sowie der linearisierte Vektor (vgl.~\ref{sec:restriktionsverdau_dna}) wurden zur Reinigung auf ein
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Agarosegel aufgetragen (vgl. \ref{sec:agarose_gelelektrophorese}). Es ergab sich das in Abbildung \ref{abb:agarosegel_vektor_insert} gezeigte
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Auftrennungsmuster.
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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@ -35,7 +36,7 @@ Agarosegel aufgetragen (vgl. \ref{sec:agarose_gelelektrophorese}). Es ergab sich
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\label{abb:agarosegel_vektor_insert}
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\end{figure}
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Sowohl Vektor als auch Insert lagen innerhalb der erwarteten Größenordnung (\SI{5720}{\bp} bzw. \SI{2691}{\bp}) auf, so dass beide wie in \ref{sec:slic}
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Sowohl Vektor als auch Insert lagen innerhalb der erwarteten Größenordnung (\SI{5720}{\bp} bzw. \SI{2691}{\bp}), so dass beide wie in \ref{sec:slic}
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beschrieben in den Ligationsansatz gegeben wurden. Zur Amplifikation des Vektors wurden dann \acs{E. coli} Zellen des Stamms XL1-Blue mit diesem transformiert
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(vgl. \ref{sec:transformation}) und auf Agarplatten angezogen. Mit einer Kolonie-PCR (vgl. \ref{sec:kolonie_pcr}) wurde überprüft, ob der untersuchte Klon
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das korrekte Insert trägt. Das enstsprechende Gelbild ist in Abbildung \ref{abb:kolonie_pcr} dargestellt.
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@ -49,9 +50,9 @@ das korrekte Insert trägt. Das enstsprechende Gelbild ist in Abbildung \ref{abb
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\label{abb:kolonie_pcr}
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\end{figure}
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Von untersuchten 24 Klonen wiesen fünf ein Plasmid auf, das der erwarteten Größe von \SI{8351}{\bp} (Vektor~+~Insert) entspricht. Die fünf positiven Klone
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wurden in \SI{5}{\milli\liter} Kulturrörchen über Nacht angezogen und die Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit nach Herstellerangaben extrahiert.
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Proben der isolierten Plasmid-DNA wurden zur Sequenzierung eingeschickt (StarSEQ GmbH, Mainz). Es konnte gezeigt werden, dass das aus Klon \#22 isolierte
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Von untersuchten 24 Klonen wiesen fünf ein Plasmid auf, welches ein Insert der erwarteten Größe von \SI{2691}{\bp} trägt. Die fünf positiven Klone
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wurden in \SI{5}{\milli\liter} Kulturrörchen über Nacht angezogen und die Plasmid-DNA mit dem \textit{QIAprep Spin Miniprep Kit} nach Herstellerangaben extrahiert.
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Proben der isolierten Plasmid-\acs{DNA} wurden zur Sequenzierung eingeschickt (StarSEQ GmbH, Mainz). Es konnte gezeigt werden, dass das aus Klon \#22 isolierte
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||||
Plasmid im für die \acs{PPDK} kodierenden Bereich keine Mutation trägt. Eine Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk ist in Abbildung \ref{abb:plasmidkarte}
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aufgeführt.
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@ -59,6 +60,325 @@ aufgeführt.
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\centering
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\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/pETEV-16b-ppdk.pdf}
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% pETEV-16b-ppdk.pdf: 611x480 pixel, 72dpi, 21.55x16.93 cm, bb=0 0 611 480
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\caption{Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk}
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\caption[Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk]{Plasmidkarte von pETEV-16b-ppdk. Der für die \acs{PPDK} kodierende Bereich liegt zwischen Position 5392 und 8022.
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\textit{Upstream} befinden sich die kodierenden Sequenzen für die \acs{TEV}-Schnittstelle und den Hexa-Histidin-Tag. Die Plasmidkarte wurde mit
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\textit{PlasMapper} \citep{Dong2004} erstellt.}
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\label{abb:plasmidkarte}
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\end{figure}
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\section{Expressionsstudien}
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\label{sec:Expressionsstudien}
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Die Expressionsstudien (vgl. \ref{sec:expression_ecoli_studien}) zeigten eine deutliche Überexpression der \acs{PPDK} in \acs{E. coli} BL21 (DE3) bei einer Temperatur von \SI{30}{\celsius} und
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||||
einer \acs{IPTG}-Konzentration von \SI{0,1}{\milli\Molar} (vgl. Abbildung \ref{abb:expressionsstudie}). Der direkte Vergleich zwischen den beiden verwendeten
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Expressionsstämmen BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3) (Abbildung \ref{abb:expressionsstudie_klein}) zeigt eine deutlich stärkere Überexpression in BL21 (DE3) bei
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gleichzeitig geringerer IPTG-Konzentration. Eine Expression über Nacht führte zu einer deutlich höheren Proteinausbeute im Vergleich zu einer Zellernte nach
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\SI{4}{\hour}. Die Identifizierung der \acs{PPDK} erfolgte durch einen Westernblot (vgl. \ref{sec:westernblot}).
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_gross.png}
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% Expressionsstudie_19042012_gross.png: 2480x1828 pixel, 300dpi, 21.00x15.48 cm, bb=0 0 595 439
|
||||
\caption[\acs{SDS}-\acs{PAGE} der Expressionsstudien]{\acs{SDS}-\acs{PAGE} der Expressionsstudien. Aufgetragen wurden Proben der beiden Expressionsstämme
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BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3) bei Induktion mit unterschiedlicher \acs{IPTG}-Konzentration und einer Temperatur von jeweils \SI{30}{\celsius}.
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Angegeben sind die Zeitpunkte der Probenentnahme vom Zeitpunkt der Induktion an. Der Größenbereich der \acs{PPDK} ist rot hervorgehoben.}
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\label{abb:expressionsstudie}
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\end{figure}
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
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\centering
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\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_klein.png}
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% Expressionsstudie_19042012_klein.png: 2480x2894 pixel, 241dpi, 26.13x30.49 cm, bb=0 0 741 864
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\caption{}
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||||
\label{abb:expressionsstudie_klein_sds}
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\end{subfigure}
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~
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\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
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\centering
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\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Expressionsstudie_19042012_klein_blot.png}
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||||
% Expressionsstudie_19042012_klein_blot.png: 2480x2894 pixel, 241dpi, 26.13x30.49 cm, bb=0 0 741 864
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||||
\caption{}
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||||
\label{abb:expressionsstudie_klein_blot}
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||||
\end{subfigure}
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\caption[Vergleich der Expression in BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3)]{Vergleich der Expression in BL21 (DE3) und BL21 Gold (DE3). SDS-PAGE (a) und Westernblot (b). Aufgetragen wurden
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Expressionsproben nach \SI{0}{\hour} und \SI{4}{\hour} nach Induktion, sowie über Nacht. Verglichen wurden die Expressionsreihen mit dem jeweils besten
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Expressionsergebnis in BL21 (DE3) bzw. BL21 Gold (DE3). Die Induktion erfolgte mit \SI{0,1}{\milli\Molar} bzw. \SI{1}{\milli\Molar} IPTG.}
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\label{abb:expressionsstudie_klein}
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\end{figure}
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\section{Differentielle Zentrifugation}
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\label{sec:ergebnisse_dz}
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Im Rahmen der Expressionsstudien wurden Zellen von \acs{E. coli} BL21 (DE3) nach \SI{4}{\hour} bzw. nach einer Übernachtexpression geerntet, aufgeschlossen
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||||
und einer differentiellen Zentrifugation unterzogen (vgl. \ref{sec:differentielle_zentrifugation}). Die Proben wurden mittels eines Westernblots ausgewertet
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||||
(Abbildung \ref{abb:dz}). Hierbei zeigte sich, dass der überwiegende Anteil der \acs{PPDK} in den Überstandsfraktionen lokalisiert und somit löslich ist.
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||||
Nur ein geringer Anteil befindet sich in den Pellets nach der Zentrifugation.
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
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\centering
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\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/03052012_4h_2min.png}
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% 03052012_4h_2min.png: 2480x2254 pixel, 300dpi, 21.00x19.08 cm, bb=0 0 595 541
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\caption{}
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\label{abb:dz_4h}
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||||
\end{subfigure}
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~
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\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
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\centering
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\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/03052012_üN_2min.png}
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% 03052012_üN_2min.png: 2480x2141 pixel, 300dpi, 21.00x18.13 cm, bb=0 0 595 514
|
||||
\caption{}
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||||
\label{abb:dz_on}
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||||
\end{subfigure}
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||||
\caption[Westernblots der differentiellen Zentrifugation]{Westernblots der differentiellen Zentrifugation. Die Zellen wurden nach \SI{4}{\hour} (a) bzw. nach
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||||
einer Übernachtexpression (b) geerntet. Aufgetragen wurden \SI{3}{\micro\liter} Marker (M), Probe nach Zellaufschluss (A), sowie Pellets (P) und Überstände (Ü) der
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||||
Zentrifugationsschritte (jeweils \SI{10}{\micro\liter}).}
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\label{abb:dz}
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\end{figure}
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\section{Native Reinigung der \acs{PPDK}}
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\label{sec:ergebnisse_reinigung}
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Die Reinigung der \acs{PPDK} erfolgte wie in \ref{sec:affinitaetschromatographie} beschrieben. Im Verlauf der Reinigung konnten vier Proteinfraktionen bei Elution
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mit \SIlist{50;150;200;250}{\milli\Molar} Imidazol identifiziert werden (vgl. Abbildung \ref{abb:chromatogramm_aff}). In einer nachfolgend durchgeführten
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||||
\acs{SDS}-\acs{PAGE} mit Westernblot zeigte sich, dass drei Fraktionen (\SIlist{150;200;250}{\milli\Molar}) \acs{PPDK} in hoher Reinheit enthielten.
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\includegraphics[width=0.9\textwidth,keepaspectratio=true]{img/ergebnisse/aekta/20062012.eps}
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\caption[Chromatogramm der \acs{PPDK}-Reinigung mittels \acs{IMAC}]{Chromatogramm der \acs{PPDK}-Reinigung mittels \acs{IMAC}. Dargestellt sind die Absorption bei
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\SI{280}{\nano\meter} (blau) und die Imidazolkonzentration (rot). Die gesammelten \acs{PPDK}-Fraktionen sind durch Pfeile markiert.}
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\label{abb:chromatogramm_aff}
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\end{figure}
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Die gesammelte PPDK-Fraktionen bei Elution mit \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol ließ sich bis auf \SI{37,54(134)}{\milli\gram\per\milli\liter} konzentrieren.
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||||
In der Expression konnten aus \SI{2}{\liter} Kultur \SI{20}{\gram} Zellen geerntet werden. Da im Zuge der Reinigung \SI{4}{\gram} Zellen aufgeschlossen wurden, ergibt sich eine Ausbeute von etwa
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\SI{47}{\milli\gram\per\liter}~Kultur (vgl. Tabelle \ref{tab:ausbeute}).
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\begin{table}[htb]
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\centering
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\caption[\acs{PPDK}-Konzentration und Ausbeute nach Reinigung]{\acs{PPDK}-Konzentration und Ausbeute nach Reinigung. Die Konzentrationen beziehen sich auf den erreichten
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Wert nach Einengen der fraglichen Fraktionen auf ein Volumen von \SI{500}{\micro\liter}.}
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||||
\label{tab:ausbeute}
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||||
\begin{tabular}{lS[seperr,table-format=2.3(3)]S[seperr,table-format=2.3(3)]S[seperr,table-format=2.3(3)]}
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\toprule
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\textbf{Fraktion} & \multicolumn{1}{c}{\textbf{c(PPDK) [\si{\milli\gram\per\milli\liter}]}} & \multicolumn{1}{c}{\textbf{m(PPDK) [\si{\milli\gram}]}} & \multicolumn{1}{c}{$\frac{\textbf{m(PPDK)}}{\textbf{V(Kultur)}}$ \textbf{[\si{\milli\gram\per\liter}]}}\\
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\midrule
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1 (\SI{150}{\milli\Molar}) & 8,078(1812) & 4,039(906) & 10,098(2265)\\
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||||
2 (\SI{200}{\milli\Molar}) & 48,935(2556) & 24,466(1278) & 61,165(3195)\\
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||||
3 (\SI{250}{\milli\Molar}) & 37,536(1334) & 18,768(667) & 46,920(1693)\\
|
||||
\bottomrule
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||||
\end{tabular}
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||||
\end{table}
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
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\centering
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\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Reinigung_02072012.png}
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% Reinigung_02072012.png: 2480x2338 pixel, 300dpi, 21.00x19.80 cm, bb=0 0 595 561
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||||
\caption{}
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||||
\label{abb:reinigung_sds_a}
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||||
\end{subfigure}
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%
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~
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%
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\begin{subfigure}[b]{0.4\textwidth}
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\centering
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\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/sds_gele/Reinigung_02072012_blot.png}
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||||
% Reinigung_02072012.png: 2480x2338 pixel, 300dpi, 21.00x19.80 cm, bb=0 0 595 561
|
||||
\caption{}
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||||
\label{abb:reinigung_sds_b}
|
||||
\end{subfigure}
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||||
\caption[\acs{SDS}-\acs{PAGE} und Westernblot der nativen Reinigung]{\acs{SDS}-\acs{PAGE} (a) und Westernblot (b) der nativen Reinigung. Aufgetragen wurden \SI{3}{\micro\liter} Marker (M), \SI{1}{\micro\liter}
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||||
der Proben des Zelllysates (A), sowie der Zentrifugationen bei \SI{10000}{\xg} (10kÜ) bzw \SI{100000}{\xg} und \SI{10}{\micro\liter} des Durchflusses (D) und nachfolgenden Elutionsfraktionen.
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||||
Die \acs{PPDK}-Banden sind rot hervorgehoben (MW: \SI{98}{\kilo\dalton})}
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\label{abb:reinigung_sds}
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||||
\end{figure}
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||||
%
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||||
Zur Bestimmung der Dispersität der gereinigten \acs{PPDK} wurden Proben aller drei Fraktionen mittels einer Größenausschlusschromatographie (vgl. \ref{sec:groessenausschluss}) analysiert.
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||||
Hierbei zeigte sich, dass lediglich die mit \SI{250}{\milli\Molar} Imidazol eluierte Fraktion monodispers ist, während die mit \SIlist{150;200}{\milli\Molar} eluierten
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||||
\acs{PPDK}-Fraktionen einen diversen Oligomerisierungsgrad aufwiesen (vgl. Abbildung \ref{abb:chromatogramm_gefi}).
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||||
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\begin{figure}[htb]
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\centering
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\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/aekta/11072012.eps}
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% 11072012.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=5 4 461 375
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||||
\caption[Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie]{Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie. Die Kurvenverläufe wurden auf die jeweilige Konzentration normalisiert. Fraktion 3 zeigt ein monodisperses Profil,
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während die \acs{PPDK} in den Fraktionen 1 und 2 in verschiedenen Oligomerisierungszuständen vorliegt. Vertikale Linien markieren die Position der \textit{Peaks}.}
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\label{abb:chromatogramm_gefi}
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||||
\end{figure}
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||||
\clearpage
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\section{\acs{CD}-Spektroskopie}
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\label{sec:ergebnisse_cd}
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Das \acs{CD}-Spektrum wurde wie in \ref{sec:cd_spektroskopie} beschrieben aufgenommen. Abbildung \ref{abb:cd_spektrum} zeigt das Spektrum nach Abzug des Pufferspektrums. Deutlich zu erkennen ist
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||||
ein negativer Cotton-Effekt im Bereich um \SI{210}{\nano\meter}, welcher auf \textalpha-helikale Strukturen hindeutet.
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Anhand des experimentellen Spektrums wurde eine Sekundärstrukturanalyse mit den Programmen SELCON3 \citep{Sreerama1993}, CONTINLL \citep{Provencher1981}, CDSSTR \citep{Johnson1999} und K2D3 \citep{Louis-Jeune2011} durchgeführt.
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||||
Die daraus resultierenden, vorhergesagten Spektren sind ebenfalls in Abbildung \ref{abb:cd_spektrum} dargestellt. Alle verwendeten Algorithmen sagen das Spektrum qualitativ
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korrekt vorher, die geringsten Abweichungen vom experimentellen Spektrum ergeben sich für CONTINLL und CDSSTR. Für die \acs{PPDK} werden in allen Fällen hohe \textalpha"=helikale
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Strukturanteile vorhergesagt, im Fall von CONTINLL jedoch nur ein sehr geringer Anteil an \textbeta"=Strands (vgl. Tabelle \ref{tab:cd}). Die \textit{ab initio} Vorhersage mit SOPMA,
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||||
sowie die Ergebnisse von K2D3 und CDSSTR sind weitestgehend deckungsgleich mit den Strukturanteilen der PPDK aus \textit{Zea mays} (Tabelle \ref{tab:cd}).
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||||
\begin{figure}[htb]
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||||
\centering
|
||||
\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/cd/cd.eps}
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||||
% cd.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=2 4 468 375
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||||
\caption[\acs{CD}-Spektrum von gereinigter PPDK]{\acs{CD}-Spektrum von gereinigter PPDK. Die \acs{PPDK} lag in einer Konzentration von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter} in \SI{50}{\milli\Molar} Kaliumphosphat"=Puffer mit
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||||
\SI{10}{\milli\Molar} Magnesiumsulfat vor. Es wurden 15 Spektren mit einer Auflösung von \SI{1}{\nano\meter} akkumuliert. Im Bereich um \SI{210}{\nano\meter} zeigt sich ein negativer
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||||
Cotton-Effekt, welcher charakteristisch für \textalpha-helikale Strukturanteile ist. Farbig dargestellt sind die mit unterschiedlichen Programmen vorhergesagten Spektren.}
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||||
\label{abb:cd_spektrum}
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||||
\end{figure}
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||||
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||||
\begin{table}[htb]
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||||
\caption[Vorhersage der Sekundärstrukturanteile]{Vorhersage der Sekundärstrukturanteile. Aufgeführt sind die vorhergesagten Strukturelemente anhand des \acs{CD}-Spektrums. Zum Vergleich dienen die Ergebnisse der sequenzbasierten \textit{ab initio} Vorhersage (SOPMA),
|
||||
sowie die Sekundärstrukturanteile aus der Kristallstruktur der \acs{PPDK} aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBG).}
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||||
\label{tab:cd}
|
||||
\begin{tabular}{lrrrr}
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||||
\toprule
|
||||
\textbf{Algorithmus} & \textbf{\textalpha-Helix [\si{\percent}]} & \textbf{\textbeta-Strand [\si{\percent}]} & \textbf{\textbeta-Turn [\si{\percent}]} & \textbf{Coil [\si{\percent}]} \\
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||||
\midrule
|
||||
K2D3 & 56 & 18 & & \\
|
||||
SELCON3 & 56 & 5 & 17 & 22 \\
|
||||
CONTINLL & 68 & 1 & 14 & 17 \\
|
||||
CDSSTR & 51 & 20 & 15 & 15 \\
|
||||
\midrule
|
||||
SOPMA & 47 & 17 & 9 & 27 \\
|
||||
\midrule
|
||||
PPDK (\textit{Zea mays}) & 47 & 16 & & \\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabular}
|
||||
\end{table}
|
||||
|
||||
\section{Aktivitätsassay}
|
||||
\label{sec:ergebnisse_aktivitaetsassay}
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||||
Um die Aktivität der gereinigten PPDK zu quantifizieren, wurden zunächst die beiden Fraktionen mit der höchsten \acs{PPDK}-Konzentration -- Fraktion 2 und
|
||||
Fraktion 3 (\SIlist{200;250}{\milli\Molar} Imidazol) -- untersucht (vgl. \ref{sec:aktivitaetsassay}). Hierbei zeigte sich im Vergleich zur Negativkontrolle,
|
||||
dass in beiden Fraktionen eine Aktivität zu verzeichnen ist (siehe Abbildung \ref{abb:aktivitaet}). Da hinsichtlich zukünftiger Kristallisationsexperimente
|
||||
in erster Linie die monodispers vorliegende Fraktion 3 von Interesse ist, wurde von dieser Fraktion eine vollständige Reaktionskinetik aufgenommen. Hierbei ergaben
|
||||
sich durch Anpassen einer Sättigungsfunktion durch nichtlineare Regression an die Michaelis"=Menten"=Gleichung \eqref{eq:mm} für \acs{ATP} und Pyruvat ein \ce{K_M} von
|
||||
\SI[seperr]{50(9)}{\micro\Molar} bzw. \SI[seperr]{270(44)}{\micro\Molar}, sowie ein \ce{V_{max}} von \SI[seperr]{0,095(5)}{\milli\Molar\per\minute} (ATP)
|
||||
\SI[seperr]{0,093(5)}{\milli\Molar\per\minute} (Pyruvat). Auffällig ist die bei höheren \acs{ATP}-Konzentrationen wieder abfallende Reaktionsgeschwindigkeit (vgl. Abbildung \ref{abb:kinetik}).
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||||
%
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||||
\begin{align}
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||||
\label{eq:mm}
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||||
v &= \frac{V_\text{max} \cdot [S]}{K_m + [S]}
|
||||
\end{align}
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||||
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||||
Die Wechselzahl \ce{k_{cat}} wurde anhand von Gleichung \eqref{eq:kcat} aus \ce{V_{max}} und der PPDK-Konzentration von \SI[seperr]{0,38(2)}{\milli\Molar} mit
|
||||
\SI[seperr]{1,63(9)}{\per\second} bestimmt. Die spezifische Aktivität der \acs{PPDK} beträgt \SI[seperr]{0,99(9)}{\Unit\per\milli\gram} und konnte ebenfalls unter Berücksichtigung der
|
||||
Proteinkonzentration mittels Gleichung \ref{eq:spez_akt} berechnet werden.
|
||||
%
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||||
\begin{align}
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||||
\label{eq:kcat}
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||||
k_\text{cat} &= \frac{V_\text{max}}{[E_0]}
|
||||
\end{align}
|
||||
|
||||
Die katalytische Effizient {\ce{k_{cat}}/\ce{K_M}} beträgt \SI[seperr]{32,60(936)}{\milli\Molar\second} (ATP) bzw.
|
||||
\SI[seperr]{6,04(154)}{\milli\Molar\second} (Pyruvat). Eine Auflistung der kinetischen Parameter ist in Tabelle \ref{tab:kinetische_parameter} zu finden.
|
||||
%
|
||||
\begin{align}
|
||||
\label{eq:spez_akt}
|
||||
\text{spez. Aktivität \si{\Unit\per\milli\gram}} &= \frac{V_\text{max}~[\si{\micro\Molar\per\minute}] \cdot V(\text{Ansatz})~[\si{\liter}]}{m(\text{Protein})~[\si{\milli\gram}]}
|
||||
\end{align}
|
||||
|
||||
\begin{table}[htb]
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||||
\centering
|
||||
\caption[Kinetische Parameter der \acs{PPDK}]{Kinetische Parameter der \acs{PPDK}.}
|
||||
\label{tab:kinetische_parameter}
|
||||
\begin{tabular}{lS[seperr, table-format = 3.3(2)]s}
|
||||
\toprule
|
||||
\textbf{Parameter} & \textbf{Wert} & \textbf{Einheit}\\
|
||||
\midrule
|
||||
\ce{V_{max}} & 0,093(5) & \milli\Molar\per\minute \\
|
||||
\ce{k_{cat}} & 1,63(9) & \per\second \\
|
||||
\midrule
|
||||
\ce{K_m} (ATP) & 50(9) & \micro\Molar \\
|
||||
\ce{K_m} (Pyruvat) & 270(44) & \micro\Molar \\
|
||||
\midrule
|
||||
\ce{k_{cat}}/\ce{K_M} (ATP) & 32,60(936)& \milli\Molar\second \\
|
||||
\ce{k_{cat}}/\ce{K_M} (Pyruvat) & 6,04(154) & \milli\Molar\second \\
|
||||
\midrule
|
||||
spez. Aktivität & 0,99(9) & \Unit\per\milli\gram \\
|
||||
\bottomrule
|
||||
\end{tabular}
|
||||
\end{table}
|
||||
|
||||
|
||||
\begin{figure}[htb]
|
||||
\centering
|
||||
\includegraphics[width=0.7\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/aktivitaet.eps}
|
||||
% aktivitaet.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=6 4 466 375
|
||||
\caption[Aktivität der gereinigten PPDK]{Aktivität der gereinigten PPDK. Die Absorption bei \SI{340}{\nano\meter} wurde über einen Zeitraum von \SI{80}{\second}
|
||||
aufgenommen und auf die jeweilige PPDK-Konzentration, sowie das absolute Absorptionsmaximum normiert. Die Kontrolle enthielt anstelle der PPDK ein identisches
|
||||
Volumen Puffer. Die beiden PPDK-Fraktionen weisen eine deutliche Absorptionsabnahme auf, während die Absorption der Kontrolle nahezu unverändert bleibt.}
|
||||
\label{abb:aktivitaet}
|
||||
\end{figure}
|
||||
|
||||
\begin{figure}[htb]
|
||||
\centering
|
||||
\begin{subfigure}[b]{0.45\textwidth}
|
||||
\centering
|
||||
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/atp.eps}
|
||||
% atp.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=2 4 467 375
|
||||
\caption{}
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||||
\label{abb:kinetik_atp}
|
||||
\end{subfigure}
|
||||
%
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||||
~
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||||
%
|
||||
\begin{subfigure}[b]{0.45\textwidth}
|
||||
\centering
|
||||
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/kinetik/pyruvat.eps}
|
||||
% pyruvat.eps: 0x0 pixel, 300dpi, 0.00x0.00 cm, bb=2 3 467 375
|
||||
\caption{}
|
||||
\label{abb:kinetik_pyruvat}
|
||||
\end{subfigure}
|
||||
\caption[Reaktionskinetik der \acs{PPDK}]{Reaktionskinetik der \acs{PPDK} mit \acs{ATP} (a) und Pyruvat (b) als Substrat. Der inhibierende Effekt von \acs{ATP} auf
|
||||
die im gekoppelten Enzymassay eingesetzte \acs{MDH} ist in (a) ersichtlich. Die Ordinatenachse ist der besseren Übersichtlichkeit wegen logarithmisch skaliert.}
|
||||
\label{abb:kinetik}
|
||||
\end{figure}
|
||||
|
||||
\clearpage
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||||
|
||||
\section{Homologiemodelle}
|
||||
\label{sec:ergebnisse_homologemodell}
|
||||
Die erzeugten Homologiemodelle (vgl. \ref{sec:erstellung_homologiemodell}) der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} zeigen eine gute Übereinstimmung mit
|
||||
den zu Grunde liegenden Templat-Strukturen: \SI{0,708}{\angstrom} für das auf der Struktur aus \acs{C. symbiosum} und \SI{0,705}{\angstrom} für das auf der Struktur aus
|
||||
\textit{Zea mays} basierende Modell. Die Sequenzidentität zur zwischen \acs{F. trinervia} und \textit{Zea mays} beträgt \SI{79}{\percent}, zwischen \acs{F. trinervia} und
|
||||
\acs{C. symbiosum} \SI{55}{\percent}. Das jeweils beste Modell wurde anhand des zDOPE Wertes, sowie der Ergebnisse der PROCHECK-Analyse ausgewählt. Im Ramachandran-Plot
|
||||
zeigt keines der beiden ausgewählten Modelle eine Kombination von ψ- und φ-Winkel, die nicht in einem der erlaubten Bereiche liegt (vgl. Abbildungen \ref{abb:ramachandran_Zm}
|
||||
und \ref{abb:ramachandran_Cs}).
|
||||
|
||||
Anhand der Modelle wurde eine Visualisierung des \textit{Domain-Swiveling} Mechanismus für die \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} (Abbildung \ref{abb:overlay_homologiemodell}), sowie
|
||||
der \acs{PEP}-Bindestelle (Abbildung \ref{abb:substratbindetasche}) erstellt. Es zeigt sich eine deutliche Torsion der zentralen Phospo-Histidindomäne und des katalytischen
|
||||
His458.
|
||||
\begin{figure}[htb]
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||||
\centering
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||||
\includegraphics[width=\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/swiveling_domain2.png}
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||||
% swiveling_domain2.png: 2480x976 pixel, 119dpi, 53.13x20.91 cm, bb=0 0 1506 593
|
||||
\caption[Homologiemodelle der \acs{PPDK}]{Homologiemodelle der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}. (A) zeigt die \acs{PEP} gebundene Konformation basierend auf der Struktur aus
|
||||
\textit{Zea mays}, (B) das auf \acs{C. symbiosum} basierende Modell. Beide Modelle stellen die jeweiligen Extremkonformationen des \textit{Swiveling-domain} Mechanismus dar. Das
|
||||
an der Übertragung der Phosphatgruppe beteiligte His458 ist als Stabmodell rot eingefärbt und durch einen schwarzen Pfeil markiert. Die einzelnen Domänen der \acs{PPDK} sind ebenfalls
|
||||
farblich hervorgehoben: Nukleotidbindedomäne (grün), Pyruvat/PEP-Bindedomäne (blau), Phosphohistidin-Domäne (gelb), Linker-Peptide (magenta und rot).}
|
||||
\label{abb:overlay_homologiemodell}
|
||||
\end{figure}
|
||||
|
||||
In der Darstellung der modellierten Substratbindestelle sind die für die Koordination von \acs{PEP} wichtigen Reste Arg562, Arg619, Arg669, Glu748, Asp772 und
|
||||
Asn771 sichtbar. Ebenfalls erkennbar ist das als Protonen-Donor fungierende Cys834. Die genannten Reste befinden sich in hoch konservierten Bereichen (siehe Abbildung \ref{abb:ma}).
|
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%
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||||
\begin{figure}[htb]
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||||
\centering
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||||
\includegraphics[width=0.8\textwidth,keepaspectratio=true]{./img/ergebnisse/homologiemodell/substratbindung.png}
|
||||
% substratbindung.png: 2480x1681 pixel, 90dpi, 70.00x47.45 cm, bb=0 0 1984 1345
|
||||
\caption[Substratbindetasche für \acs{PEP}]{Substratbindetasche für \acs{PEP}. Die Ansicht zeigt die Bindestelle für \acs{PEP} im
|
||||
Homologiemodell der \acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia}. Seitenketten in räumlicher Nähe zum Substrat sind als Linienmodell dargestellt und benannt. Die
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||||
gestrichelten Linien zeigen mögliche polare Wechselwirkungen mit einer Länge von maximal \SI{3,5}{\angstrom} an.}
|
||||
\label{abb:substratbindetasche}
|
||||
\end{figure}
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||||
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||||
|
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|
@ -168,10 +168,10 @@
|
|||
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||||
\subsection{Plasmide}
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\label{sec:plasmide}
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||||
Das tatsächlich eingesetzte Plasmid trägt die Bezeichnung pETEV-16b und ist ein Derivat des pET-16b-Vektors,
|
||||
das zusätzlich zwischen der für den Hexa-Histidin-Tag kodierenden Sequenz und dem Zielgen eine für die Schnittstelle
|
||||
der \acs{TEV}-Protease kodierende Sequenz beinhaltet.
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||||
%
|
||||
% Das tatsächlich eingesetzte Plasmid trägt die Bezeichnung pETEV-16b und ist ein Derivat des pET-16b-Vektors,
|
||||
% das zusätzlich zwischen der für den Hexa-Histidin-Tag kodierenden Sequenz und dem Zielgen eine für die Schnittstelle
|
||||
% der \acs{TEV}-Protease kodierende Sequenz beinhaltet.
|
||||
%
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||||
\begin{samepage}
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||||
\begin{tabularx}{\textwidth}{p{0.25\textwidth}p{0.3\textwidth}X}
|
||||
\toprule
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||||
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|
@ -423,7 +423,8 @@ vervielfacht werden.
|
|||
\label{sec:inserts_slic}
|
||||
\begin{samepage}
|
||||
Die Synthese von Inserts für eine \ac{SLIC} (vgl.~\ref{sec:slic}) wurde mittels einer \ac{PCR} nach untenstehendem
|
||||
Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz.
|
||||
Ansatz durchgeführt. Als Primer kamen die in \ref{sec:synthetische_oligonukleotide} aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz. Diese
|
||||
wurden so gewählt, dass jeweils \SI{30}{\bp} zum Zielvektor und \SI{20}{\bp} zum Zielgen homolog sind.
|
||||
\begin{description}
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\item[\ac{PCR}-Ansatz] \hfill \\
|
||||
\SI{1}{\micro\liter} DNA (Templat) \\
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||||
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@ -518,7 +519,7 @@ Zur Generierung der 5'-Überhänge wurden \SI{1000}{\nano\gram} Vektor- bzw. Ins
|
|||
ad \SI{35}{\micro\liter} \acs{ddH2O}
|
||||
\end{description}
|
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%
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||||
Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4-\acs{DNA}-Polymerase von
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||||
Ziel war ein Dau von etwa \SI{30}{\bp} Länge. Aus der Exonukleaseaktivität der T4"=\acs{DNA}"=Polymerase von
|
||||
\SI{10}{\bp\per\minute} bei \SI{22}{\celsius} ergab sich eine Inkubationsdauer von \SI{40}{\minute}. Die Reaktion wurde
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||||
durch Zugabe von $\frac{1}{10}$ des Ansatzvolumens \SI{10}{\milli\Molar} \ac{dCTP} gestoppt.
|
||||
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|
@ -611,7 +612,8 @@ einem Proteingemisch isolieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden HisTrap$^\text{\t
|
|||
eingesetzt. Als Säulenmaterial dient quervernetzte Agarose an welche \acf{IDA} immobilisiert ist. \ce{Ni2+}-Ionen werden von \acs{IDA} dreifach koordinativ
|
||||
komplexiert, so dass drei Koordinationsstellen für die Interaktion Poly-Histidin-markierter Proteine mit den immobilisierten \ce{Ni2+}-Ionen zur
|
||||
Verfügung stehen. Die Elution der spezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgt über die Zugabe von Imidazol, welches als Strukturanalogon zu
|
||||
Histidin in der Lage ist, dieses kompetitiv aus der Bindung mit \ce{Ni2+} zu verdrängen.
|
||||
Histidin in der Lage ist, dieses kompetitiv aus der Bindung mit \ce{Ni2+} zu verdrängen. Das nachfolgend beschriebene Reinigungsprotokoll wurde nach \citet{Nakanishi2003,Chastain1996}
|
||||
adaptiert.
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||||
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||||
Die wie in \ref{sec:zellaufschluss} beschrieben aufgeschlossenen Zellen wurden zunächst bei \SI{10000}{\xg} und \SI{15}{\celsius} für \SI{30}{\minute}
|
||||
zentrifugiert um Zelltrümmer und \textit{Inclusion-Bodies} zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend für \SI{1}{\hour} bei \SI{100000}{\xg} und \SI{15}{\celsius}
|
||||
|
|
@ -716,16 +718,25 @@ Pipettierschema für drei kleine Gele (\SI{9}{\centi\meter}~\texttimes~\SI{10}{\
|
|||
\begin{table}[htb]
|
||||
\centering
|
||||
\caption{Pipettierschema für SDS-Gele}
|
||||
\begin{tabular}{lll}
|
||||
\begin{tabular}{lSsSs}
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||||
\toprule
|
||||
& {\textbf{Trenngel}} & {\textbf{Sammelgel}}\\
|
||||
& \multicolumn{2}{c}{\textbf{Trenngel}} & \multicolumn{2}{c}{\textbf{Sammelgel}}\\
|
||||
\midrule
|
||||
\acs{AA/BAA} 30 & \SI{10,9}{\milli\liter} & \SI{2}{\milli\liter}\\
|
||||
Trenn-/Sammelgelpuffer & \SI{13,2}{\milli\liter} & \SI{2,5}{\milli\liter}\\
|
||||
\acs{ddH2O} & \SI{8,6}{\milli\liter} & \SI{7,4}{\milli\liter}\\
|
||||
\acs{TEMED} & \SI{16,5}{\micro\liter} & \SI{12,3}{\micro\liter}\\
|
||||
\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & \SI{112,2}{\micro\liter} & \SI{129}{\micro\liter}\\
|
||||
\acs{AA/BAA} 30 & 10,9 & \milli\liter & 2 & \milli\liter \\
|
||||
Trenn-/Sammelgelpuffer & 13,2 & \milli\liter & 2,5 & \milli\liter \\
|
||||
\acs{ddH2O} & 8,6 & \milli\liter & 7,4 & \milli\liter \\
|
||||
\acs{TEMED} & 16,5 & \micro\liter & 12,3 & \micro\liter \\
|
||||
\acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & 112,2 & \micro\liter & 129 & \micro\liter \\
|
||||
\bottomrule
|
||||
% \toprule
|
||||
% & {\textbf{Trenngel}} & & {\textbf{Sammelgel}} & \\
|
||||
% \midrule
|
||||
% \acs{AA/BAA} 30 & 10,9 & \milli\liter & 2 & \milli\liter}\\
|
||||
% Trenn-/Sammelgelpuffer & 13,2 & \milli\liter & 2,5 & \milli\liter}\\
|
||||
% \acs{ddH2O} & 8,6 & \milli\liter & 7,4 & \milli\liter}\\
|
||||
% \acs{TEMED} & 16,5 & \micro\liter & 12,3 & \micro\liter}\\
|
||||
% \acs{APS} \SI{10}{\percent} (w/v) & 112,2 & \micro\liter & 129 & \micro\liter}\\
|
||||
% \bottomrule
|
||||
\end{tabular}
|
||||
\label{tab:pipettierschema_sds_page}
|
||||
\end{table}
|
||||
|
|
@ -794,13 +805,13 @@ Die \ac{CD}-Spektroskopie kann für die Analyse von Proteinsekundärstrukturen e
|
|||
\SIrange{160}{250}{\nano\meter} aufgenommen. Man macht sich dabei zu Nutze, dass in diesem Bereich die n~\textrightarrow~\textpi$^*$ bzw.
|
||||
\textpi~\textrightarrow~\textpi$^*$-Übergänge der Peptidbindung liegen. Durch ihre Chiralität reagiert das \ac{CD}-Spektrum eines Peptids sehr
|
||||
empfindlich auf Änderungen der Sekundärstruktur \citep{Greenfield2007}. Die Messungen erfolgten in CD-Puffer bei einer Proteinkonzentration
|
||||
von \SI{0,2}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und
|
||||
von \SI{0,1}{\milli\gram\per\milli\liter}. Von den Rohdaten wurde das Pufferspektrum abgezogen und unter Berücksichtigung von Konzentration und
|
||||
Molekulargewicht in molaren \ac{CD} (\textDelta\textepsilon) umgerechnet.
|
||||
|
||||
\subsection{Aktivitätsassay}
|
||||
\label{sec:aktivitaetsassay}
|
||||
Um die Aktivität der gereinigten \acs{PPDK} zu bestimmten, wurde ein Aktivitätsassay \citep{Salahas1990} durchgeführt. Hierbei wurde \ac{PEP}-Bildung
|
||||
in einem gekoppelten Enzymassay über den \acs{NADH}-Verbrauch verfolgt. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist in diesem Fall die Umsetzung
|
||||
in einem gekoppelten Enzymassay über den \acs{NADH}"=Verbrauch verfolgt. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist in diesem Fall die Umsetzung
|
||||
von Pyruvat, anorganischem Phosphat und \acs{ATP} zu \acl{PEP}, \acs{AMP} und Pyrophosphat \eqref{eq:aktivitaet_1}. Nachfolgend wird \acl{PEP} durch
|
||||
die \acl{PEPCase} über eine \textbeta-Carboxylierung mit Hydrogencarbonat zu Oxalacetat umgesetzt \eqref{eq:aktivitaet_2}. Letzteres wird durch eine
|
||||
NAD-abhängige Malatdehydrogenase zu Malat reduziert \eqref{eq:aktivitaet_3}.
|
||||
|
|
@ -816,7 +827,7 @@ NAD-abhängige Malatdehydrogenase zu Malat reduziert \eqref{eq:aktivitaet_3}.
|
|||
}
|
||||
\end{align}
|
||||
%
|
||||
Der \acs{NADH}-Verbrauch kann photometrisch über die Abnahme der \acs{NADH}-spezifischen Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} verfolgt werden. Da der
|
||||
Der \acs{NADH}-Verbrauch kann photometrisch über die Abnahme der \acs{NADH}"=spezifischen Extinktion bei \SI{340}{\nano\meter} verfolgt werden. Da der
|
||||
Verbrauch eines \acs{NADH}-Moleküls gleichbedeutend ist mit der Bildung eines \acl{PEP}-Moleküls durch die \acs{PPDK}, kann aus dem Verbrauch an
|
||||
\acs{NADH} direkt auf die Bildungsrate von \acl{PEP} und somit auf die Aktivität der \acs{PPDK} geschlossen werden.
|
||||
|
||||
|
|
@ -842,8 +853,9 @@ $\epsilon_{340} = \SI{6,3e3}{\per\Molar\per\centi\meter}$ \citep{McComb1976} und
|
|||
|
||||
\subsection{Analyse von \ac{CD}-Spektren}
|
||||
\label{sec:analyse_cd_spektren}
|
||||
Die Analyse der aufgenommenen CD-Spektrem (siehe \ref{sec:cd_spektroskopie}) erfolgte mit dem Programmpaket \textit{CDPro} \citep{Sreerama2000}, sowie
|
||||
dem Programm \textit{K2D3} \citep{Louis-Jeune2011}. Die Analyse erfolgte jeweils in einem Wellenlängenbereich von \SIrange{190}{240}{\nano\meter}.
|
||||
Aufgenommene CD-Spektrem (siehe \ref{sec:cd_spektroskopie}) wurden mit dem Programmpaket \textit{CDPro} \citep{Sreerama2000}, sowie
|
||||
dem Programm \textit{K2D3} \citep{Louis-Jeune2011} untersucht. Die Analyse erfolgte jeweils in einem Wellenlängenbereich von \SIrange{190}{240}{\nano\meter}.
|
||||
Für das Programmpaket \textit{CDPro} wurde die Datenbank SMP56 mit 43 löslichen und 13 Membranproteinen als Grundlage der Vorhersage verwendet.
|
||||
Die berechneten Sekundärstrukturanteile wurden dann mit mit einer \textit{ab initio} Vorhersage, welche mit \acs{SOPMA} \citep{Geourjon1995a}
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berechnet wurde verglichen. Zusätzlich wurden die Sekundärstrukturanteile aus der bereits bekannten \acs{PPDK}-Struktur aus \textit{Zea mays}
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herangezogen.
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@ -859,8 +871,9 @@ Zur Visualisierung der wahrscheinlichen dreidimensionalen Struktur der \acs{PPDK
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wurden Homologiemodelle erstellt. Diese basieren auf den aus \textit{Zea mays} (PDB: 1VBG/1VBH) und \textit{Chlostridium symbiosum} (PDB: 1KBL) bekannten
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Extremkonformationen des putativen \textit{Domain-swiveling}-Mechanismus.
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Die Homologiemodelle wurden mit dem Programm \textit{Modeller} \citep{Sali1993a} aus den jeweiligen Templaten und der Primärstruktur der
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Jeweils fünf Homologiemodelle wurden mit dem Programm \textit{Modeller} \citep{Sali1993a} aus den jeweiligen Templaten und der Primärstruktur der
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\acs{PPDK} aus \acs{F. trinervia} \citep{Rosche1990} generiert. Im Falle des von \textit{Zea mays} abgeleiteten Modells wurde als Vorlage die Pyruvat gebundene Struktur
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verwendet (PDB: 1VBH). Lücken in der dreidimensionalen Struktur wurden anhand der ungebundenen Struktur (PDB: 1VBG) ergänzt.
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verwendet (PDB: 1VBH). Lücken in der dreidimensionalen Struktur wurden anhand der ungebundenen Struktur (PDB: 1VBG) ergänzt. Um die Substratbindetasche möglichst
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exakt zu nachzubilden, wurde das in der Kristallstruktur 1VBH vorhandene \acs{PEP}-Molekül, sowie das \ce{Mg2+}-Ion beim Modellieren berücksichtigt.
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Die Evaluation der erstellten Modelle erfolgte mit dem Programmpaket \textit{PROCHECK} \citep{Laskowski1993,Laskowski1996}.
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@ -1,2 +1 @@
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\addchap{Zusammenfassung}
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<Zusammenfassung>
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\addchap{Zusammenfassung}
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